Déchiffrer l’organisation de la chromatine 3D haute résolution via Capture Hi-C

Capture Hi-C permet de déchiffrer l’organisation 3D de la chromatine de la région génomique d’intérêt de la taille d’une mégabase à haute résolution. Avec Capture Hi-C, une résolution et une spécificité allèle plus élevées sont obtenues tout en améliorant l’efficacité temporelle et l’abordabilité de la technique. L’application de Capture IC à différents systèmes modèles, types de cellules et paysages de chromatine régulés par le développement dans des conditions de santé et pathologiques est susceptible de faciliter notre compréhension de l’interaction entre la topologie du génome et la régulation des gènes.

Pour commencer, tryphtoniser et compter les cellules de la plaque de contrôle préparées spécifiquement pour le comptage des cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Inclure la coloration de viabilité pour déterminer le pourcentage de cellules viables. À partir de ce nombre de cellules, estimer le nombre total de cellules dans la plaque préparée pour la réticulation.

Retirer le milieu de culture des plaques préparées pour la réticulation et le remplacer par la solution de fixation. Fixer pendant 10 minutes à température ambiante sous un mélange doux sur un shaker. Éteindre la réaction fixe en ajoutant 2,5 molaires de glycine PBS à une concentration finale de 0,125 molaire.

Ajouter 530 microlitres de 2,5 molaires de glycine PBS à 10 millilitres dans une assiette de 10 centimètres. Incuber pendant cinq minutes à température ambiante, en mélangeant doucement sur un agitateur. Transférer les plaques dans de la glace et incuber pendant 15 minutes supplémentaires sur de la glace tout en mélangeant doucement sur un agitateur.

Retirez la solution de fixation des cellules en la versant dans un bécher pour assurer une manipulation rapide. Rincez rapidement la plaque de 10 centimètres deux fois avec cinq millilitres de glycine molaire froide PBS 0,125 molaire pour éliminer les débris et les cellules mortes. Retirez le liquide de la plaque en le versant dans un bécher pour assurer une manipulation rapide.

Ajouter cinq millilitres de glycine froide 0,125 molaire PBS à la plaque de 10 centimètres. Et grattez rapidement les cellules de la plaque à l’aide d’un grattoir de cellules en plastique. Transférer la suspension cellulaire dans un tube centrifuge conique pré-refroidi de 50 millilitres à l’aide d’une pipette sérologique.

Rincez la plaque deux fois avec cinq millilitres de PBS glycine molaire 0,125 molaire froid et ajoutez la suspension cellulaire au tube centrifuge conique. Faites tourner vers le bas à 480 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant en l’aspirant à l’aide d’un système d’aspiration de paillasse.

Remettez en suspension les cellules et aliquote 500 microlitres de la suspension cellulaire dans le nombre calculé de microtubes à centrifuger de 1,5 millilitre. Faire tourner à 480 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et stocker les granulés de cellules sèches à 80 degrés Celsius. Pour la lyse cellulaire, décongelez les granulés congelés sur de la glace.

Préparez 1,5 millilitre de tampon de lyse dans de l’eau. Ajouter 600 microlitres du tampon de lyse froide et bien remettre en suspension sur de la glace. Faites tourner à 2 655 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et retirez le surnageant à l’aide d’un système d’aspiration de paillasse.

Resuspendre dans 100 microlitres de FDS à 0,5%. Après l’incubation à 62 degrés Celsius tourbillonnant à 1400 RPM pendant 10 minutes, ajoutez 290 microlitres d’eau plus 50 microlitres de Triton X 100% 100 et mélangez bien, en évitant les bulles d’air. Incuber à 37 degrés Celsius en tourbillonnant à 1400 RPM pendant 10 minutes avant d’ajouter 50 microlitres de tampon de tube DPN 10 X et retourner le tube pour mélanger.

Prenez 50 microlitres d’ADN non digéré pour le contrôle de la qualité dans un tube séparé. N’oubliez pas de prélever l’échantillon témoin non digéré. Pour la digestion DPN2, ajoutez 10 microlitres de DPN2 à haute concentration et mélangez en inversant.

Incuber les échantillons et le témoin non digéré dans un mélangeur thermique à 37 degrés Celsius, tourbillonnant à 1400 rotations par minute pendant plus de quatre heures. Pour la ligature et l’inversion de la réticulation, prenez 50 microlitres de l’ADN digéré ligaturé pour le contrôle de la qualité dans un tube séparé. Conservez les contrôles non digérés et non ligaturés à 20 degrés Celsius.

Ajouter 800 microlitres de cocktail de ligature. Incuber à 16 degrés Celsius, tourbillonnant à 1000 rotations par minute pendant la nuit. Pour la purification de l’ADN, transférer les échantillons sur de la glace dans des tubes centrifuges coniques pré-refroidis de 15 millilitres et ajouter deux millilitres d’eau, 10,5 millilitres d’éthanol glacé et 583 microlitres d’acétate de sodium à trois molaires.

Ajoutez 200 microlitres d’éthanol glacé, 10,8 microlitres d’acétate de sodium et un microlitre de coprécipitant aux contrôles de qualité non digérés et ligaturés. Incuber à moins 80 degrés Celsius pendant au moins quatre heures jusqu’à la nuit. Faites tourner les tubes de 15 millilitres à 2200 G à quatre degrés Celsius pendant 45 minutes.

Prélever délicatement l’éthanol et sécher à l’air libre les échantillons et les témoins à température ambiante pendant 10 à 15 minutes. Ne pas trop sécher. Remettez les échantillons et les témoins en suspension dans 100 microlitres et 20 microlitres d’eau, respectivement.

Pour le contrôle de la qualité de la préparation du gabarit 3C, chargez 100 à 200 nanogrammes de chaque échantillon et de chaque contrôle sur un gel agros 1XTBE à 1%. Ensuite, pour effectuer l’enrichissement de la cible pour le séquençage multiplex d’extrémité épurée, prenez quatre microgrammes de matrice 3C, resuspendez-le dans 130 microlitres d’eau pour chaque réaction de capture. Soniquer l’échantillon et continuer la préparation avec trois microgrammes d’ADN cisaillé.

Pour hybrider les échantillons d’ADN préparés aux sondes d’ARN spécifiques à la cible, utilisez 750 nanogrammes d’échantillons d’ADN dans un volume final de 3,4 microlitres, ce qui donne une concentration initiale de 221 nanogrammes par microlitre. Utilisez la concentration de vide de vitesse si nécessaire pour atteindre le volume final de 3,4 microlitres. Pour les échantillons remis en suspension dans 10 microlitres, 15 à 20 minutes de concentration suffisent.

Incuber le mélange d’hybridation pendant 16 à 18 heures à 65 degrés Celsius avec un couvercle chauffé à 105 degrés Celsius, selon les instructions du fabricant. Pour capturer les fragments de ligature ciblés, ajouter du streptivide dans des billes couplées à l’échantillon hybridé de la sonde. Enfin, pour préparer les échantillons au séquençage multiplexe, poursuivre le protocole selon le système d’enrichissement cible utilisé dans cette étude pour le séquençage apparié et multiplexé.

La résolution de la carte d’interaction Capture Hi-C permet l’identification de deux domaines plus petits dans le Tsix-tad qui contient le promoteur du locus Tsix. Cela n’avait pas été réalisé auparavant avec 5C. De plus, d’autres structures sous-ténules, telles que les boucles de contact, sont clairement visibles à partir des données Capture Hi-C, telles que la boucle entre Xist et FTX, précédemment identifiée avec Capture C et la boucle entre Xist et Xert récemment identifiée à l’aide d’un protocole similaire pour Capture Hi-C.

D’autres contacts peuvent également être cartographiés plus précisément en raison de la résolution accrue des profils Capture Hi-C, tels que ceux formant les points chauds de contact connus dans le Tsix-tad entre les loci Linx, Chic1 et Xite. En comparaison avec les données Hi-C affichées, Capture Hi-C a permis de multiplier par quatre la résolution, mais il n’a nécessité qu’un quart de la profondeur de séquençage. Il est très important de ne pas oublier de prendre 50 microlitres d’échantillons d’ADN non digérés et non ligaturés comme contrôle de qualité pour la préparation du modèle 3C.