Création d’une articulation du genou sur puce pour modéliser les maladies articulaires et tester des médicaments

Notre capacité à prédire avec précision comment les humains répondent aux médicaments pendant les essais cliniques est limitée en raison du manque de modèles précliniques physiologiquement pertinents. Ce système microphysiologique peut remédier à cette disparité. Ce système dérivé de cellules humaines imite avec précision toute la nature de la maladie articulaire de l’arthrose dans le genou humain, ce qui permet de tester des médicaments modificateurs de la maladie contre l’arthrose avant les essais cliniques, ce qui pourrait permettre d’économiser des millions de dollars.

Commencez à préparer de la gélatine méthacrylée, ou GelMA, en ajoutant 17 grammes de gélatine de type B à 500 millilitres d’eau distillée. Mélangez-le pendant 30 minutes sur un shaker à 37 degrés Celsius et ajoutez 13 millilitres d’anhydride méthacrylique avant de mélanger pendant la nuit sur un shaker. Le lendemain, préparez environ 60 millilitres d’aliquotes du GelMA dans des sacs de dialyse.

Placez tous les sacs de dialyse dans de l’eau distillée avec une barre à agiter pendant sept jours. Changez l’eau plusieurs fois par jour et laissez les sacs à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le septième jour, versez le GelMA dans un plat et congelez-le à moins 80 degrés Celsius avant la lyophilisation.

Ensuite, lyophilisez le GelMA en le plaçant dans la chambre à vide d’un lyophiliseur. Assurer un séchage complet avant le retrait du lyophilisateur. Ensuite, dissoudre le GelMA lyophilisé dans la solution saline équilibrée de Hanks à une concentration de 15% et ajuster le pH à 7,4 en utilisant une petite quantité d’hydroxyde de sodium.

En fonction du volume acquis, compléter la solution avec un antimycotique antibiotique et du phosphinate de phényle de lithium à 0,15%, ou LAP. Protégez la solution GelMA de la lumière et conservez-la à moins 20 degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure. Autoclave 3D imprimé en 3D chambres de bioréacteur à double flux, couvercles et inserts dans des sacs d’autoclave à 121 degrés Celsius pendant 20 minutes avec de la vapeur.

Et puis, pendant 20 minutes avec de la chaleur sèche. Après la stérilisation, faire tremper les chambres du bioréacteur, les couvercles et les inserts dans 15 millilitres de PBS stérile pendant une nuit à l’intérieur de l’armoire de biosécurité, puis procéder à un séchage complet. À l’aide d’une pipette de 1000 microlitres, remettre en suspension 20 fois 10 à la sixième cellule souche mésenchymateuse dérivée de la moelle osseuse humaine, ou CSM, par millilitre de cellules dans une solution de GelMA à 15%.

Ensuite, pressez un moule en silicone sec et stérile contre une boîte de Pétri, à l’aide de gants stériles. Placez un insert dans chaque trou du moule en silicone avec une pince avec le côté trou de l’insert vers le bas. Une fois cela fait, ajoutez environ 50 microlitres de la suspension cellulaire par insert à l’aide d’une pipette de 200 microlitres.

Réticulez le gel à l’intérieur de l’insert en exposant le dessus à une lampe de poche UV de longueur d’onde de 395 nanomètres pendant 1,5 minute, puis en éclairant l’autre côté pendant 30 secondes. Avec des pinces stériles, transférer immédiatement les inserts dans huit millilitres de milieu de croissance dans une plaque de culture non tissulaire à six puits et permettre aux cellules de récupérer pendant la nuit. Pour initier la différenciation du tissu adipeux, transférez les inserts sur huit millilitres de milieu adipogène et cultivez-les pendant 28 jours avec un changement de milieu quotidien.

Pour concevoir les unités ostéochondrales, placez les inserts dans des chambres de bioréacteur à double flux, coiffez les puits et infuser les deux flux séparément à un débit de cinq microlitres par minute avec 35 millilitres de milieu ostéogénique et 35 millilitres de milieu chondrogénique. Maintenir les cellules pour la différenciation pendant 28 jours en effectuant des changements de seringues toutes les deux semaines avec les types de milieux respectifs. Pour dériver les fibroblastes, différencier les CSM en culture 2D dans un flacon de culture de cellules tissulaires T de 150 centimètres carrés contenant 20 millilitres de milieu fibrogène pendant 21 jours.

Maintenir le changement hebdomadaire du support. Après 21 jours, utilisez quatre millilitres de trypsine pour détacher les cellules. Encapsulez les gels 3D dans les inserts.

Pour obtenir du tissu fibreux de type synovial, ou SFT, suivez un protocole similaire. Connectez le tube en silicone, ayant un diamètre intérieur de 0,062 pouce et un diamètre extérieur de 0,125 pouce, à la barre de bioréacteur mini-articulaire à une extrémité et aux connecteurs de verrouillage de leurre F 1/16e à l’autre extrémité. Ensuite, autoclavez les bioréacteurs minijoints 3D avec le tube et les couvercles en silicone.

Préparer et charger 35 millilitres de milieu à utiliser pour la culture de minijoints dans les réservoirs de milieu. Utilisez des pinces droites pour transférer les unités ostéochondrales du bioréacteur à double flux vers le puits droit du bioréacteur miniarticulaire. Transférer l’insert de tissu adipeux et l’insert de tissu fibreux dans les puits gauche et intermédiaire, respectivement, avant de couvrir tous les puits avec des couvercles stérilisés.

Connectez les entrées de clip mini-articulaires aux réservoirs du milieu et les sorties aux seringues. Ensuite, montez les seringues sur une pompe à seringue. Transférer la pompe et les copeaux dans un incubateur.

Placez les réservoirs moyens sur de la glace à l’extérieur de l’incubateur. Faire fonctionner la pompe en mode de retrait, en aspirant le fluide du réservoir de milieu dans la chambre du bioréacteur mini-joint. Continuez ce mini-processus de culture conjointe pendant 28 jours.

Pour modéliser l’inflammation articulaire et la dégénérescence du cartilage, ajoutez de l’interleukine un bêta à la souche de milieu fibrogène à 10 nanogrammes par millilitre pendant sept jours. Assurez-vous de remplacer la seringue le troisième jour avant de fournir de l’interleukine fraîche bêta au milieu fibrogénique. Pour le test de médicament, après trois jours de traitement par interleukine un bêta, administrer le médicament soit dans le milieu partagé, simulant une administration intra-articulaire, soit dans tous les types de milieu, simulant une administration systémique.

Après sept jours de traitement par interleukine un bêta, prélever des tissus individuels pour l’analyse. Après avoir retiré les inserts à l’aide d’une pince stérile, poussez un poinçon de biopsie au centre de l’insert pour retirer le gel et placez le gel dans PBS. Ensuite, coupez les gels ostéochondrals en deux tout en évaluant l’expression des gènes.

Recueillir et centrifuger environ 1,5 millilitre de média de chaque source de milieu à 14 000 g pendant 10 minutes. Après avoir éliminé les sédiments, congeler le milieu conditionné dans de l’azote liquide. Pour la coloration histologique et l’immuno-coloration, fixez d’abord le tissu fibreux ostéochondral et synovial, ou échantillons SFT, dans du formol tamponné à 10% et déshydratez-les dans de l’éthanol à des concentrations croissantes.

Effacer l’échantillon dans du xylène, les incorporer dans de la paraffine et, enfin, diviser les échantillons en six micromètres d’épaisseur. Dans le cas du tissu adipeux, colorer directement les échantillons formels et fixés tamponnés à 10%, avec une solution d’huile rouge O ou BODIPY. Les phénotypes spécifiques aux tissus étaient bien maintenus pour les micro-tissus individuels.

Tous les tissus de la miniarticulation ont été prélevés pour analyser leurs phénotypes après 28 jours de culture. La composante osseuse des microtissus des unités ostéochondrales exprimait des niveaux élevés d’ostéocalcine. Dans la partie cartilagineuse de l’ostéochondrale, les tissus exprimaient des niveaux significativement élevés de collagène de type deux et d’aggrécane.

Les niveaux d’expression des gènes adipogènes représentatifs, de l’adiponectine et de la leptine étaient plus élevés dans le tissu adipeux. Le dépôt de minéraux de calcium, de phosphatase alcaline et de protéine ostéocalcine a été principalement observé dans la taille osseuse des microtissus ostéochondrals. Le côté cartilagineux des tissus ostéochondrals présentait des glycosaminoglycanes et du collagène de type deux bien conservés.

L’expression des marqueurs associés à l’hypertrophie chondrococytes, le collagène de type 10 et le hérisson indien, a été significativement régulée à la baisse après 28 jours de culture. Un dépôt abondant de gouttelettes lipidiques a été trouvé dans le tissu adipeux. La coloration immunofluorescente a montré une forte expression de lubricine et de cadhérine 11 par le SFT après quatre semaines de culture.

Dans un modèle de maladie, le traitement IL one bêta a entraîné une apoptose cellulaire et des taux élevés de MMP-13 dans le SFT. La dégradation du cartilage a été traitée par IL one beta, suggérant l’apparition d’une diaphonie entre les tissus ostéochondrals et la SFT. L’efficacité thérapeutique du naproxène par administration systémique a montré une réduction de la dégradation du cartilage dans l’IL une bêta-miniarticulation.

La PCR en temps réel a indiqué que les quatre médicaments potentiels modificateurs de la maladie contre l’arthrose ont partiellement inversé la perte de cartilage. Les étapes les plus importantes de cette procédure comprennent la réticulation des gels dans les inserts et le placement de l’insert dans le bioréacteur. La puce permet d’étudier la contribution d’autres facteurs de risque offerts dans l’arthrose, tels que l’obésité et les blessures mécaniques.

Il peut également être utilisé pour étudier d’autres maladies articulaires.