Protocole basé sur la microdissection laser pour l’analyse LC-MS/MS du profil protéomique des granules de neuromélanine

Notre combinaison de microdissection laser et de spectrométrie de masse permet d’étudier les changements spatialement résolus au niveau protéomique dans tout type de tissu. Dans notre cas, les granules de neuromélanine. Notre protocole permet l’analyse protéomique basée sur un échantillon limité.

Ce qui est généralement un grand défi lorsque vous travaillez avec du tissu cérébral post-mortem. Puisque les cellules individuelles peuvent être isolées pour comparer les conditions saines et les conditions de la maladie au niveau protéomique. Cela peut améliorer notre compréhension des mécanismes de la maladie.

Pour commencer, placez la lame de membrane tissulaire dans le support de lame sur la scène robotisée, le tissu tourné vers le haut. Pour acquérir un scan de vue d’ensemble de la section de tissu. Utilisez la fonction de numérisation, sélectionnez la zone d’intérêt dans les coins supérieur gauche et inférieur droit.

Sélectionnez ensuite analyser tous les ROI pour effectuer l’analyse. Pour la sélection automatique des granules de neuromélanine dans le champ de vision actuel. Sélectionnez l’analyse du champ de vision.

Sélectionnez ensuite inverser le résultat et définissez le seuil pour les canaux RVB. Ainsi, seuls les granules de neuromélanine sont surlignés en rouge dans la fenêtre d’aperçu. Maintenant, cliquez sur OK, pour utiliser les paramètres ajustés pour le champ de vision.

Ajustez les réglages du laser en utilisant une zone de la glissière recouverte uniquement par la membrane. Remplissez le bouchon du tube de prélèvement d’échantillons avec 50 microlitres d’eau ultrapure. Et insérez le capuchon dans le collecteur du robot.

À l’aide de l’interface logicielle, positionnez le robot-moteur au-dessus de la deuxième étape du robot pour démarrer la collecte d’échantillons. Démarrez le laser. Contrôlez les réglages d’énergie et de mise au point pendant le processus laser et ajustez les paramètres si nécessaire.

Assurer l’isolement et le catapultage appropriés des objets isolés dans le bouchon du tube de prélèvement d’échantillons pour au moins les 10 premiers objets. Une fois l’échantillonnage terminé, dirigez le robot-moteur jusqu’à sa position de départ et retirez le tube de prélèvement d’échantillons. Après filage des échantillons par centrification.

Sécher les échantillons pendant 1,5 heure dans un concentrateur sous vide. Après avoir effectué la digestion triptique comme décrit dans le texte. Préparer l’échantillon pour l’analyse HPLC-MS en dissolvant 200 à 400 nanogrammes d’échantillons de peptides dans un volume défini de 0,1% TFA.

Dans des entrées de flacons en verre à spectrométrie de masse inerte. Si la détermination de la concentration n’est pas applicable en raison d’une faible quantité d’échantillon. Vérifiez la charge d’échantillon identique en comparant le courant ionique total.

Pour commencer l’analyse des données brutes protéomiques. Cliquez sur charger pour charger les fichiers bruts dans le logiciel. Cliquez sur définir l’expérience pour attribuer les noms des échantillons.

Pour définir des paramètres spécifiques au groupe. Ajouter les modifications en choisissant la désamidation NQ, l’oxydation M et la carbamidométhylation N-terme comme modifications variables. puis ajouter la carbamidométhylation C en modification fixe.

Choisissez la trypsine comme enzyme de digestion dans l’onglet digestion. Dans l’onglet Quantification sans étiquette, ajoutez l’option LFQ et si plus de 10 fichiers doivent être traités, choisissez l’option LFQ rapide pour raccourcir le temps de traitement. S’assurer que tous les autres paramètres spécifiques au groupe restent dans les paramètres d’usine.

Passez à l’onglet des paramètres globaux et ajoutez le fichier FASTA dérivé d’uniprot. org dans l’onglet Séquences. Modifiez la règle d’identificateur en conséquence.

Et ajoutez l’ID de taxonomie 9606 pour Homo sapiens. Pour la quantification des protéines, choisissez des peptides uniques et des peptides rasoirs. Ajoutez ensuite l’option iBAQ comme mesure de quantification des protéines dans l’onglet de quantification sans étiquette.

Assurez-vous que tous les autres paramètres globaux restent dans les paramètres d’usine et cliquez sur Démarrer. Une fois l’analyse effectuée avec succès, récupérez les groupes de protéines. Sortie TXT.

Chargez les groupes de protéines. TXT dans le logiciel d’analyse. Ajoutez les valeurs iBAQ en tant que colonnes principales et triez toutes les autres colonnes en fonction de leur type.

Filtrez les leurres et les contaminants en filtrant les lignes en fonction de la colonne catégorielle et filtrez les résultats en fonction des valeurs valides. Exportez la sortie au format txt pour un traitement ultérieur. Et évaluer les résultats concernant la question de recherche.

Dans la présente étude, 1 898 groupes de protéines ont été identifiés dans les NMG et 1 565 ont été identifiés dans les tissus SN environnants, dont 1 384 ont été identifiés dans les deux zones tissulaires. Ainsi, 514 et 181 groupes de protéines ont été identifiés exclusivement dans les NMG et les tissus SN respectivement. Dans les mesures représentatives du DDA.

Des valeurs iBAQ légèrement plus élevées dans les NMG par rapport à SN ont indiqué une abondance plus élevée de la protéine cytoplasmique dynien-1, chaîne lourde 1 dans les NMG. Cette observation a pu être vérifiée dans des expériences PRM pour le peptide ESPEVLLTLDILK. Dans lequel une plus grande abondance de NMG a été détectée.

Basé sur la zone de pic au niveau MS1 et MS2. L’étape la plus importante est de loin l’isolement des NMG, car le reste du protocole est basé sur cette étape pour être correctement exécuté. Après la procédure LMD, les échantillons peuvent être utilisés et traités ultérieurement pour tout type de technique omique telle que la génomique, la transcriptomique, la protéomique ou la lipidomique.