Transplantation de microglies dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans le cerveau de souris immunocompétentes par voie transnasale non invasive
31 mai 2022
Le protocole présenté ici permet la transplantation de microglies humaines induites dérivées de cellules souches pluripotentes (iPSMG) dans le cerveau par voie transnasale chez des souris immunocompétentes. La méthode de préparation et de transplantation transnasale de cellules et l’administration d’un mélange de cytokines pour le maintien de l’iPSMG est présentée.
Ce protocole permet une transplantation non invasive d’iPSMG dans le cerveau immunocompétent de souris en combinant l’activation / désactivation pharmacologique d’un antagoniste du récepteur CSF1 PLX5622 avec une transplantation transnasale. Le principal avantage de cette technique est que l’iPSMG peut être transplanté sans induire de lésions cérébrales, même chez les souris immunocompétentes. La transplantation microgliale peut servir de thérapie potentielle pour échanger des microglies dysfonctionnelles avec des microglies fonctionnelles dans diverses maladies neurodégénératives à l’avenir.
Bijay Parajuli, un chercheur de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Commencez par décongeler rapidement les cellules microgliales humaines dérivées de cellules souches pluripotentes induites congelées dans un bain-marie de 37 degrés Celsius. Faites tourbillonner les échantillons jusqu’à ce que toute la glace visible ait fondu.
Ajouter l’iPSMG décongelé au milieu de culture, réchauffé à 37 degrés Celsius. Ajouter un millilitre de cellules à 10 millilitres de milieux de culture. Centrifugez les cellules à 300 fois g pendant cinq minutes pour obtenir une pastille de cellule.
Retirez le surnageant sans perturber la pastille cellulaire. Ajouter le milieu de transplantation pour obtenir une concentration cellulaire de 10 à la cinquième cellule par microlitre. Placez l’iPSMG sur la glace et procédez immédiatement à la transplantation.
Pour préparer les souris à la transplantation transnasale, nourrissez les souris mâles avec un régime contenant du PLX pendant sept jours. À la fin du septième jour, cessez le régime PLX et nourrissez les souris avec un régime normal. Une heure avant la transplantation transnasale d’iPSMG, administrer 2,5 microlitres de hyaluronidase dans le PBS à chaque narine deux fois à l’aide d’une pointe de pipette de 10 microlitres pour augmenter la perméabilité à la muqueuse nasale.
Placez les souris en position couchée après l’application de hyaluronidase. Administrer 2,5 microlitres de hyaluronidase dix minutes avant la transplantation transnasale d’iPSMG. Appliquez 2,5 microlitres de suspension cellulaire dans une narine de la souris à l’aide d’une pointe de pipette de 10 microlitres.
Placez la souris en position couchée pendant cinq minutes avant d’administrer une suspension cellulaire à l’autre narine. Administrer la suspension cellulaire quatre fois, en appliquant un volume total de 20 microlitres par animal. 48 heures après l’arrêt de l’alimentation PLX, répétez l’administration de hyaluronidase et de suspension cellulaire sur les mêmes souris.
Pour l’administration de cytokines, appliquer 2,5 microlitres du milieu de transplantation dans une narine de la souris à l’aide d’une pointe de pipette de 10 microlitres. Après deux mois de transplantation transnasale, le nombre de cellules transplantées peut être déterminé en comptant les cellules positives pour les marqueurs spécifiques à l’homme et panmicrogliaux. Les microglies endogènes de souris sont positives pour le marqueur pan-microglial uniquement.
Chez les souris témoins, seules des microglies de souris ont été détectées dans le cortex et l’hippocampe. Dans le cortex des souris transplantées iPSMG, seules des microglies de souris ont été détectées, tandis que dans l’hippocampe, des iPSMG ont été détectées. Lors de la tentative de ce protocole, l’élimination complète du surnageant est essentielle pour prévenir la dilution des cytokines.
Il est crucial d’appliquer des cytokines toutes les 12 heures pour la viabilité des cellules transplantées. L’épuisement de la microglie endogène de la souris est nécessaire pour la transplantation d’iPSMG. Cette procédure permet la transplantation d’iPSMG dans un cerveau de souris normal ou malade.
Ainsi, la caractéristique de l’iPSMG ainsi que la réponse à la maladie peuvent être déterminées. Cette technique est appropriée pour déterminer la caractéristique in vivo de l’iPSMG dans le cerveau de la souris. Ainsi, la transplantation d’iPSMG dans des souris modèles de maladie nous aidera à comprendre la réponse et pourrait ouvrir la voie à une nouvelle cible thérapeutique.
Aperçu
Cette étude présente une méthode non invasive pour la transplantation de microglies humaines dérivées de cellules souches pluripotentes induites (iPSMG) dans le cerveau de souris immunocompétentes par voie transnasale. Le protocole exploite l'administration de cytokines et la suppression des microglies endogènes afin de permettre une intégration efficace des iPSMG, ouvrant potentiellement la voie à des approches thérapeutiques dans les maladies neurodégénératives.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Recherche sur les cellules souches
- Biologie des microglies
Contexte
- Les cellules souches pluripotentes induites peuvent être différenciées en microglies fonctionnelles.
- Un dysfonctionnement microglial est impliqué dans diverses maladies neurodégénératives.
- La délivrance transnasale représente une approche novatrice pour la transplantation cellulaire.
- L'administration de cytokines est cruciale pour la viabilité cellulaire après la transplantation.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode de transplantation non invasive des microglies.
- Évaluer la faisabilité d'une administration transnasale pour maintenir une fonction cérébrale normale.
- Évaluer le potentiel des iPSMG à remplacer les microglies dysfonctionnelles.
Méthodes utilisées
- La méthode principale repose sur la transplantation transnasale de cellules iPSMG chez des souris immunocompétentes.
- Les souris mâles ont été prétraitées par un antagoniste du récepteur du CSF1, le PLX5622, et par une solution d'hyaluronidase afin d'augmenter la perméabilité nasale.
- Les suspensions cellulaires ont été administrées en plusieurs doses selon des calendriers précis pour assurer une intégration adéquate.
- Le suivi post-transplantation consistait à évaluer la présence et la viabilité des cellules transplantées.
Résultats principaux
- Les iPSMG transplantées se sont intégrées avec succès dans l'hippocampe de la souris sans endommager les microglies endogènes.
- L'administration de cytokines toutes les 12 heures a été essentielle pour maintenir la viabilité cellulaire après la transplantation.
- Cette méthode permet d'examiner les réponses des iPSMG dans des modèles tant sains que pathologiques.
Conclusions
- Ce protocole facilite l'étude des iPSMG in vivo, ce qui pourrait orienter les futures thérapies géniques pour les maladies neurodégénératives.
- Comprendre le comportement des microglies transplantées permet de préciser leur rôle dans la santé cérébrale.
- Cette approche pourrait ouvrir la voie à de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des pathologies liées aux microglies.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La transplantation non invasive de microglies dérivées de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC) dans des cerveaux de souris immunocompétentes permet l'étude directe in vivo de la fonction microgliale humaine et de la réponse aux maladies. Cette approche comble les écarts translationnels entre les microglies des rongeurs et celles de l'humain, soutenant ainsi des modèles précliniques plus prédictifs pour la recherche sur les maladies neurodégénératives. Le protocole améliore la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques aux étapes précoces de la découverte et aux points critiques précliniques.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'interrogation in vivo de la biologie des microglies humaines dans un environnement cérébral de mammifère.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en distinguant les réponses spécifiques aux microglies humaines de celles des modèles murins.
- Permet la validation fonctionnelle des cibles pour les voies de neuroinflammation et de neurodégénérescence.
Développement de criblages et de tests
- Offre un système validé permettant d'évaluer l'intégration et la viabilité des microglies humaines in vivo.
- Permet une quantification reproductible des microglies transplantées par rapport aux microglies endogènes à l'aide de marqueurs spécifiques.
- Facilite le criblage en aval de composés ciblant la fonction des microglies humaines dans un contexte physiologique.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les modèles précliniques avec la pertinence des maladies humaines en incorporant des microglies humaines dans des cerveaux de souris.
- Permet l'évaluation de la réponse microgliale humaine chez des souris saines et dans des modèles de maladies.
- Améliore la confiance prédictive pour la découverte de biomarqueurs translationnels et la validation d'hypothèses thérapeutiques.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce protocole fait le lien entre la découverte précoce et la recherche préclinique en permettant des études fonctionnelles des microglies humaines in vivo, soutenant ainsi l'identification de candidats thérapeutiques prometteurs et la continuité translationnelle.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses sur les rôles des microglies humaines dans la physiologie et la pathologie cérébrales.
- Tri : Fournit des mesures quantitatives de l'intégration cellulaire et de la viabilité après transplantation.
- Analyse : Permet une discrimination fondée sur des marqueurs entre les microglies humaines et murines afin d'obtenir une analyse de données fiable.
- Recherche translationnelle : Facilite la modélisation pertinente de maladies par transplantation de microglies dérivées de cellules souches induites (iPSMG) chez des souris modèles de maladie.
- Réutilisation à grande échelle : Met en place une plateforme réutilisable pour évaluer la fonction des microglies humaines dans divers contextes pathologiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté liée à l'espèce dans la recherche sur la neuroinflammation.
- Valeur opérationnelle : Normalise les protocoles de délivrance et de quantification cellulaires non invasifs afin d'assurer la reproductibilité entre études.
- Valeur stratégique : Permet de prendre des décisions plus éclairées quant au passage ou non à l'étape suivante pour les thérapeutiques ciblant les microglies, en fournissant des données pertinentes pour l'humain.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation ajustée au risque des programmes sur les maladies neurodégénératives en améliorant la fidélité des modèles.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture de cellules souches pluripotentes induites, en différenciation microgliale et en techniques de transplantation in vivo.
- Suppose l'accès à des agents pharmacologiques permettant l'élimination des microglies endogènes et le soutien par cytokines.
- Exige des protocoles standardisés pour la préparation cellulaire, la transplantation et l'analyse post-transplantation.
- L'adaptation à d'autres systèmes modèles peut nécessiter une optimisation des paramètres de délivrance et d'élimination.
- L'administration continue de cytokines est essentielle à la viabilité des cellules transplantées, comme le confirme le protocole.
