Name: Cellule unique réutilisable pour des analyses épigénomiques itératives (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Découvrez une méthode de cellule unique réutilisable pour l'analyse épigénomique itérative. Cette technique permet d'étudier plusieurs marques épigénétiques dans la même cellule, facilitant la conception de thérapies épigénétiques.

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Nous remercions les Drs David Sanchez-Martin et Christopher B. Buck pour leurs commentaires au cours de la phase de conceptualisation du projet. Nous remercions également le Genomics Core, le Center for Cancer Research, le National Cancer Institute, les National Institutes of Health pour leur aide dans les expériences préliminaires, et le Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH pour leurs conseils en matière d’analyse informatique. Nous remercions Mme Anna Word pour son aide à l’optimisation des ADN polymérases utilisées dans la méthode. Ce travail a utilisé les ressources informatiques du cluster Biowulf (http://hpc.nih.gov) du NIHHPC. Ce projet est soutenu par le programme intra-muros du Center for Cancer Research, du National Cancer Institute, des National Institutes of Health, du NCI Director’s Innovation Award (#397172) et des fonds fédéraux du National Cancer Institute sous le contrat n ° HHSN261200800001E. Nous remercions les Drs Tom Misteli, Carol Thiele, Douglas R. Lowy et tous les membres du Laboratoire d’oncologie cellulaire pour leurs commentaires productifs.

<ol><li>Perkel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+enters+the+multiomics+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis enters the multiomics age.</a> Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).</li>
<li>Clark, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scNMT-seq+enables+joint+profiling+of+chromatin+accessibility+DNA+methylation+and+transcription+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 781(2018).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+potential+identified+by+shared+single-cell+profiling+of+RNA+and+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin.</a> Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra+high-throughput+method+for+single-cell+joint+analysis+of+open+chromatin+and+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+profiling+of+histone+modifications+and+transcriptome+in+single+cells+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain.</a> Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).</li>
<li>Mimitou, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable%2C+multimodal+profiling+of+chromatin+accessibility%2C+gene+expression+and+protein+levels+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells.</a> Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).</li>
<li>Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+epigenomic+analyses+in+the+same+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Iterative epigenomic analyses in the same single cell.</a> Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).</li>
<li>Tosato, G., Ohnuki, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTosato%2C+G+%22Methods+of+preparing+a+re-usable+single+cell+and+methods+fro+analyzing+the+epigenome%2C+transcriptome%2C+and+genome+of+a+single+cell%22">Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell</a>. , EP 3619307, US 202001026704 (2021).</li>
<li>Harada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromatin+integration+labelling+method+enables+epigenomic+profiling+with+lower+input%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input.</a> Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Marina, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET-catalyzed+oxidation+of+intragenic+5-methylcytosine+regulates+CTCF-dependent+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing.</a> EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).</li>
<li>Weast, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeast%2C+RC+%22Handbook+of+chemistry+and+physics%3A+a+ready-reference+book+of+chemical+and+physical+data.+56th+edn%22">Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn</a>. Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H. , Chemical Rubber Company Press. (1975).</li>
<li>Aydin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+history%2C+principles%2C+and+types+of+ELISA%2C+and+our+laboratory+experience+with+peptide%2Fprotein+analyses+using+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA.</a> Peptides. 72, 4-15 (2015).</li>
<li>Gan, S. D., Patel, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+and+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12(2013).</li>
<li>Porstmann, T., Kiessig, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+techniques.+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay techniques. An overview.</a> Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).</li>
<li>Chao, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).</li>
<li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+library+prep+approaches+for+sequencing+low+input+translatome+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples.</a> BMC Genomics. 19 (1), 696(2018).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Ku, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+immunocleavage+sequencing+%28scChIC-seq%29+to+profile+histone+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification.</a> Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).</li>
<li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+%28ACT-seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).</li>
<li>Maskell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+retroviral+integration+into+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for retroviral integration into nucleosomes.</a> Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).</li>
</ol>

Les Drs Ohnuki et Tosato sont les co-inventeurs d’un brevet intitulé « Methods for preparing a reusable single cell and methods for analysis the epigenome, transcriptome and genome of a single cell » (EP3619307 et US20200102604). La demande de brevet a été déposée en partie sur la base des résultats préliminaires liés à la technologie décrite dans le manuscrit actuel. L’invention ou les inventions décrites et revendiquées dans cette demande de brevet ont été faites alors que les inventeurs étaient des employés à temps plein du gouvernement des États-Unis. Par conséquent, en vertu de la partie 7 du Code of Federal Regulations, 45, tous les droits, titres et intérêts relatifs à cette demande de brevet ont été ou devraient être cédés par la loi au gouvernement des États-Unis. Le gouvernement des États-Unis transfère une partie des redevances qu’il reçoit à ses inventeurs employés en vertu de l’article 3710c du Code des États-Unis.

Cet article décrit le protocole étape par étape pour l’analyse multiépigénomique unicellulaire récemment rapportée utilisant des cellules uniques réutilisables7. Dans les paragraphes suivants, nous discutons des points critiques, en soulignant les limites potentielles du protocole. 
L’un des points critiques tout au long du protocole (des étapes 7.2 à 13) est d’éviter la contamination par la DNase. Une seule cellule n’a que deux copies d’ADN génomique. Par conséquent, e...

La technologie unicellulaire entre dans l’ère de la multiomique unicellulaire, qui intègre des technologies omiques unicellulairesindividuelles 1. Récemment, la transcriptomique unicellulaire a été combinée avec des méthodes de détection de l’accessibilité de la chromatine (scNMT-seq2 et SHARE-seq3) ou des modifications des histones (Paired-seq4 et Paired-Tag5). Plus récemment, la transcriptomique et la protéomique unicellulaires ont été intégrées à l’accessibilité de la chromatine (DOGMA-seq6). Ces méthodes utilisent un marquage basé sur la transposase pour détecter l’accessibilité de la chromatine ou les modifications des histones.
Les approches basées sur la transposase clivent l’ADN génomique et ajoutent un code-barres ADN à la fin du fragment d’ADN génomique. Chaque fragment génomique clivé ne peut accepter que jusqu’à deux codes-barres ADN (= une marque épigénétique par site de clivage), et l’ADN génomique au site de clivage est perdu. Par conséquent, les approches basées sur le clivage ont un compromis entre le nombre de marques épigénétiques testées et la densité du signal. Cela entrave l’analyse de plusieurs marques épigénétiques dans la même cellule. Une méthode épigénomique unicellulaire qui ne clive pas l’ADN génomique a été développée pour surmonter ce problème 7,8.
En plus de la question dérivée du clivage mentionnée ci-dessus, les approches basées sur la transposase ont d’autres limites. Dans l’analyse de l’épigénome unicellulaire, il est essentiel de connaître l’emplacement des histones et des protéines associées à l’ADN sur le génome. Dans les approches actuelles, cela est accompli en utilisant des cellules uniques non fixées et en conservant les interactions protéine-ADN et protéine-protéine. Cependant, cela génère un fort biais vers les régions chromatiniques accessibles, même dans l’analyse des modifications des histones 9. L’emplacement des histones et des protéines associées au génome sur le génome peut être préservé sans réticulation protéine-ADN et protéine-protéine, à l’aide d’un échafaudage en polyacrylamide 7,8. Cette approche réduit le biais structurel observé dans les approches actuelles qui dépendent des interactions protéine-ADN et protéine-protéine.
Les approches basées sur la transposase ne peuvent acquérir des signaux qu’une seule fois à partir d’une seule cellule. Par conséquent, il est difficile de délimiter l’épigénome complet d’une seule cellule en raison de la chute des signaux. Des cellules uniques réutilisables ont été développées pour surmonter les limitations actuelles en permettant une analyse épigénomique itérative dans la même cellule unique.

<table><tbody><tr><td>10x tampon CutSmart</td><td>New England BioLabs</td><td>B6004</td><td>10x tampon de digestion</td></tr><tr><td>200 proof éthanol</td><td>Warner-Graham Company</td><td>200 proof</td><td>Ethanol</td></tr><tr><td>5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Anticorps monoclonal [HMC/4D9]</td><td>Epigentek</td><td>A-1018-100</td><td>Anti-5hmC</td></tr><tr><td>Acridine Orange/Propidium Iodide Stain</td><td>Logos Biosystems</td><td>F23001</td><td>Compteur de cellules</td></tr><tr><td>Solution d’acrylamide, 40 % dans H2O, pour la biologie moléculaire</td><td>MilliporeSigma</td><td>01697-500ML</td><td>Solution d’acrylamide à 40 %</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence tout-en-un BZ-X710</td><td>Keyence</td><td>BZ-X710</td><td>Microscope à balayage</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 Unité de filtre centrifuge</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC510024 Cassette</td><td>d’ultrafiltration</td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium pour la biologie</td> <td>moléculaireMilliporeSigma</td><td>A3678-100G</td><td>Poudre de persulfate d’ammonium</td></tr><tr><td>Anhydre DMF</td><td>Vector laboratories</td><td>S-4001-005</td><td>N,N-diméthylformamide anhydre (DMF)</td></tr><tr><td>Anti-ARN polymérase II CTD répétition YSPTSPS (phospho S5) anticorps [4H8]</td><td>Abcam</td><td>ab5408</td><td>Anti-Pol II</td></tr><tr><td>Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457)</td><td>anticorps Abcam</td><td>ab60950</td><td>Anti-Med1</td></tr><tr><td>BciVI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0596L</td><td>BciVI</td></tr><tr><td>Solution d’albumine sérique bovine, 20 mg/mL dans H2O, faible charge microbienne, sans protéase, pour la biologie moléculaire</td><td>MilliporeSigma</td><td>B8667-5ML</td><td>20 % BSA (Tableau 7)</td></tr><tr><td>Bst ADN polymérase, grand fragment</td><td>New England BioLabs</td><td>M0275L</td><td>Bst ADN polymérase</td></tr><tr><td>BT10 Series 10 &micro ; l Barrier Tip</td><td>NEPTUNE</td><td>BT10</td><td>P10 Pointe à faible rétention</td></tr><tr><td>CellCelector</td><td>Automated Lab Solutions</td><td>N/A</td><td>Robot automatisé de prélèvement de cellules uniques</td></tr><tr><td>CellCelector 4 nl nanopuits pour clonage de cellule unique, Plaque S200-100 100K, 24 puits, ULA</td><td>Automated Lab Solutions</td><td>CC0079</td><td>4 nL Plaque nanopuits</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>Chloroform</td></tr><tr><td>Corning Costar 96 puits, traité par culture cellulaire, microplaque à fond plat</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>Plaques à fond plat à 96 puits</td></tr> Deep <tr><td>Vent (exo-) ADN polymérase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0259L</td><td>Exo- ADN polymérase</td></tr><tr><td>ADN LoBind tubes, 0,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108035</td><td>0,5 mL ADN tube à faible liaison</td></tr><tr><td>ADN Oligo, 1ère amorce aléatoire</td><td>Technologies d’ADN intégrées</td><td>N/ A, voir Tableau 3</td><td>1ère amorce aléatoire</td></tr><tr><td>ADN Oligo, 2ème amorce aléatoire Cell#01</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, voir Tableau 3</td><td>2ème amorce aléatoire</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2ème amorce aléatoire Cell#02</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, voir Tableau 3</td><td>2ème amorce aléatoire</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2ème amorce aléatoire Cell#03</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, voir Tableau 3</td><td>2ème amorce aléatoire</td></tr><tr><td>Oligo d’ADN, 2ème amorce aléatoire Cell#04</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, voir Tableau 3</td><td>2ème amorce aléatoire</td></tr><tr><td>ADN Oligo, 2ème amorce aléatoire Cell#05</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, voir Tableau 3</td><td>2ème amorce aléatoire</td></tr><tr><td>ADN Oligo, 2ème amorce aléatoire Cell#06</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, voir Tableau 3</td><td>2ème amorce aléatoire</td></tr><tr><td>ADN Oligo, 2ème amorce aléatoire Cell#07</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, voir Tableau 3</td><td>2ème amorce aléatoire</td></tr><tr><td>ADN Oligo, 2ème amorce aléatoire Cell#08</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, voir Tableau 3</td><td>2ème amorce aléatoire</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2ème amorce aléatoire Cell#09</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, voir Tableau 3</td><td>2ème amorce aléatoire</td></tr><tr><td>ADN Oligo, 2ème amorce aléatoire Cell#10</td> Integrated <td>DNA Technologies</td><td>N/A, voir Tableau 3</td><td>2ème amorce aléatoire</td></tr><tr><td>ADN Oligo, 2ème amorce aléatoire Cell#11</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, voir Tableau 3</td><td>2ème amorce aléatoire</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2ème amorce aléatoire Cell#12</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, voir Tableau 3</td><td>2ème amorce aléatoire</td></tr><tr><td>ADN Oligo, 2ème amorce de synthèse</td> Integrated <td>DNA Technologies</td><td>N/A, voir Tableau 3</td><td>2ème amorce</td></tr> <tr><td>de synthèseOligo d’ADN, adaptateur de ligature</td><td>Technologies d’ADN intégrées</td><td>N/A, voir le tableau 3</td><td>Adaptateur de ligature</td></tr><tr><td>Oligo d’ADN, amorce de transcription</td><td>inverse Technologies d’ADN intégrées</td><td>N/A, voir le tableau 3</td><td>Amorce de transcription inverse</td></tr><tr><td>DNase I (sans RNase)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0303L</td><td>DNase I (sans RNase, 4 U).</td></tr><tr><td>Tampon de réaction DNase I</td><td>New England BioLabs</td><td>B0303S</td><td>10x tampon DNase I (NEB)</td></tr><tr><td>Mélange dNTP (10 mM chacun)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0192</td><td>10 mM dNTPs</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal, origine États-Unis, Millipore inactivé par la</td><td>chaleurSigma</td><td>F4135-500ML</td><td>Sérum de veau fœtal</td></tr><tr><td>HiScribe T7 Kit de synthèse d’ARN à haut rendement</td><td>New England BioLabs</td><td>E2040S</td> Master <td>mix de transcription in vitro</td></tr><tr><td>Anticorps Histone H3K27ac</td><td>Motif actif</td><td>39133</td><td>Anti-H3K27ac</td></tr><tr><td>Anticorps Histone H3K27me3</td><td>Motif actif</td><td>39155</td><td>Anti-H3K27me3</td></tr><tr><td>IgG du sérum de lapin</td><td>Millipore Sigma</td><td>I5006-10MG</td><td>Contrôle IgG</td></tr><tr><td>Nanopoudre magnétique d’oxyde de fer (II, III), taille moyenne des parties (TEM), ester NHS fonctionnalisé</td><td>MilliporeSigma</td><td>747467-1G</td><td>NHS ester fonctionnalisé 30 nm poudre d’oxyde de fer</td></tr><tr><td>K-562</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>cellules Acrylamide linéaire (5 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9520</td><td>Acrylamide linéaire</td></tr><tr><td>LUNA-FL Compteur de cellules à double fluorescence</td><td>Logos Biosystems</td><td>L20001</td><td>Compteur de cellules</td></tr><tr><td>LUNA Lames de comptage de cellules, 50 lames</td><td>Logos Biosystems</td><td>L12001</td><td>Compteur de cellules</td></tr><tr><td>Huile minérale, BioReagent, pour la biologie moléculaire, huile légère</td><td>MilliporeSigma</td><td>M5904-500ML</td><td>Huile minérale</td></tr><tr><td>N,N,N&prime ;,N&prime ;-Tétraméthyléthylènediamine pour la biologie moléculaire</td><td>MilliporeSigma</td><td>T7024-100ML</td><td>N,N,N&prime ;,N&prime ;-Tétraméthyléthylènediamine</td></tr><tr><td>NaCl (5 M), sans RNase</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9760G</td><td>5M NaCl</td></tr><tr><td>NanoDrop Lite</td><td>Thermo Fisher</td><td>2516</td><td>&nbsp ; Spectrophotomètre microvolume</td></tr><tr><td>NEST 2 mL Plaque de puits profond 96 puits, V Bottom</td><td>Opentrons</td><td>N/A</td><td>2 mL Plaque de puits profonds 96 puits</td></tr><tr><td>Plaque PCR 96 puits non jupe Genesee</td><td>Scientific</td><td>27-405</td><td>Plaque PCR 96 puits</td></tr><tr><td>NuSive GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td>Agarose</td></tr><tr><td>OmniPur Acrylamide : Bis-acrylamide 19:1, solution à 40 %</td><td>MilliporeSigma</td><td>1300-500ML</td><td>40 % Acrylamide/Bis-acrylamide</td></tr><tr><td>OT-2 Robot de laboratoire</td><td>Opentrons</td><td>OT2</td><td>Robot automatisé de manipulation</td></tr><tr><td>de liquides Paraformaldéhyde, grade EM, purifié, 20 % solution aqueuse</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15713</td><td>20 % Pararmaldéhyde</td></tr><tr><td>PBS (10x), pH 7,4</td><td>Thermo Fisher</td><td>70011044</td><td>10x PBS</td></tr><tr><td>PIPETMAN Classic P1000</td><td>GILSON</td><td>F123602</td><td>A Pipette P1000</td></tr><tr><td>Tubes Protein LoBind, 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>925000090</td><td>1,5 mL Tube à faible liaison protéinée</td></tr><tr><td>Kit d’extraction de gel QIAgen</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>A P1000 pipette</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay</td><td>Thermo Fisher</td><td>P11495</td><td>&nbsp ; Colorant intercalateur spécifique à l’ADNdb</td></tr><tr><td>Kit de ligature rapide</td><td>New England BioLabs</td><td>M2200L</td><td>T4 DNA ligase (NEB)</td></tr><tr><td>RNaseOUT Inhibiteur de la ribonucléase recombinante</td><td>Thermo Fisher</td> 10777019 <td>Inhibiteur de l’ARNase</td><td></td></tr><tr><td>S-4FB Réticulant (DMF-soluble)</td><td>Laboratoires de vecteurs</td><td>S-1004-105</td><td>Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB)</td></tr><tr><td>S-HyNic</td><td>Vector laboratories</td><td>S-1002-105</td><td>Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acétone hydrazone (S-HyNic)</td></tr><tr><td>Acétate de sodium, 3 M, pH 5,2, Biologie moléculaire Grade</td><td>MilliporeSigma</td><td>567422-100ML</td><td>3M Acétate de sodium (pH 5,2)</td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium, tampon 1M soln., pH 8,5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60408</td><td>Tampon de bicarbonate de sodium 1M, pH 8,5</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique pour la biologie moléculaire</td><td>MilliporeSigma</td><td>S3264-250G</td><td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique pour la biologie moléculaire</td><td>MilliporeSigma</td><td>S3139-250G</td><td>NaH2PO4</td></tr><tr><td>SuperScript IV Transcriptase inverse</td><td>Thermo Fisher</td><td>18090050</td><td>Transcriptase inverse</td></tr><tr><td>SYBR Or Acide nucléique Gel Colorant (concentré 10 000x dans DMSO)</td><td>Thermo Fisher</td><td>S11494</td><td>Un colorant intercalateur pour l’ADN</td></tr><tr><td>T4 Tampon de réaction de ligase d’ADN</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202S</td><td>10x Tampon de réaction d’ADN ligase T4</td></tr><tr><td>Pack de tampons de réaction ThermoPol</td><td>New England BioLabs</td><td>B9004S</td><td>10x tampon TPM-T (Tris-HCl/Chlorure de pottasium/Sulfate de magnésium/Triton X-100)</td></tr><tr><td>Réactif TRIzol LS</td><td>Thermo Fisher</td><td>10296-028</td><td>Extraction de thiocyanate-phénol-chloroforme de guanidinium</td></tr><tr><td>Kit de préparation de banque d’ADN TruSeq Nano</td><td>Illumina</td><td>20015965</td><td>Un kit de préparation de banque d’ADN (voir aussi les instructions du fabricant)</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, voir Tableau 3</td><td>Une sonde d’ADN modifiée aux amines pour anticorps</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, voir Tableau 3</td><td>Une sonde d’ADN modifiée aux amines pour anticorps</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, voir Tableau 3</td><td>Une sonde d’ADN modifié aux amines pour anticorps</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, voir Tableau 3</td><td>Une sonde d’ADN modifié aux amines pour anticorps</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, voir Tableau 3</td><td>Une sonde d’ADN modifié aux amines pour anticorps</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, contrôle IgG_Ab#001</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, voir tableau 3</td><td>Une sonde d’ADN modifiée aux amines pour le contrôle IgG</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td>0,5M EDTA, pH 8,0</td></tr><tr><td>Eau distillée sans DNase/RNase UltraPure</td><td>Thermo Fisher</td><td>10977023</td> Eau <td>ultrapure</td></tr><tr><td>Zeba Splin Colonnes de dessalage, 7K MWCO, 0,5 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>89882</td><td>Colonne de dessalage</td></tr></tbody></table>

cellule unique réutilisable pour des analyses épigénomiques itératives

Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses

Les analyses actuelles de l’épigénome unicellulaire sont conçues pour un usage unique. La cellule est éliminée après une seule utilisation, ce qui empêche l’analyse de plusieurs marques épigénétiques dans une seule cellule et nécessite des données provenant d’autres cellules pour distinguer le signal du bruit de fond expérimental dans une seule cellule. Cet article décrit une méthode permettant de réutiliser la même cellule unique pour des analyses épigénomiques itératives. 
Dans cette méthode expérimentale, les protéines cellulaires sont d’abord ancrées à un polymère polyacrylamide au lieu de les réticuler avec la protéine et l’ADN, atténuant ainsi les biais structurels. Cette étape critique permet des expériences répétées avec la même cellule unique. Ensuite, une amorce aléatoire avec une séquence d’échafaudage pour la ligature de proximité est recuite à l’ADN génomique, et la séquence génomique est ajoutée à l’amorce par extension en utilisant une ADN polymérase. Par la suite, un anticorps contre un marqueur épigénétique et des IgG témoins, chacun marqué avec des sondes ADN différentes, sont liés aux cibles respectives dans la même cellule unique. 
La ligature de proximité est induite entre l’amorce aléatoire et l’anticorps en ajoutant un ADN connecteur avec des séquences complémentaires à la séquence d’échafaudage de l’amorce aléatoire et à la sonde anticorps-ADN. Cette approche intègre l’information sur les anticorps et les séquences génomiques proches dans un seul produit d’ADN de ligature de proximité. En permettant des expériences répétées avec la même cellule unique, cette méthode permet une augmentation de la densité de données d’une cellule rare et une analyse statistique en utilisant uniquement des données d’IgG et d’anticorps provenant de la même cellule. Les cellules individuelles réutilisables préparées par cette méthode peuvent être stockées pendant au moins quelques mois et réutilisées ultérieurement pour élargir la caractérisation épigénétique et augmenter la densité des données. Cette méthode offre de la flexibilité aux chercheurs et à leurs projets.

Les cellules simples K562 ont été générées à l’aide du protocole décrit à l’étape 8 (voir la figure 5). Des cellules individuelles ont été intégrées dans la couche externe de la bille de polyacrylamide. L’ADN cellulaire a été coloré et visualisé à l’aide d’un colorant intercalateur pour la coloration de l’ADN.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63456/63456fig05.jpg"> Figure 5...

Le présent protocole décrit une méthode unicellulaire pour les analyses épigénomiques itératives utilisant une cellule unique réutilisable. La cellule unique réutilisable permet d’analyser plusieurs marques épigénétiques dans la même cellule unique et de valider statistiquement les résultats.

Cellule unique réutilisable pour des analyses épigénomiques itératives

Current single-cell epigenome analyses are designed for single use. The cell is discarded after a single use, preventing analysis of multiple epigenetic ...

Cette méthode expérimentale permet le stockage à long terme des cellules individuelles réutilisables pour les tests épigénomiques. Il permet également l’analyse de nombreuses marques épigénétiques et facteurs de transcription dans une même cellule. Dans les méthodes actuelles d’analyse épigénome unicellulaire, les mêmes cellules individuelles ne peuvent pas être réanalysées.Cependant, avec des cellules uniques réutilisables, les mêmes cellules individuelles peuvent être réanalysées plusieurs fois. Cette technique est utile pour le diagnostic et la conception de la thérapie épigénétique, en particulier lorsque les cellules des patients sont limitées en nombre. Cette méthode est la plus appropriée pour l’étude de l’épigénome, la régulation de l’expression génique et d’autres systèmes tant que des anticorps spécifiques pour les marques épigénétiques sont disponibles.Lorsque vous essayez cette technique pour la première fois, nous vous recommandons de vous entraîner sur des échantillons qui ne sont pas trop précieux et de valider l’expérience en utilisant un séquençage superficiel tel que MiSeq ou iSeq 100. Pour commencer, dans une hotte à flux laminaire propre, mélanger un millilitre de suspension cellulaire et 199 millilitres d’un PBS EDTA millimolaire contenant un colorant intercalateur pour l’ADN. Après mélange, transférer 200 microlitres de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à fond plat de 96 puits.Placez le couvercle sur la plaque à 96 puits et scannez-la à l’aide d’un microscope à balayage. Ensuite, inclinez la plaque et attendez quelques minutes jusqu’à ce que la cellule unique ait coulé jusqu’au bord inférieur du puits. Placez ensuite l’embout de la pipette dans le coin inférieur et transférez la cellule unique et le tampon dans un tube PCR.Vérifiez le puits à l’aide d’un microscope à fluorescence pour confirmer le transfert. Si une seule cellule est encore dans le puits, ajoutez 200 microlitres par puits d’un PBS d’EDTA millimolaire contenant un colorant intercalateur pour l’ADN et répétez le transfert. Après le transfert, placez un couvercle sur la plaque PCR à 96 puits et centrifugez la plaque à l’aide d’un rotor oscillant sans interruption.Après la centrifugation, placez la plaque sur le pont d’un robot de manutention automatique des liquides. Ensuite, faites glisser et déposez le code supplémentaire dans la fenêtre logicielle du robot de manipulation de liquide et exécutez le programme pour retirer 195 microlitres du surnageant avec une vitesse de pipetage très lente. Ajouter 50 microlitres d’huile 4% TEMED ou minérale et incuber la plaque pendant une nuit à température ambiante.Le lendemain, retirez l’huile minérale par pipetage et lavez les cellules cinq fois avec 200 microlitres de tampon négatif de magnésium TP. Après le dernier lavage, retirez le surnageant, ajoutez 15 microlitres de tampon de recuit et incuber sur de la glace pendant une heure. Après l’incubation, placez les tubes PCR sur un thermocycleur et chauffez à 94 degrés Celsius pendant trois minutes.Ensuite, transférez les tubes dans un bloc métallique refroidi à la glace et incuber pendant deux minutes. Ensuite, ajoutez quatre microlitres de sulfate de magnésium-chlorure de sodium, mélangez DNTP et mélangez en tourbillonnant à une vitesse maximale. Ajoutez ensuite un microlitre de gros fragment de BST polymérase, mélangez par vortex et incuber pendant quatre heures sur un agitateur.Après l’incubation, placez le tube PCR sur un thermocycleur et exécutez un programme de quatre heures ou de nuit comme décrit dans le texte. Pour la liaison des anticorps, ajoutez 1,625 microlitre de solution de chlorure de sodium EDTA BSA dans le tube. Mélanger en tourbillonnant à basse vitesse et incuber le tube sur de la glace pendant une heure.Ajoutez ensuite 0,1 microgramme par millilitre d’anticorps et contrôlez les IgG conjuguées à la sonde anticorps. Après avoir ajouté les anticorps, incuber les tubes sur de la glace en secouant doucement. Le lendemain, lavez les cellules deux fois avec 200 microlitres de tampon TPM-T sur de la glace.Ensuite, retirez le surnageant et lavez une fois avec le tampon ADN ligase T4. Ensuite, ajoutez 19 microlitres de solution d’adaptateur de ligature et incuber pendant une heure à 25 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez un microlitre d’ADN T4 ligase et mélangez le tube en tourbillonnant à vitesse moyenne.Placez le tube sur un thermocycleur et exécutez le programme de ligature de proximité. Après la course, lavez les cellules deux fois avec 200 microlitres de tampon positif EDTA négatif au magnésium BST et stockez les cellules pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, lavez les cellules deux fois avec 200 microlitres de tampon négatif EDTA négatif au magnésium BST et ajoutez 20 microlitres d’un mélange contenant de la BST, des DNTP et du sulfate de magnésium.Ensuite, mélangez avec un mélangeur vortex et incuber le tube pendant quatre heures sur un agitateur orbital. Après l’incubation, placez le tube sur un thermocycleur et exécutez le programme d’extension complet décrit dans le manuscrit textuel. Ensuite, pour une amplification par déplacement multiple, ajoutez 0,4 microlitre d’amorce aléatoire de 100 micromolaires secondes et mélangez par vortex.Ensuite, incuber le tube pendant deux heures sur un agitateur orbital avant de placer le tube sur un thermocycleur pour chauffer à 94 degrés Celsius. Après trois minutes, placez les tubes dans un bloc métallique refroidi à la glace et ajoutez un microlitre d’ADN polymérase BST. Vortex les tubes à vitesse lente.Placez ensuite les tubes sur un thermocycleur pour exécuter le programme d’amplification à déplacement multiple. Après le programme, transférez environ 20 microlitres de surnageant dans un tube PCR et stockez-le à moins 80 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 20 microlitres de tampon 0,05% TWEEN 20 et 0,1X TE à un tube PCR contenant la cellule unique réutilisable et incuber le tube pendant la nuit à quatre degrés Celsius.Le lendemain, récupérez le surnageant et combinez-le avec le surnageant collecté précédemment. Ensuite, faites tremper la cellule unique réutilisable et le tampon TBS contenant 50% de glycérol, cinq EDTA millimolaires, 0,5% BSA et 0,05% TWEEN 20, puis incuber pendant 30 minutes sur un agitateur orbital. Après l’incubation, conservez la cellule unique réutilisable à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit utilisée à nouveau.Enfin, ajoutez 40 microlitres de mélange principal négatif Exo et placez le tube sur un thermocycleur pour exécuter le programme tel que décrit dans le manuscrit. Des cellules individuelles réutilisables K562 ont été générées à l’aide de ce protocole. Des cellules individuelles ont été intégrées dans la couche externe de la bille de polyacrylamide et visualisées à l’aide d’un colorant intercalateur pour la coloration de l’ADN.Les produits d’ADN avant et après la digestion BciVI sont présentés ici. La digestion enzymatique de restriction a généré les fragments attendus de 19 à 20, 31 à 32, 49 et plus de 49 paires de bases. De plus, la banque d’ADN construite a été analysée par électrophorèse capillaire pour les produits souhaités.Les résultats du séquençage ont indiqué que les lectures cartographiées uniques de la lysine 27 acétylée anti-histone H3 et de la lysine triméthylée 27 anti-histone H3 étaient significativement plus nombreuses que celles des IgG témoins. Les signaux de séquençage REpi ont été évalués en comparant les données de séquençage REpi avec les données de séquençage ChIP en vrac. En moyenne, environ 91% des signaux de lysine 27 acétylée histones H3 provenant du séquençage REpi chevauchaient les pics de lysine 27 acétylée H-3 dans le séquençage ChIP en vrac.La précision du séquençage REpi pour la marque d’histones inactive, l’histone H3 triméthylée lysine 27 était de 52%La sensibilité du séquençage REpi a été analysée pour mesurer combien de pics de séquençage ChIP en vrac ont été détectés par les lectures reproduites de séquençage REpi. La sensibilité du séquençage REpi était de 55,30% dans l’histone H3 acétylée lysine 27 et de 50,94% dans l’histone H3 triméthylée lysine 27. Assurez-vous d’utiliser des réactifs sans DNS.En outre, toutes les opérations impliquant les fils du tube d’ouverture ou les fils de réactif doivent être effectuées dans une hotte propre. Les produits de l’ADN de cette procédure sont séquencés puis cartographiés au génome pour révéler quelles modifications d’histones sont présentes, dans quelles régions du génome dans des cellules individuelles. Cette technologie a permis d’analyser plusieurs marques épigénétiques dans la même cellule et a ouvert la voie à l’analyse multiomique dans n’importe quelle cellule.

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