Normalisation et maintenance des cultures organoïdes hépatiques et intestinales canines 3D pour une utilisation dans la recherche biomédicale

Les protocoles pour la culture d’organoïdes hépatiques et intestinaux canins sont importants pour normaliser cette nouvelle technologie. Cette technique permet l’établissement fiable et reproductible de la culture organoïde canine, y compris l’isolement organoïde, l’entretien, le prélèvement et la biobanque ultérieure des échantillons. Les organoïdes canins peuvent fournir un excellent modèle pour de nombreuses applications allant de la biologie, du développement de maladies infectieuses, du dépistage et de la découverte de médicaments, ainsi que de la médecine de transmission.

Pour commencer, préparez cinq tubes centrifuges de 15 millilitres avec cinq millilitres de solution chélatante complète 1X, un tube avec trois millilitres de solution chélatante complète 1X, un tube vide et un tube avec cinq millilitres de 1X solution chélatante complète et deux millilitres de sérum bovin fœtal. Le jour de l’isolement, placez une boîte de Petri stérile, un scalpel, un seau à glace et un mélange de nutriments DMEM avancé froid F12 dans l’armoire de biosécurité. Placez le nombre requis de plaque de culture cellulaire de 24 puits dans l’incubateur à dioxyde de carbone pour préchauffer.

Placez la matrice de membrane extracellulaire solubilisée sur la glace pour la décongélation. Pré-refroidir la centrifugeuse à quatre degrés Celsius. Déplacez le support complet avec des facteurs de croissance du congélateur vers un bain-marie de 37 degrés Celsius en évitant l’exposition directe à la lumière.

Agiter les échantillons de tissus dans le tube de transport pendant 30 secondes. Enlevez l’excès de surnageant sans jeter de tissu en pipetant lentement près de la surface du liquide jusqu’à ce qu’il reste 0,5 millilitre dans le tube. Transférer le tissu et le surnageant restant dans une boîte de Petri stérile.

À l’aide d’un scalpel jetable, coupez et hachez le tissu en plus petits morceaux ressemblant à une consistance de purée pendant environ cinq minutes. Pipeter le tissu haché avec du liquide de la boîte de Petri dans le premier tube de solution chélatante complète, puis ajouter deux millilitres de mélange nutritif DMEM avancé F12 à la boîte de Pétri. Rincer le tissu restant et transférer dans le premier tube de solution chélatante complète.

Vortex le tube de solution chélatante complète 1X environ cinq fois pendant cinq secondes. Laissez les biopsies se déposer au fond du tube pendant une minute et retirez le surnageant jusqu’à ce qu’il reste cinq millilitres. Transférer la solution chélatante complète 1X du nouveau tube vers le tube d’échantillonnage.

Répétez l’étape précédente pour les deux tubes suivants. Et lors des deux derniers lavages, retirez le surnageant jusqu’à trois millilitres restant dans le tube. Transférer les biopsies et la solution chélatante complète 1X du tube d’échantillonnage à un puits d’une plaque de six puits.

Ajouter trois millilitres de solution chélatante complète 1X au tube d’échantillonnage. Tourbillonnez doucement pour recueillir tout tissu restant et transférez-le dans le même puits de la plaque. Ajouter 150 microlitres d’acide tétraacétique d’éthylène diamine 0,5 molaire dans un puits et placer la plaque de six puits sur une bascule à 20 degrés 24 tr/min à quatre degrés Celsius.

Incuber les échantillons de foie pendant 10 minutes et les échantillons intestinaux pendant une heure sur la bascule en mouvement. Transportez la plaque à six puits jusqu’à l’armoire de biosécurité et transférez le tissu haché et le liquide dans un tube contenant 1 fois une solution chélatante complète avec du sérum bovin fœtal. Laissez les tissus se déposer et transporter le surnageant avec 0,2 millilitre de la partie supérieure du tissu vers un tube vide.

Faites tourner le tube contenant l’échantillon à 700 XG pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Les cellules souches sont maintenant entassées avec le tissu haché. Retirez et jetez soigneusement le surnageant pour ne pas déranger la pastille.

Remettez en suspension la pastille dans le DMEM F12 avancé. Faites tourner à nouveau le tube et aspirez le surnageant sans perturber la pastille. Ajouter le volume calculé de matrice de membrane extracellulaire solubilisée au tube d’échantillonnage.

Soyez prudent lorsque vous retirez le média afin de ne pas perdre la pastille cellulaire. Lors de l’ajout d’une matrice membranaire extracellulaire, pipettez lentement pour ne pas créer de bulles excessives dans la suspension organoïde. Conservez l’échantillon avec la matrice de membrane extracellulaire solubilisée sur de la glace et ensemencez la suspension au milieu des puits afin que la matrice de membrane extracellulaire solubilisée forme une structure en forme de dôme.

Transportez la plaque vers un incubateur et laissez la matrice de membrane extracellulaire solubilisée se solidifier pendant 30 minutes. Mélangez l’inhibiteur de ROCK et GSK3 bêta dans un milieu complet avec des facteurs de croissance et ajoutez 500 microlitres de cette solution à chaque puits. Placez la plaque dans l’incubateur.

Le protocole organoïde canin génère généralement environ 50 000 à 150 000 cellules intestinales ou hépatiques par puits. Après l’isolement des cellules souches, les organoïdes canins hépatiques commencent leur cycle de vie en tant que sphéroïdes en expansion, et après sept jours, ils se transforment en organoïdes bourgeonnants et différenciants. Le volume, la surface, la surface, la zone d’ellipse 2D et la circonférence des sphéroïdes ont été calculés.

La zone d’ellipse 2D et la circonférence ont été utilisées pour évaluer la santé de la culture organoïde. L’évaluation de l’expression des marqueurs de manière semi-quantitative a montré que les sphéroïdes exprimaient préférentiellement le marqueur cholangiocyte KRT7 allant de un à 26%L’expression du marqueur de cellules souches LGR5 variait entre 0,17 et 0,78%, tandis que les marqueurs hépatocytaires étaient exprimés dans une moindre mesure à 0,05 à 0,34% pour la boîte fourche 1A et de 0,03 à 0,28% pour le cytochrome-P450. Une incubation de 12 minutes avec de la protéase de type trypsine n’a pas inhibé la croissance organoïde.

Cependant, la croissance des organoïdes a été affectée négativement en utilisant une incubation de 24 minutes. La capacité de survie des organoïdes hépatiques canins dans un environnement défavorable a été analysée pour déterminer le volume de milieux organoïdes et de matrice sous-jacente nécessaires à la croissance et à la survie réussies des organoïdes hépatiques. Le taux de survie des organoïdes variait de 12,9 jours à 18 jours.

Les techniques de culture cellulaire de base et les approches aseptiques sont les conditions préalables essentielles à l’isolement et au maintien appropriés des organoïdes.