Acoustophorèse microfluidique pour la séparation en continu de bactéries à Gram négatif à l’aide de billes d’affinité aptamères
17 octobre 2022
Cet article décrit la fabrication et le fonctionnement de puces acoustophorétiques microfluidiques à l’aide de la technique de l’acoustophorèse microfluidique et de microbilles modifiées par aptamères qui peuvent être utilisées pour isoler rapidement et efficacement les bactéries à Gram négatif d’un milieu.
Ce protocole décrit notre technologie d’acoustophorèse microfluidique qui peut être utilisée pour la séparation rapide et efficace des bactéries à Gram négatif d’un milieu à l’aide de microbilles modifiées par aptamère. Les systèmes d’acoustophorèse microfluidique permettent la séparation des bactéries à Gram négatif avec un débit raisonnable et une isolation cellulaire sans contact. L’acoustophorèse microfluidique peut être optimisée pour isoler les bactéries à partir d’échantillons médicaux et environnementaux.
Pour commencer, concevez une puce d’acoustophorèse microfluidique qui recueille les billes de PS à la sortie cible et élimine le reste après avoir injecté un mélange d’échantillons de PS dans l’entrée de l’échantillon. Préparez une puce avec les couches au-dessus et au-dessous de la couche de silicium collées au verre borosilicate. Et une troisième couche de verre borosilicate, en utilisant l’anodisation, ajoute 1000 volts et 400 degrés Celsius.
Fixez un PZT à la couche de verre borosilicaté le long du canal microfluidique en utilisant moins de 10 microlitres d’adhésif cyanoacrylate. Inoculer les bactéries GN et GP dans le milieu Luria-Bertani et les incuber à 37 degrés Celsius et 220 tours par minute pendant 16 heures. Centrifuger les bactéries cultivées à 9 056 FCR pendant une minute à température ambiante.
Ensuite, lavez deux fois avec 1X tampon PBS. Préparer les bactéries GN et GP sélectionnées pour l’analyse en les remettant en suspension dans le tampon de liaison. Remettez en suspension le mélange de microbilles enrobées de streptavidine de 10 micromètres avant utilisation.
Vortex le mélange pendant 20 secondes. Préparez l’aptamère en le dénaturant à 95 degrés Celsius pendant trois minutes, puis en le repliant à zéro degré Celsius pendant deux minutes. Transférez 250 microlitres du mélange de microbilles recouvertes de streptavidine en suspension dans un tube de 1,5 millilitre et ajoutez 100 microlitres d’aptamère d’ADN biotinylé dans le tube.
Incuber le mélange à température ambiante pendant 30 minutes tout en tournant à 25 tours par minute. Centrifuger le mélange réactionnel à 9, 056 RCF pendant 40 secondes à température ambiante. Ensuite, lavez le tube deux fois avec 200 microlitres de tampon Tris-HCl.
Ajouter 10 microlitres de 100 milligrammes par millilitre de BSA au tube d’échantillon lavé et incuber pendant 30 minutes à température ambiante tout en tournant à 25 tours par minute. Enfin, laver deux fois les microbilles modifiées aptamères dans le tampon Tris-HCl par centrifugation à 9, 056 RCF pendant 40 secondes à température ambiante. Connectez les tubes en PEEK aux deux entrées pour injecter deux échantillons et un tampon, ainsi qu’aux deux sorties pour la collecte et le rejet des déchets.
À l’aide d’une seringue de 10 millilitres, remplir le canal d’acoustophorèse microfluidique avec de l’eau déminéralisée sans bulles. Préparez un régulateur de pression de précision avec deux canaux de sortie ou plus pour contrôler le débit du fluide. Après avoir préparé le dispositif, injecter l’échantillon et le tampon en appliquant une pression de deux kilopascals à l’entrée de l’échantillon et de quatre kilopascals à l’entrée du tampon à l’aide du dispositif de contrôle de pression de précision.
À l’aide d’un microscope, faites la mise au point sur une bille et déplacez-la vers le centre du canal microfluidique à l’aide du PZT. Générez une fréquence de résonance de 3,66 mégahertz à l’aide d’un générateur de fonction à canal unique et amplifiez un signal typique de 16 décibels à l’aide d’un amplificateur de puissance. Observez les processus de séparation et d’enrichissement sur la puce acoustofluidique avec un microscope à fluorescence et une caméra haute vitesse fonctionnant à 1 200 images par seconde.
La puce acoustophorétique introduite dans cette étude a confirmé que, à mesure que la tension du PZT augmentait, la concentration centrale des billes de 10 micromètres augmentait. À cinq volts de la tension PZT, la plupart des billes de 10 micromètres étaient concentrées au centre. Le rapport entre le nombre de billes collectées à la sortie et le nombre total de billes injectées de 10 micromètres a été appelé taux de récupération.
Le rapport entre le nombre de perles de taille micrométrique et le nombre total de perles collectées a été appelé pureté. Les résultats ont indiqué que l’appareil avait une efficacité de séparation élevée pour les billes d’une taille de 10 micromètres. Le nombre de bactéries GN et GP liées à chaque microbille modifiée aptamère a été mesuré à l’aide d’un microscope équipé d’une caméra à grande vitesse.
Les cinq bactéries GN étaient liées aux billes tandis que beaucoup moins de bactéries GP étaient liées aux substances testées. L’intensité du signal différait significativement entre les bactéries GN et GP. L’adhésif utilisé pour fixer le PZT doit être utilisé le moins possible pour la précision de l’ondulation et le PZT et le microcanal doivent être parallèles.
Ce dispositif peut être utilisé pour détecter des bactéries vivantes ou des biomarqueurs dérivés de bactéries pendant la période de diagnostic précoce des maladies infectieuses bactériennes.
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Aperçu
Cette étude présente une technologie de microfluidique acoustophorétique pour la séparation rapide et efficace de bactéries à Gram négatif à partir de divers milieux. La méthode utilise des microbilles modifiées par des aptamères afin de renforcer le processus d'isolement, permettant une séparation cellulaire sans contact avec un débit raisonnable.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Microfluidique
- Acoustophorèse
- Microbiologie
Contexte
- Les systèmes microfluidiques permettent une manipulation précise des fluides à l'échelle microscopique.
- L'acoustophorèse est une technique qui utilise des ondes acoustiques pour la manipulation de particules.
- Les bactéries à Gram négatif posent des défis importants en matière d'isolement en raison de leurs propriétés structurelles.
- Les aptamères sont des oligonucléotides courts et simples brins capables de se lier sélectivement à des cibles spécifiques.
Objectif de l'étude
- Développer une puce microfluidique d'acoustophorèse pour la séparation efficace de bactéries.
- Optimiser le processus d'isolement pour des échantillons médicaux et environnementaux.
- Démontrer l'efficacité des microbilles modifiées par des aptamères dans l'amélioration de l'efficacité de séparation.
Méthodes utilisées
- Concevoir une puce de microfluidique par acoustophorèse.
- Assembler des couches de silicium et de verre borosilicaté pour la fabrication de la puce.
- Injecter un mélange d'échantillons de PS dans la puce pour séparation.
- Appliquer une anodisation avec des conditions spécifiques de tension et de température.
Résultats principaux
- Le système microfluidique d'acoustophorèse a permis d'isoler avec succès des bactéries Gram-négatives.
- Une séparation à haut débit et sans contact a été réalisée.
- Des microbilles modifiées par des aptamères ont considérablement amélioré l'efficacité d'isolement.
- La méthode est applicable à la fois aux échantillons médicaux et environnementaux.
Conclusions
- La microfluidique par acoustophorèse est une technique prometteuse pour l'isolement bactérien.
- Les modifications des aptamères améliorent la sélectivité et l'efficacité du processus.
- Cette technologie pourrait être bénéfique pour diverses applications en microbiologie.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Cette méthode de microfluidique par acoustophorèse permet l'isolement rapide et à haute pureté de bactéries à Gram négatif à partir de matrices complexes, répondant ainsi à un goulot d'étranglement critique dans le diagnostic précoce des maladies infectieuses et la surveillance environnementale. En combinant une séparation acoustique sans marquage avec une spécificité basée sur des aptamères, cette technologie soutient la réduction des risques liés aux cibles dans les flux de travail de découverte d'antimicrobiens et de validation de biomarqueurs. Le rendement démontré supérieur à 98 % et la pureté de 97,8 % avec une concentration 10 fois supérieure offrent une alternative évolutive et sans contact à la centrifugation ou à la filtration pour la préparation d'échantillons en phase préclinique.
Applications stratégiques en R-D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet la validation fonctionnelle de cibles bactériennes à Gram négatif en isolant des pathogènes vivants à partir d'échantillons biologiques ou environnementaux hétérogènes.
- Valeur opérationnelle : Réduit le temps de traitement des échantillons et minimise les dommages biomoléculaires par rapport aux techniques de séparation traditionnelles.
- Valeur prédictive : Facilite la réduction des risques mécanistiques en fournissant des fractions bactériennes purifiées pour des études d'interaction avec la cible et de mécanisme d'action.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des entrées bactériennes purifiées pour des tests de criblage phénotypique, réduisant ainsi les faux positifs dus aux espèces Gram-positives contaminantes.
- Valeur opérationnelle : Normalise la préparation des échantillons grâce à une focalisation acoustophorétique reproductible et une capture médiée par des aptamères.
- Extensibilité : La conception du canal bifurqué permet le traitement, la purification et la concentration simultanés, offrant un débit plus élevé dans les cascades de criblage.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Relie les étapes de découverte et préclinique en permettant l'isolement cohérent de bactéries Gram-négatif à partir de matrices proches de prélèvements cliniques, comme le sang ou l'urine.
- Alignement des biomarqueurs : Facilite la détection de bactéries vivantes ou de biomarqueurs dérivés dans les applications de diagnostic précoce, soutenant ainsi le développement translationnel de biomarqueurs.
- Progression adaptée au risque : Des taux élevés de rendement et de pureté améliorent la confiance dans les tests ultérieurs utilisés pour l'évaluation des composés candidats.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum entre la découverte précoce et le stade préclinique, en soutenant spécifiquement la préparation des échantillons pour la validation de cibles, la préparation des tests et les études mécanistiques où la pureté des bactéries Gram-négatif est essentielle.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en isolant des souches Gram-négatif spécifiques à partir de cultures mixtes ou d'échantillons environnementaux pour la réduction des risques ciblées.
- Criblage : Permet d'obtenir des populations bactériennes prêtes à l'essai avec un transfert minimal de composants interférents, améliorant ainsi la fidélité du criblage.
- Analytique : Fournit des résultats quantitatifs par microscopie de fluorescence et imagerie haute vitesse, permettant des comparaisons des rapports de liaison bactéries-billes et de l'intensité du signal.
- Recherche translationnelle : S'intègre aux flux de travail précliniques en permettant l'isolement à partir d'échantillons médicalement pertinents, soutenant la continuité dans le développement de modèles de maladies infectieuses.
- Réutilisation en entreprise : La conception basée sur des puces et la fluidique contrôlée par pression permettent une standardisation entre laboratoires et une adaptation à divers types d'échantillons sans nécessiter de refonte.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique liée aux impuretés des échantillons.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité grâce à un contrôle précis des forces acoustiques et à une préparation standardisée des aptamères liés aux billes.
- Valeur stratégique : Améliore la fiabilité des décisions d'aller/arrêt dans les programmes antimicrobiens en fournissant des données biologiques de haute fidélité.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats thérapeutiques fondée sur des données mécanistiques plus pures issues de fractions bactériennes purifiées.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en conception de microfluidique, en optimisation des paramètres acoustophorétiques et en protocoles de conjugaison d'aptamères sur billes.
- Dépend de transducteurs piézoélectriques, de générateurs de fonctions, d'amplificateurs de puissance et de microscopie à fluorescence dotée d'une capacité d'imagerie haute vitesse.
- Exige une standardisation des conditions tampons, des débits (2 kPa pour l'échantillon, 4 kPa pour le tampon) et de l'étalonnage de la tension PZT entre différents utilisateurs.
- L'adaptation à différentes espèces bactériennes ou matrices d'échantillons peut nécessiter une ré-optimisation du choix des aptamères et de la fréquence de résonance acoustique.
- Les limitations pratiques incluent une ondulation du canal induite par l'adhésif si un excès de cyanoacrylate est utilisé, ce qui affecte l'uniformité du champ acoustique.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Microuidic Acoustophoresis Chip Design and Fabrication
1:23
Bacterial Strains and Culture
1:56
Microbeads and Immobilization of Aptamer onto Microbeads
3:10
Acoustophoresis Setup and Operation
4:19
Results: Using Microfluidics to Capture GN Bacteria from Culture Samples at High Speed
5:26
Conclusion
