Name: Tests basés sur la chimiluminescence pour la détection de l’oxyde nitrique et de ses dérivés à partir de l’autoxidation et des composés nitrosés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Découvrez la détection de l'oxyde nitrique par chimiluminescence pour la biochimie et la pharmacologie. Cette méthode sensible mesure les métabolites dans les échantillons biologiques sans personnel spécialisé sur site.

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Les protocoles rapportés dans ce manuscrit ont été rendus possibles grâce aux contributions accumulées par d’anciens boursiers du laboratoire de recherche en anesthésie en soins intensifs du Dr Warren Zapol, département d’anesthésie du Massachusetts General Hospital. Nous reconnaissons la contribution des Drs Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, Chong Lei, Yasuko Nagasaka, Ester Spagnolli et Emanuele Rezoagli.

L.B. reçoit un soutien salarial de K23 HL128882/NHLBI NIH en tant que chercheur principal pour ses travaux sur l’hémolyse et l’oxyde nitrique. LB reçoit des subventions de « Fast Grants for COVID-19 research » au Mercatus Center de l’Université George Mason et d’iNO Therapeutics LLC. B.Y. est soutenu par des subventions d’un NHLBI/#R21HL130956 et du DOD/The Geneva Foundation (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244). B.Y. a reçu des brevets à MGH sur la production électrique d’oxyde nitrique.
L.B. et B.Y. ont déposé une demande de brevet pour l’administration de NO dans la maladie COVID-19 numéro de demande PCT: PCT/US2021/036269 déposé le 7 juin 2021. RWC reçoit un soutien salarial d’Unitaid en tant que chercheur principal pour le développement technologique visant à un diagnostic décentralisé de la tuberculose chez les enfants situés dans des milieux à faibles ressources.

En raison de la sensibilité élevée, les tests à base de chimiluminescence pour la détermination du NO et des composés apparentés présentent un risque élevé de contamination par le NO2. Chaque réactif (en particulier la solution bloquant le NO2) et chaque diluant (y compris le ddH2O) utilisé dans l’expérience doivent être testés pour sa teneur en NO2- afin de corriger le signal de fond. Le nitrite est extrêmement réactif avec une demi-vie dans le...

<table><tbody><tr><td>Acide acétique</td><td>Sigma</td><td>45754</td><td>500 mL - liquide</td></tr><tr><td>Antimousse B Émulsion</td><td>Sigma</td><td>A5757</td><td>250 mL - liquide</td></tr><tr><td>DETA NONOate</td><td>Cayman</td><td>82120</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>Gibco DPBS (1x) sans calcium, sans magnésium</td><td>ThermoFisher</td><td>14190144</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Acide hydroochlorique 37 % (1 M)</td><td>Sigma</td><td>258148</td><td>500 mL - liquide</td></tr><tr><td>Iode</td><td>SAFC</td><td>207772</td><td>100 g - solide</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de mercure (II) réactif ACS > 99,5</td> %<td>Sigma</td><td>215465</td><td>100 g - solide (dissous dans l’eau)</td></tr><tr><td>Système de purification d’eau Mili-Q</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modèle 705 RN 50 &mu ; Seringue L</td><td>Hamilton</td><td>80530</td><td>Seringue d’un microlitre</td></tr><tr><td>Modèle 802 N 25 &mu ; L Seringue</td><td>Hamilton</td><td>84854</td><td>Seringue d’un microlitre</td></tr><tr><td>N-éthylmaléimide</td><td>Sigma</td><td>4260</td><td>25 g -</td></tr><tr><td>Analyseur d’oxyde nitrique cristallin + Bundle Logiciel - Récipient de purge</td><td>Zysense</td><td>NOA 280i</td><td>Détecteur de chimiluminescence</td></tr><tr><td>Nonidet p-40&nbsp ; (NP-40)</td><td>ThermoFisher</td><td>85125</td><td>10 % - 500 mL</td></tr><tr><td>Hexacyanoferrate de potassium (III) Réactif ACS&ge ; 99 %</td><td>Sigma</td><td>244023</td><td>100 g - poudre</td></tr><tr><td>Iodure de potassium Réactif ACS > 99 %</td><td>Sigma</td><td>221945</td><td>100 g -</td></tr><tr><td>cristal solide de nitrite de potassium. Pour l’analyse EMSURE ACS</td><td>Supelco</td><td>105067</td><td>250 g - cristallin</td></tr><tr><td>PowerGen 125</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-359-251</td><td>Homogénéisateur mécanique</td></tr><tr><td>RV3 Pompe à palettes rotatives à deux étages</td><td>Edwards</td><td>A65201906</td><td>Pompe à vide - Livré avec l’analyseur</td></tr><tr><td>Héparine de sodium - BD Hemogard Clo</td><td>BD Biosciences</td><td>BD367871</td><td>75 unités USP</td></tr><tr><td>Réactif ACS anhydre d’hydroxyde de sodium &ge ; 97 %</td><td>Sigma</td><td>795429</td><td>1 kg - pastilles</td></tr><tr><td>Nitrate de sodium Réactif ACS &ge ; 99 %</td><td>Sigma</td><td>221341</td><td>500 g - poudre</td></tr><tr><td>Nitrite de sodium &ge ; 99 %</td><td>Sigma</td><td>S2252</td><td>500 g - cristallin</td></tr><tr><td>Sulfanilamide &ge ; 98 %</td><td>Sigma</td><td>S9251</td><td>100 g - solide</td></tr><tr><td>Chlorure de vanadium (III)</td><td>Sigma</td><td>112393</td><td>25 g - solide - Attention (exothermique)</td></tr><tr><td>Whatman 1 Papier Filtre</td><td>Sigma</td><td>WHA10010155</td><td></td></tr></tbody></table>

tests basés sur la chimiluminescence pour la détection de l’oxyde nitrique et de ses dérivés à partir de l’autoxidation et des composés nitrosés

Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

L’activité de l’oxyde nitrique (NO) in vivo est le résultat combiné de ses effets directs, de l’action de ses dérivés générés par l’autoxidation du NO et des effets des composés nitrosés. La mesure des métabolites du NO est essentielle pour étudier l’activité du NO à la fois au niveau vasculaire et dans d’autres tissus, en particulier dans les milieux expérimentaux où le NO exogène est administré. Les tests de chimiluminescence à base d’ozone permettent de mesurer avec précision les métabolites du NO et du NO dans les fluides (y compris le plasma, les homogénats tissulaires, les cultures cellulaires) et les mélanges gazeux (p. ex., l’haleine expirée). Le NO réagit avec l’ozone pour générer du dioxyde d’azote dans un état excité. L’émission de lumière qui en résulte permet la photodétection et la génération d’un signal électrique reflétant la teneur en NO de l’échantillon. Les aliquotes du même échantillon peuvent être utilisées pour mesurer des métabolites spécifiques du NO, tels que le nitrate, le nitrite, les S-nitrosothiols et les complexes fer-nitrosyle. En outre, le NO consommé par l’hémoglobine sans cellules est également quantifié avec une analyse de chimiluminescence. Une illustration de toutes ces techniques est fournie.

La consommation de NO par dosage de l’Hb sans cellules a été utilisée dans des échantillons contenant des concentrations connues d’oxyHb sans cellules (figure 4). Comme un hème d’oxyHb libère stœchiométriquement une molécule de NO dans le test, l’oxyHb purifié sans cellule est utilisé pour construire la courbe d’étalonnage pour le test (figure supplémentaire 3).
La relation dose-réponse entre l’Hb sans cellules (mesurée avec un test colorimétrique...

Nous présentons ici des protocoles de détection de l’oxyde nitrique et de ses dérivés biologiquement pertinents à l’aide de tests basés sur la chimiluminescence avec une sensibilité élevée.

Tests basés sur la chimiluminescence pour la détection de l’oxyde nitrique et de ses dérivés à partir de l’autoxidation et des composés nitrosés

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

Ce protocole permet aux chercheurs d’utiliser efficacement un détecteur de chimiluminescence pour la mesure des métabolites de l’oxyde nitrique sans les conseils ou les frais liés à l’emploi de personnel dédié sur place. Le test basé sur la chimiluminescence est la méthode la plus sensible pour détecter des changements minimes dans les niveaux d’oxyde nitrique et de ses métabolites dans un échantillon biologique donné. L’oxyde nitrique inhalé est un gaz thérapeutique utilisé pour une grande variété de maladies.Il est crucial que la progression et la récupération de la maladie soient précisément corrélées avec les niveaux de métabolites de l’oxyde nitrique. L’oxyde nitrique inhalé, un antimicrobien, est prometteur dans le traitement des patients atteints de maladies infectieuses des voies respiratoires. La méthode de chimiluminescence permet de corréler la dose d’oxyde nitrique et ses métabolites avec les changements microbiologiques et physiopathologiques.Pour préparer la solution de DETA-NONOate, ajouter 10 milligrammes de DETA-NONOate à 610 microlitres d’hydroxyde de sodium de 10 millimolaires dans du PBS de pH 7,4 pour générer 100 millimolaires de DETA-NONOate et le maintenir su

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Ici, nous proposons des méthodes simples pour tester et évaluer la présence d'espèces réactives de l'oxygène dans les cellules.

Production et détection d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) dans les cancers

La production endogène d'oxyde nitrique (NO) réglemente une grande variété de fonctions biologiques. Il est de plus en plus clair que la perturbation ou une dysrégulation de la signalisation du NO base est impliqué dans de nombreuses maladies humaines. Méthodes de quantification pertinente NO métabolites peuvent fournir de nouveaux biomarqueurs de diagnostic ou de pronostic de la maladie humaine.

Techniques d&#39;analyse permettant de doser la bioactivité d&#39;oxyde nitrique

NADPH oxydase est la principale source d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les phagocytes. En raison de la nature éphémère de ROS, il est difficile de mesurer et de surveiller les niveaux de ROS chez les animaux vivants. Une méthode minimalement invasive pour la quantification de série de ROS chez les souris vivant est décrite.

Imagerie par bioluminescence de l&#39;activité de la NADPH oxydase dans différents modèles animaux

Dans cet article , nous décrivons une méthode relativement facile adaptée en utilisant le colorant fluorescent diaminofluorescéine-2 diacétate (DAF-2DA) et dihydroethidium (DHE) pour en face à la détection simultanée et la visualisation de l' oxyde nitrique intracellulaire (NO) et l' anion superoxyde (O 2 .- ) respectivement, fraîchement isolés aortes intactes d'un modèle d'obésité de la souris.

En détection de visage de l&#39;oxyde nitrique et de superoxyde dans la couche endothéliale des artères intactes

Ce protocole décrit une nouvelle technique d’imagerie peropératoire qui utilise un complexe de ruthénium comme source d’émission de lumière chimiluminescente, produisant ainsi des rapports signal/bruit élevés lors de l’imagerie in vivo. L’imagerie peropératoire est un domaine en pleine expansion qui pourrait révolutionner la façon dont les procédures chirurgicales sont effectuées.

Une nouvelle technique de production et d&#39;observation de chimiluminescence en milieu biologique

L’oxyde nitrique (NO) est une molécule de signalisation importante dans l’homéostasie vasculaire. La production de NO in vivo est trop faible pour une mesure directe. La chimiluminescence fournit des informations utiles sur le cycle du NO en mesurant ses précurseurs et ses produits d’oxydation, les nitrites et les nitrates. La détermination des nitrites / nitrates dans les tissus et les fluides corporels est expliquée.

Mesure de nitrites et de nitrates, Métabolites dans le Nitric Oxide Pathway, dans les matières biologiques en utilisant la méthode chimiluminescence

Ce manuscrit présente des protocoles pour l’application de nouvelles sondes d’oxyde nitrique (NO•) génétiquement codées (geNOps) pour surveiller les fluctuations de NO• d’une cellule unique en temps réel à l’aide de la microscopie à fluorescence. La formation de NO• déclenchée par le Ca2+ au niveau des cellules endothéliales individuelles a été visualisée en combinant les geNOps avec un capteur chimique Ca2+.

Application de Codé génétiquement fluorescent oxyde nitrique (NO •) Sondes, les geNOps, pour l&#39;imagerie en temps réel de NO • Les signaux dans les cellules simples

Nous présentons des protocoles pour trois méthodes différentes d’homogénéisation de quatre groupes musculaires différents de tissu musculaire squelettique de rat afin de mesurer et de comparer les niveaux de nitrate et de nitrite. De plus, nous comparons différents poids d’échantillon pour déterminer si la taille de l’échantillon de tissu affecte les résultats de l’homogénéisation.

Préparation d’homogénats de muscles squelettiques de rat pour les mesures de nitrates et de nitrites

La capture des changements dynamiques dans l’activation protéique des globules rouges énucléés pose des défis méthodologiques, comme la préservation des changements dynamiques des stimuli aigus pour une évaluation ultérieure. Le protocole présenté décrit les techniques de préparation et de coloration des échantillons qui permettent la préservation et l’analyse des changements protéiques pertinents et la détection ultérieure.

Détection basée sur l’immunomarquage d’altérations dynamiques dans les protéines des globules rouges

Ce protocole décrit une méthode pour quantifier la production d’oxyde nitrique (NO) dans les cultures épithéliales des voies respiratoires différenciées à l’interface air–liquide (ALI) en mesurant le nitrite dans les sécrétions apicales à l’aide d’un test chimiluminescence à base de triiodures.

Mesure de la production d’oxyde nitrique dans les cultures cellulaires épithéliales trachéales de la souris différenciées à l’interface air-liquide

Découvrez la détection de l'oxyde nitrique par chimiluminescence pour la biochimie et la pharmacologie. Cette méthode sensible mesure les métabolites dans les échantillons biologiques sans personnel spécialisé sur site.

Tests basés sur la chimiluminescence pour la détection de l’oxyde nitrique et de ses dérivés à partir de l’autoxidation et des composés nitrosés (Vidéo) | JoVE Journal

Tests basés sur la chimiluminescence pour la détection de l’oxyde nitrique et de ses dérivés à partir de l’autoxidation et des composés nitrosés

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