Cellule unique réutilisable pour des analyses épigénomiques itératives

Cette méthode expérimentale permet le stockage à long terme des cellules individuelles réutilisables pour les tests épigénomiques. Il permet également l’analyse de nombreuses marques épigénétiques et facteurs de transcription dans une même cellule. Dans les méthodes actuelles d’analyse épigénome unicellulaire, les mêmes cellules individuelles ne peuvent pas être réanalysées.

Cependant, avec des cellules uniques réutilisables, les mêmes cellules individuelles peuvent être réanalysées plusieurs fois. Cette technique est utile pour le diagnostic et la conception de la thérapie épigénétique, en particulier lorsque les cellules des patients sont limitées en nombre. Cette méthode est la plus appropriée pour l’étude de l’épigénome, la régulation de l’expression génique et d’autres systèmes tant que des anticorps spécifiques pour les marques épigénétiques sont disponibles.

Lorsque vous essayez cette technique pour la première fois, nous vous recommandons de vous entraîner sur des échantillons qui ne sont pas trop précieux et de valider l’expérience en utilisant un séquençage superficiel tel que MiSeq ou iSeq 100. Pour commencer, dans une hotte à flux laminaire propre, mélanger un millilitre de suspension cellulaire et 199 millilitres d’un PBS EDTA millimolaire contenant un colorant intercalateur pour l’ADN. Après mélange, transférer 200 microlitres de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à fond plat de 96 puits.

Placez le couvercle sur la plaque à 96 puits et scannez-la à l’aide d’un microscope à balayage. Ensuite, inclinez la plaque et attendez quelques minutes jusqu’à ce que la cellule unique ait coulé jusqu’au bord inférieur du puits. Placez ensuite l’embout de la pipette dans le coin inférieur et transférez la cellule unique et le tampon dans un tube PCR.

Vérifiez le puits à l’aide d’un microscope à fluorescence pour confirmer le transfert. Si une seule cellule est encore dans le puits, ajoutez 200 microlitres par puits d’un PBS d’EDTA millimolaire contenant un colorant intercalateur pour l’ADN et répétez le transfert. Après le transfert, placez un couvercle sur la plaque PCR à 96 puits et centrifugez la plaque à l’aide d’un rotor oscillant sans interruption.

Après la centrifugation, placez la plaque sur le pont d’un robot de manutention automatique des liquides. Ensuite, faites glisser et déposez le code supplémentaire dans la fenêtre logicielle du robot de manipulation de liquide et exécutez le programme pour retirer 195 microlitres du surnageant avec une vitesse de pipetage très lente. Ajouter 50 microlitres d’huile 4% TEMED ou minérale et incuber la plaque pendant une nuit à température ambiante.

Le lendemain, retirez l’huile minérale par pipetage et lavez les cellules cinq fois avec 200 microlitres de tampon négatif de magnésium TP. Après le dernier lavage, retirez le surnageant, ajoutez 15 microlitres de tampon de recuit et incuber sur de la glace pendant une heure. Après l’incubation, placez les tubes PCR sur un thermocycleur et chauffez à 94 degrés Celsius pendant trois minutes.

Ensuite, transférez les tubes dans un bloc métallique refroidi à la glace et incuber pendant deux minutes. Ensuite, ajoutez quatre microlitres de sulfate de magnésium-chlorure de sodium, mélangez DNTP et mélangez en tourbillonnant à une vitesse maximale. Ajoutez ensuite un microlitre de gros fragment de BST polymérase, mélangez par vortex et incuber pendant quatre heures sur un agitateur.

Après l’incubation, placez le tube PCR sur un thermocycleur et exécutez un programme de quatre heures ou de nuit comme décrit dans le texte. Pour la liaison des anticorps, ajoutez 1,625 microlitre de solution de chlorure de sodium EDTA BSA dans le tube. Mélanger en tourbillonnant à basse vitesse et incuber le tube sur de la glace pendant une heure.

Ajoutez ensuite 0,1 microgramme par millilitre d’anticorps et contrôlez les IgG conjuguées à la sonde anticorps. Après avoir ajouté les anticorps, incuber les tubes sur de la glace en secouant doucement. Le lendemain, lavez les cellules deux fois avec 200 microlitres de tampon TPM-T sur de la glace.

Ensuite, retirez le surnageant et lavez une fois avec le tampon ADN ligase T4. Ensuite, ajoutez 19 microlitres de solution d’adaptateur de ligature et incuber pendant une heure à 25 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez un microlitre d’ADN T4 ligase et mélangez le tube en tourbillonnant à vitesse moyenne.

Placez le tube sur un thermocycleur et exécutez le programme de ligature de proximité. Après la course, lavez les cellules deux fois avec 200 microlitres de tampon positif EDTA négatif au magnésium BST et stockez les cellules pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, lavez les cellules deux fois avec 200 microlitres de tampon négatif EDTA négatif au magnésium BST et ajoutez 20 microlitres d’un mélange contenant de la BST, des DNTP et du sulfate de magnésium.

Ensuite, mélangez avec un mélangeur vortex et incuber le tube pendant quatre heures sur un agitateur orbital. Après l’incubation, placez le tube sur un thermocycleur et exécutez le programme d’extension complet décrit dans le manuscrit textuel. Ensuite, pour une amplification par déplacement multiple, ajoutez 0,4 microlitre d’amorce aléatoire de 100 micromolaires secondes et mélangez par vortex.

Ensuite, incuber le tube pendant deux heures sur un agitateur orbital avant de placer le tube sur un thermocycleur pour chauffer à 94 degrés Celsius. Après trois minutes, placez les tubes dans un bloc métallique refroidi à la glace et ajoutez un microlitre d’ADN polymérase BST. Vortex les tubes à vitesse lente.

Placez ensuite les tubes sur un thermocycleur pour exécuter le programme d’amplification à déplacement multiple. Après le programme, transférez environ 20 microlitres de surnageant dans un tube PCR et stockez-le à moins 80 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 20 microlitres de tampon 0,05% TWEEN 20 et 0,1X TE à un tube PCR contenant la cellule unique réutilisable et incuber le tube pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

Le lendemain, récupérez le surnageant et combinez-le avec le surnageant collecté précédemment. Ensuite, faites tremper la cellule unique réutilisable et le tampon TBS contenant 50% de glycérol, cinq EDTA millimolaires, 0,5% BSA et 0,05% TWEEN 20, puis incuber pendant 30 minutes sur un agitateur orbital. Après l’incubation, conservez la cellule unique réutilisable à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit utilisée à nouveau.

Enfin, ajoutez 40 microlitres de mélange principal négatif Exo et placez le tube sur un thermocycleur pour exécuter le programme tel que décrit dans le manuscrit. Des cellules individuelles réutilisables K562 ont été générées à l’aide de ce protocole. Des cellules individuelles ont été intégrées dans la couche externe de la bille de polyacrylamide et visualisées à l’aide d’un colorant intercalateur pour la coloration de l’ADN.

Les produits d’ADN avant et après la digestion BciVI sont présentés ici. La digestion enzymatique de restriction a généré les fragments attendus de 19 à 20, 31 à 32, 49 et plus de 49 paires de bases. De plus, la banque d’ADN construite a été analysée par électrophorèse capillaire pour les produits souhaités.

Les résultats du séquençage ont indiqué que les lectures cartographiées uniques de la lysine 27 acétylée anti-histone H3 et de la lysine triméthylée 27 anti-histone H3 étaient significativement plus nombreuses que celles des IgG témoins. Les signaux de séquençage REpi ont été évalués en comparant les données de séquençage REpi avec les données de séquençage ChIP en vrac. En moyenne, environ 91% des signaux de lysine 27 acétylée histones H3 provenant du séquençage REpi chevauchaient les pics de lysine 27 acétylée H-3 dans le séquençage ChIP en vrac.

La précision du séquençage REpi pour la marque d’histones inactive, l’histone H3 triméthylée lysine 27 était de 52%La sensibilité du séquençage REpi a été analysée pour mesurer combien de pics de séquençage ChIP en vrac ont été détectés par les lectures reproduites de séquençage REpi. La sensibilité du séquençage REpi était de 55,30% dans l’histone H3 acétylée lysine 27 et de 50,94% dans l’histone H3 triméthylée lysine 27. Assurez-vous d’utiliser des réactifs sans DNS.

En outre, toutes les opérations impliquant les fils du tube d’ouverture ou les fils de réactif doivent être effectuées dans une hotte propre. Les produits de l’ADN de cette procédure sont séquencés puis cartographiés au génome pour révéler quelles modifications d’histones sont présentes, dans quelles régions du génome dans des cellules individuelles. Cette technologie a permis d’analyser plusieurs marques épigénétiques dans la même cellule et a ouvert la voie à l’analyse multiomique dans n’importe quelle cellule.