Protocole basé sur la microdissection laser pour l’analyse LC-MS/MS du profil protéomique des granules de neuromélanine
December 16th, 2021
Un protocole robuste est présenté ici pour isoler les granules de neuromélanine à partir de tissu humain post-mortem substantia nigra pars compacta par microdissection laser. Ce protocole révisé et optimisé minimise considérablement le temps requis pour le prélèvement des échantillons, réduit la quantité d’échantillon requise et améliore l’identification et la quantification des protéines par analyse LC-MS/MS.
Notre combinaison de microdissection laser et de spectrométrie de masse permet d’étudier les changements spatialement résolus au niveau protéomique dans tout type de tissu. Dans notre cas, les granules de neuromélanine. Notre protocole permet l’analyse protéomique basée sur un échantillon limité.
Ce qui est généralement un grand défi lorsque vous travaillez avec du tissu cérébral post-mortem. Puisque les cellules individuelles peuvent être isolées pour comparer les conditions saines et les conditions de la maladie au niveau protéomique. Cela peut améliorer notre compréhension des mécanismes de la maladie.
Pour commencer, placez la lame de membrane tissulaire dans le support de lame sur la scène robotisée, le tissu tourné vers le haut. Pour acquérir un scan de vue d’ensemble de la section de tissu. Utilisez la fonction de numérisation, sélectionnez la zone d’intérêt dans les coins supérieur gauche et inférieur droit.
Sélectionnez ensuite analyser tous les ROI pour effectuer l’analyse. Pour la sélection automatique des granules de neuromélanine dans le champ de vision actuel. Sélectionnez l’analyse du champ de vision.
Sélectionnez ensuite inverser le résultat et définissez le seuil pour les canaux RVB. Ainsi, seuls les granules de neuromélanine sont surlignés en rouge dans la fenêtre d’aperçu. Maintenant, cliquez sur OK, pour utiliser les paramètres ajustés pour le champ de vision.
Ajustez les réglages du laser en utilisant une zone de la glissière recouverte uniquement par la membrane. Remplissez le bouchon du tube de prélèvement d’échantillons avec 50 microlitres d’eau ultrapure. Et insérez le capuchon dans le collecteur du robot.
À l’aide de l’interface logicielle, positionnez le robot-moteur au-dessus de la deuxième étape du robot pour démarrer la collecte d’échantillons. Démarrez le laser. Contrôlez les réglages d’énergie et de mise au point pendant le processus laser et ajustez les paramètres si nécessaire.
Assurer l’isolement et le catapultage appropriés des objets isolés dans le bouchon du tube de prélèvement d’échantillons pour au moins les 10 premiers objets. Une fois l’échantillonnage terminé, dirigez le robot-moteur jusqu’à sa position de départ et retirez le tube de prélèvement d’échantillons. Après filage des échantillons par centrification.
Sécher les échantillons pendant 1,5 heure dans un concentrateur sous vide. Après avoir effectué la digestion triptique comme décrit dans le texte. Préparer l’échantillon pour l’analyse HPLC-MS en dissolvant 200 à 400 nanogrammes d’échantillons de peptides dans un volume défini de 0,1% TFA.
Dans des entrées de flacons en verre à spectrométrie de masse inerte. Si la détermination de la concentration n’est pas applicable en raison d’une faible quantité d’échantillon. Vérifiez la charge d’échantillon identique en comparant le courant ionique total.
Pour commencer l’analyse des données brutes protéomiques. Cliquez sur charger pour charger les fichiers bruts dans le logiciel. Cliquez sur définir l’expérience pour attribuer les noms des échantillons.
Pour définir des paramètres spécifiques au groupe. Ajouter les modifications en choisissant la désamidation NQ, l’oxydation M et la carbamidométhylation N-terme comme modifications variables. puis ajouter la carbamidométhylation C en modification fixe.
Choisissez la trypsine comme enzyme de digestion dans l’onglet digestion. Dans l’onglet Quantification sans étiquette, ajoutez l’option LFQ et si plus de 10 fichiers doivent être traités, choisissez l’option LFQ rapide pour raccourcir le temps de traitement. S’assurer que tous les autres paramètres spécifiques au groupe restent dans les paramètres d’usine.
Passez à l’onglet des paramètres globaux et ajoutez le fichier FASTA dérivé d’uniprot. org dans l’onglet Séquences. Modifiez la règle d’identificateur en conséquence.
Et ajoutez l’ID de taxonomie 9606 pour Homo sapiens. Pour la quantification des protéines, choisissez des peptides uniques et des peptides rasoirs. Ajoutez ensuite l’option iBAQ comme mesure de quantification des protéines dans l’onglet de quantification sans étiquette.
Assurez-vous que tous les autres paramètres globaux restent dans les paramètres d’usine et cliquez sur Démarrer. Une fois l’analyse effectuée avec succès, récupérez les groupes de protéines. Sortie TXT.
Chargez les groupes de protéines. TXT dans le logiciel d’analyse. Ajoutez les valeurs iBAQ en tant que colonnes principales et triez toutes les autres colonnes en fonction de leur type.
Filtrez les leurres et les contaminants en filtrant les lignes en fonction de la colonne catégorielle et filtrez les résultats en fonction des valeurs valides. Exportez la sortie au format txt pour un traitement ultérieur. Et évaluer les résultats concernant la question de recherche.
Dans la présente étude, 1 898 groupes de protéines ont été identifiés dans les NMG et 1 565 ont été identifiés dans les tissus SN environnants, dont 1 384 ont été identifiés dans les deux zones tissulaires. Ainsi, 514 et 181 groupes de protéines ont été identifiés exclusivement dans les NMG et les tissus SN respectivement. Dans les mesures représentatives du DDA.
Des valeurs iBAQ légèrement plus élevées dans les NMG par rapport à SN ont indiqué une abondance plus élevée de la protéine cytoplasmique dynien-1, chaîne lourde 1 dans les NMG. Cette observation a pu être vérifiée dans des expériences PRM pour le peptide ESPEVLLTLDILK. Dans lequel une plus grande abondance de NMG a été détectée.
Basé sur la zone de pic au niveau MS1 et MS2. L’étape la plus importante est de loin l’isolement des NMG, car le reste du protocole est basé sur cette étape pour être correctement exécuté. Après la procédure LMD, les échantillons peuvent être utilisés et traités ultérieurement pour tout type de technique omique telle que la génomique, la transcriptomique, la protéomique ou la lipidomique.
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Aperçu
Cette étude présente un protocole robuste pour isoler les granules de neuromélanine du tissu post-mortem humain de la substantia nigra pars compacta en utilisant la microdissection au laser. L'approche optimisée réduit considérablement le temps de collecte d'échantillons et la quantité requise, tout en améliorant l'identification et la quantification des protéines par l'analyse LC-MS/MS.
Composants clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Protéomique
- Analyse cérébrale post-mortem
Contexte
- Les granules de neuromélanine ont historiquement été difficiles à isoler pour l'analyse.
- Les méthodes traditionnelles nécessitent des échantillons plus importants et des temps de collecte prolongés.
- La microdissection au laser permet une isolation précise au niveau de la cellule unique.
- Ce protocole vise à améliorer la compréhension des mécanismes de la maladie dans les conditions neurologiques.
Objectif de l'étude
- Optimiser l'isolement des granules de neuromélanine pour l'analyse protéomique.
- Minimiser les exigences en matière d'échantillons et réduire le temps de collecte dans les tissus post-mortem.
- Améliorer la détection des protéines liées aux conditions de santé et de maladie.
Méthodes utilisées
- La microdissection au laser a été utilisée pour isoler les granules de neuromélanine à partir de tissus cérébraux humains.
- Le modèle impliquait du tissu post-mortem de la substantia nigra.
- Un flux de travail détaillé LC-MS/MS a été intégré pour l'identification des protéines.
- L'implication d'étapes critiques telles que la sélection automatisée et l'ajustement des paramètres du laser a été soulignée.
- L'analyse protéomique comprenait une validation par rapport aux méthodes établies de quantification des protéines.
Résultats principaux
- 1 898 groupes de protéines ont été identifiés dans les granules de neuromélanine, avec des schémas d'expression distincts par rapport au tissu environnant.
- Les résultats notables comprennent des valeurs iBAQ plus élevées dans les granules de neuromélanine pour certaines protéines.
- La méthode facilite la comparaison des conditions de santé et de maladie au niveau protéomique.
- Cette étude met en évidence des découvertes cruciales concernant la composition protéique dans la santé cérébrale et la pathologie.
Conclusions
- L'étude démontre une approche rationalisée pour isoler les granules de neuromélanine, améliorant les analyses protéomiques.
- La méthode optimisée a des implications significatives pour la compréhension des mécanismes de la maladie dans les troubles neurologiques.
- Des applications supplémentaires pourraient conduire à des avancées dans les cadres cliniques et de recherche axées sur les pathologies liées à la neuromélanine.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Laser microdissection enables spatially resolved proteomic analysis of neuromelanin granules from limited post-mortem human brain tissue, addressing a key bottleneck in neurodegenerative disease research. This approach supports target validation and mechanistic de-risking by providing disease-relevant proteomic data from dopaminergic neurons affected in Parkinson's disease. The method enhances predictive confidence in early discovery by allowing direct comparison of healthy and diseased states at the protein level.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating neuromelanin granules for proteomic profiling in Parkinson's disease-relevant tissue.
- Operational Value: Reduces tissue requirements through unbiased, automated collection of granules, facilitating analysis of precious post-mortem samples.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by identifying proteins exclusively enriched in neuromelanin granules versus surrounding substantia nigra tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream omics workflows by yielding high-purity granule isolates compatible with LC-MS/MS.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through automated selection thresholds and consistent laser settings for granule isolation.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation by providing quantitative proteomic outputs (iBAQ, LFQ) from disease-relevant neuronal compartments.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by linking neuromelanin granule proteomics to neurodegenerative conditions like Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling proteomic comparison of healthy versus disease conditions.
- Scientific Value: Focuses on predictive de-risking value by identifying differentially abundant proteins (e.g., cytoplasmic dynein-1 heavy chain 1) as potential translational biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation to preclinical research by providing spatially resolved proteomic data from disease-affected neuronal populations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling proteomic comparison of neuromelanin granules and surrounding substantia nigra tissue.
- Screening: Describes assay readiness through automated granule selection and reproducible sample collection for downstream LC-MS/MS analysis.
- Analytics: Highlights label-free quantification (LFQ) and iBAQ measurements that allow teams to compare protein abundance between conditions.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by enabling proteomic profiling of human tissue relevant to Parkinson's disease pathology.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for omics applications (genomics, transcriptomics, lipidomics) beyond proteomics.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in neurodegeneration research.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability through automated laser microdissection workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in CNS target programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on disease-relevant proteomic signatures.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in laser microdissection operation and mass spectrometry-based proteomics.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include UV laser microdissection systems and LC-MS/MS platforms.
- Cross-team standardization requirements for granule selection thresholds and sample preparation protocols.
- Adaptation considerations across model systems, including optimization of laser settings for different tissue types.
- Practical limitations include dependency on post-mortem tissue availability and potential protein degradation effects.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:46
Laser Microdissection and Pressure Catapulting
2:46
Sample Preparation for HPLC-MS and Proteomic Raw Data Analysis
5:10
Statistical Analysis
5:50
Results: Protein Identification in Neuromelanin Granules (NMGs) and Substantia nigra (SN)
7:00
Conclusion
