In vivo Imagerie calcique à grand champ et à deux photons d’une souris utilisant une grande fenêtre crânienne

Ce protocole montre la création d’une grande fenêtre crânienne pour mesurer les activités de réservation à champ large et à cellule unique dans la même souris. En utilisant notre méthode, une fenêtre crânienne grande et stable peut être faite avec des emballages alimentaires à faible coût. Cette méthode est efficace pour étudier les activités neuronales et gliales pendant le comportement aux niveaux macroscopique et microscopique.

Il est recommandé de commencer par une petite fenêtre crânienne. Ensuite, si cela réussit, augmentez la taille de la fenêtre. Commencez par enlever le ciment supplémentaire sur le crâne avec une perceuse dentaire.

Marquez la zone à couper avec un stylo. Couper dans l’os à l’aide d’un scalpel avec une pointe émoussée pour s’assurer que la pointe ne pénètre pas dans le crâne. Grattez l’os à plusieurs reprises avec un scalpel pour approfondir la rainure jusqu’à ce que l’os dans la zone à couper bouge lorsqu’il est légèrement touché.

Retirer l’os incisé à l’aide d’une fine pince à épiler. Soyez prudent de ne pas pousser le lambeau osseux dans le cerveau qui pourrait endommager le cerveau. Pour enlever la dure-mère, coupez la dure-mère à l’aide d’une pipette en verre tiré avec une pointe effilée d’environ 10 micromètres.

Utilisez une aiguille en forme de U pour étendre cette coupe sur toute la fenêtre. Sous un stéréomicroscope réglé sur un zoom de 60 à 100x, retirez la dure-mère sectionnée à l’aide d’une pince à épiler ultra fine. En cas de saignement, rincer avec un aLCR ou utiliser une éponge de gélatine pour arrêter le saignement.

Ensuite, stérilisez un gros morceau d’emballage en PVDC par autoclavage et avec de l’éthanol à 70%. Sous un stéréomicroscope, utilisez une pince à épiler et un scalpel pour découper une enveloppe de la taille requise. Placez l’enveloppe sur la surface du cerveau tout en laissant le LCR sur la surface.

Aspirez l’aCSF du bord de l’enveloppe, permettant à l’enveloppe de coller fermement à la surface du cerveau. Coupez l’écharpe avec un scalpel et une pince à épiler de manière à ce qu’il y ait une marge d’environ un millimètre entre le bord de la fenêtre crânienne et l’enveloppe. Une fois l’enveloppe en place, collez le bord de l’enveloppe sur le crâne avec un adhésif biologique.

Laissez l’adhésif sécher pendant environ 30 minutes. À l’aide d’un distributeur muni d’un embout de mélange, appliquez un élastomère de silicone transparent sur le dessus de l’enveloppe. Placez le verre de couverture d’épaisseur 0,12 à 0,17 millimètres sur le dessus.

Scellez le périmètre du verre de couverture avec un film imperméable à l’eau, de la superglue ou du ciment dentaire. Tout d’abord, mélanger les solutions de fibroïne et d’AAV dans un rapport de un à quatre dans un petit tube d’échantillonnage. Déposez une partie aliquote de la solution sur la pellicule plastique de la fenêtre crânienne et séchez-la pendant au moins trois heures.

Ensuite, fixez l’enveloppe à la surface du cerveau comme indiqué dans la section précédente. Vérifiez l’état des souris et des fenêtres régulièrement, deux à quatre semaines. À ce moment-là, les indicateurs de calcium génétiquement codés seront exprimés suffisamment après la création de la fenêtre traitée par AAV.

En utilisant ce protocole, les fenêtres crâniennes pourraient être maintenues chez huit souris sur 10 pendant 10 semaines. Une large fenêtre est créée avec une pellicule plastique, du silicone transparent et du verre de couverture dans une souris transgénique exprimant un indicateur de calcium génétiquement codé ancré dans la membrane dans les astrocytes. L’imagerie calcique à grand champ a été réalisée à travers cette fenêtre et des changements de fluorescence ont été observés lorsque la stimulation par bouffées d’air a été appliquée aux moustaches controlatérales.

L’évolution temporelle du changement de fluorescence dans le cortex somatosensoriel a montré une activité corticale. L’imagerie à deux photons a permis d’observer des images de fluorescence unicellulaire spécifiques aux cellules gliales. Des changements de fluorescence induits par la stimulation sensorielle ont été observés dans des cellules individuelles de différentes régions corticales.

Wrap codé avec AAV exprimant un indicateur de calcium génétiquement codé; et la fibroïne a été utilisée pour fabriquer la fenêtre crânienne. L’imagerie calcique à grand champ a montré une activité corticale se propageant à travers le cortex induite par la stimulation sensorielle deux à quatre semaines après la chirurgie. Comme la fenêtre était grande, différentes zones corticales de la même souris ont été imagées et des changements de fluorescence induits par la stimulation sensorielle ont été observés dans les cellules individuelles.

Il est important d’éviter d’endommager le cerveau lors de la création d’une fenêtre crânienne. On peut effectuer des tâches de comportement sur des souris avec une grande fenêtre crânienne. Cela permettra d’examiner la relation entre l’activité neuronale et le comportement de la souris.

Cette méthode peut être appliquée à une variété d’études en neurosciences. Par exemple, il peut être utilisé pour observer l’activité corticale pendant les tâches de prise de décision, la course motrice et dans des modèles de masse de lésions cérébrales et de maladies.