Name: Ex Vivo Analyse des transitoires Ca2+ activés mécaniquement dans les cellules urothéliales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Découvrez une technique ex vivo pour analyser les transitoires Ca²⁺ activés mécaniquement dans les cellules urothéliales de souris en utilisant le capteur fluorescent GCaMP5G. Cette méthode simple permet d'étudier la mécanotransduction dans les tissus natifs.

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<li>Booth, I. R., Miller, S., Müller, A., Lehtovirta-Morley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+bacterial+mechanosensitive+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The evolution of bacterial mechanosensitive channels.</a> Cell Calcium. 57 (3), 140-150 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Tous les organismes, et apparemment la plupart des types cellulaires, expriment des canaux ioniques qui répondent à des stimuli mécaniques 20,33,34,35,36,37. La fonction de ces canaux activés mécaniquement a été principalement évaluée avec la technique du patch-clamp. Cependant, en raison de problèmes d’accessibilité, les étu...

Les cellules épithéliales des voies urinaires sont soumises à des forces mécaniques lorsque le filtrat urinaire traverse les néphrons, et l’urine est pompée hors du bassinet du rein et traverse les uretères pour être stockée dans la vessie. Il est reconnu depuis longtemps que les forces mécaniques (p. ex., contrainte de cisaillement et étirement) exercées par les fluides sur les cellules épithéliales qui tapissent les voies urinaires régulent la réabsorption des protéines dans le tubule proximal et des solutés dans le néphron distal 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13, ainsi que le stockage de l’urine dans la vessie et la miction14,15,16,17.
La conversion de stimuli mécaniques en signaux électriques et biochimiques, un processus appelé mécanotransduction, est médiée par des protéines qui répondent à la déformation des structures cellulaires ou de la matrice extracellulaire associée 18,19,20,21. Les canaux ioniques activés mécaniquement sont uniques en ce sens qu’ils passent d’un état fermé à un état perméable ouvert en réponse aux changements de tension membranaire, de pression ou de contrainte de cisaillement 18,19,20,21,22. De plus, les transitoires Ca 2+ peuvent être initiés par mécanotransduction médiée par l’intégrine ou par activation de systèmes d’adhésion mécanoréactifs aux jonctions cellule-cellule23,24,25,26. La fonction du canal ionique est généralement évaluée avec la technique patch-clamp, qui implique la formation d’un joint gigaohm entre la membrane cellulaire et la pipette patch27. Cependant, les cellules situées dans des couches de tissus profonds avec une matrice extracellulaire dense (p. ex. tubules rénaux) ou entourées d’une barrière physique (p. ex. glycocalice) sont difficiles d’accès avec une micropipette en verre. De même, les cellules incorporées ou qui font partie intégrante de tissus à faible stabilité mécanique (par exemple, l’urothélium) ne peuvent pas être facilement étudiées avec la technique patch-clamp. Étant donné que de nombreux canaux ioniques activés mécaniquement sont perméables au Ca 2+, une autre approche consiste à évaluer leur activité par microscopie fluorescente à l’aide d’un colorant sensible au Ca2+ ou d’indicateurs de calcium génétiquement codés (GECI) tels que GCaMP. Les efforts récents en ingénierie des protéines ont considérablement augmenté la plage dynamique, la sensibilité et la réponse des GECI28,29,30, et les progrès de la génétique ont permis leur expression dans des populations cellulaires spécifiques, ce qui les rend parfaitement adaptés à l’étude de la mécanotransduction.
L’urothélium, l’épithélium stratifié qui recouvre l’intérieur de la vessie, fonctionne comme une barrière, empêchant la diffusion des solutés urinaires dans l’interstitium de la vessie, mais fonctionne également comme un transducteur, détectant la plénitude de la vessie et communiquant ces événements aux nerfs sous-jacents et à la musculature16. Des études antérieures ont montré que la communication entre l’urothélium et les tissus sous-jacents nécessite les canaux ioniques activés mécaniquement Piezo1 et Piezo231. Pour évaluer les transitoires Ca 2+ induits mécaniquement dans les cellules urothéliales, une nouvelle technique décrite qui utilise le transfert de gènes adénoviraux pour exprimer le capteur Ca2+ GCaMP5G dans les cellules urothéliales a été développée. Cette technique utilise une préparation de feuilles muqueuses qui permet un accès facile à la couche cellulaire parapluie la plus externe et un système assisté par ordinateur pour la stimulation mécanique simultanée de cellules individuelles avec une micropipette en verre fermée et l’enregistrement des changements de fluorescence au fil du temps.

<table><tbody><tr><td>20x Objectif</td><td>Olympus</td><td>UMPlanFL N</td><td></td></tr><tr><td>24 G &frac34 ; &rdquo; cathéter</td><td>Medline&nbsp ;</td><td>Suresite IV slide&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>4x Objectif</td><td>Olympus</td><td>UPlanFL N</td><td></td></tr><tr><td>Convertisseur analogique/numérique</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-GFP</td><td>Abcam&nbsp ;</td><td>Ab6556</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur</td><td>de faisceau Chroma</td><td>T495lpxr</td><td></td></tr><tr><td>Régulateur de température bipolaire</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fluka</td><td>21114-1L</td><td>1 M solution</td></tr><tr><td>logiciel cellSens Logiciel</td><td>Olympus</td><td></td><td>Imaging</td></tr><tr><td>caméra CMOS</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA fusion</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-lapin conjugué à Alexa Fluor 488&nbsp ;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-545-152</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtre&nbsp ;</td><td>Chrominance&nbsp ;</td><td>ET470/40X</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre Corning 8250 en verre</td><td>Warner Instruments&nbsp ;</td><td>G85150T-4</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Chauffage en ligne&nbsp ;</td><td>Warner Instruments</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>793590</td><td></td></tr><tr><td>Source lumineuse</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lambda XL&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Tube de pompe de collecteur</td><td>Fisherbrand</td><td>14-190-510</td><td>ID 1,52 mm</td></tr><tr><td>Tube de pompe de collecteur</td><td>Fisherbrand</td><td>14-190-533</td><td>ID 2,79 mm</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Souris&nbsp ;</td><td>Jackson Lab</td><td>664</td><td>2-4 mois femelle C57BL/6J</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige&nbsp ;</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51W</td><td></td></tr><tr><td>Supports de montage avec DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>S36964&nbsp ;</td><td>Slowfade Diamond Antifade avec DAPI</td></tr><tr><td>NaCl&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel pClamp</td><td>Molecular Devices</td><td>Version 10.4</td><td>Patch-clamp Logiciel d’acquisition et d’analyse de données d’électrophysiologie</td></tr><tr><td>Pompe péristaltique</td><td>Gilson</td><td>Minipuls 3</td><td></td></tr><tr><td>Actionneur piézoélectrique</td><td>Thorlabs</td><td>PAS005</td><td></td></tr><tr><td>Porte-pipette</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de pipette</td><td>Narishige</td><td>PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Base chauffante à remplacement rapide avec perfusion et kit de bague d’adaptation</td><td>Warner Instruments</td><td>QE-1</td><td>Plate-forme à échange rapide pour parabole de 35 mm&nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>Rhodamine-phalloïdine&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Plot</td><td>Systat Software Inc</td><td>Version 14.0</td><td>Logiciel scientifique de graphisme et d’analyse de données&nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>Élastomère de silicone</td><td>Dow</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur piézoélectrique monocanal en boucle ouverte</td><td>Thorlabs</td><td>MDT694B</td><td></td></tr><tr><td>Coussin porte-grille carrée</td><td>Ted Pella</td><td>10520</td><td></td></tr><tr><td>Suture</td><td>AD Surgical</td><td>S-S618R13</td><td>6-0 Sylk</td></tr><tr><td>Tige de montage en téflon</td><td>Sur</td><td></td> mesure <td>Utilisation pour monter l’actionneur piézoélectrique dans le micromanipulateur</td></tr><tr><td>Tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>14171129</td><td>Tygon S3 ID 1/16 PO, OD 1/8 IN</td></tr><tr><td>Périphérique d’E/S numériques USB&nbsp ;</td>NI <td>USB-6501</td><td></td> de <td>National Instruments</td></tr></tbody></table>

ex vivo analyse des transitoires ca2+ activés mécaniquement dans les cellules urothéliales

Ex Vivo Analysis of Mechanically Activated Ca2+ Transients in Urothelial Cells

Les canaux ioniques activés mécaniquement sont des transducteurs biologiques qui convertissent des stimuli mécaniques tels que les forces d’étirement ou de cisaillement en signaux électriques et biochimiques. Chez les mammifères, les canaux activés mécaniquement sont essentiels pour la détection des stimuli externes et internes dans des processus aussi divers que la sensation de toucher, l’ouïe, la régulation du volume des globules rouges, la régulation de la pression artérielle basale et la sensation de plénitude de la vessie. Bien que la fonction des canaux ioniques activés mécaniquement ait été largement étudiée in vitro à l’aide de la technique de patch-clamp, l’évaluation de leur fonction dans leur environnement natif reste une tâche difficile, souvent en raison d’un accès limité aux sites d’expression de ces canaux (par exemple, les terminaisons afférentes, les cellules de Merkel, les barorécepteurs et les tubules rénaux) ou de difficultés à appliquer la technique de patch-clamp (par exemple, les surfaces apicales des cellules parapluies urothéliales). Ce protocole décrit une procédure pour évaluer les transitoires Ca 2+ évoqués mécaniquement à l’aide du capteur fluorescent GCaMP5G dans une préparation urothéliale ex vivo, une technique qui pourrait être facilement adaptée pour l’étude des événements Ca2+ évoqués mécaniquement dans d’autres préparations tissulaires natives.

Le présent protocole décrit une technique permettant d’évaluer les transitoires Ca 2+ évoqués mécaniquement dans les cellules parapluies à l’aide du capteur fluorescent Ca2+ GCaMP5G. La transduction adénovirale a été utilisée pour exprimer GCaMP5G dans les cellules urothéliales en raison de sa grande efficacité et parce qu’elle produit un niveau élevé d’expression. Des images fluorescentes de cryosections colorées provenant d’une vessie transduite sont présentées à la figure 2D<...

Ce protocole décrit une méthodologie pour évaluer la fonction des canaux ioniques activés mécaniquement dans les cellules urothéliales natives à l’aide du capteur fluorescent Ca2+ GCaMP5G.

Ex Vivo Analyse des transitoires Ca2+ activés mécaniquement dans les cellules urothéliales

Mechanically activated ion channels are biological transducers that convert mechanical stimuli such as stretch or shear forces into electrical and ...

Ce protocole décrit une technique permettant d’étudier un événement calcique évoqué mécaniquement dans une préparation urothéliale ex vivo. La technique est relativement facile à exécuter et pourrait être adaptée pour étudier l’événement calcique évoqué mécaniquement dans d’autres préparations tissulaires natives. Fabriquez les micropipettes en plaçant le verre capillaire dans l’extracteur et en l’ajustant avec les boutons de retenue capillaire.Tirez le capillaire en verre en deux étapes selon les instructions du fabricant. Fermez la pointe des micropipettes à l’aide d’une microforge avec le bouton de réglage du chauffage réglé à 60. Après avoir exposé la vessie et l’os pelvien de la souris euthanasiée, fissurez l’os pelvien pour exposer l’urètre et canulez l’urètre avec un cathéter de calibre 24.Utilisez une suture 6-0 pour fixer le cathéter à l’urètre. Récoltez la vessie et l’urètre et fixez-les sur un tampon en caoutchouc de silicone baigné dans la solution d’enregistrement. Séparez la muqueuse de la vessie de la couche musculaire sous-jacente avec une pince fine.Coupez la muqueuse de la vessie et épinglez-la avec l’urothélium tourné vers le haut jusqu’à un insert en élastomère de silicone dans le fond d’une boîte de culture tissulaire de 35 millimètres de diamètre. Montez la capsule de culture tissulaire avec la muqueuse de la vessie épinglée dans l’étage microscope équipé d’un incubateur à plat de culture avec des éléments chauffants résistifs. Perfuser la capsule de culture cellulaire en continu à un débit de 1,7 millilitre par minute avec une solution d’enregistrement chauffée à 37 degrés Celsius avec un chauffage en ligne.Maintenez la température de l’incubateur à vaisselle en tissu et des solutions à environ 37 degrés Celsius avec un régulateur de température bipolaire à double canal. Pour enregistrer les transitoires d’ions calcium induits mécaniquement, immergez la micropipette dans la solution d’enregistrement. Sous éclairage en fond clair, à l’aide d’un objectif de balayage à faible grossissement, déplacez la micropipette vers le centre du champ.Déplacez le micromanipulateur dans le plan vertical et ajustez la mise au point pour déplacer la pipette près de la surface du tissu urothélial. Passez à l’objectif avec un grossissement plus élevé et une ouverture numérique adaptée à l’immunofluorescence. Réglez le micromanipulateur pour qu’il affine et déplacez la pipette près du haut de la cellule cible.Si nécessaire, réglez la mise au point et la position de la pipette. Ouvrez le protocole de stimulation dans le logiciel d’électrophysiologie et réglez-le pour jouer. Ajustez la mise au point et appuyez sur Démarrer dans le gestionnaire d’expériences pour lancer l’acquisition des données.Cela pilote l’actionneur piézoélectrique et génère un fichier avec les images de l’expérience. Lorsque la cellule est stimulée, une augmentation de la fluorescence est observée. Pour quantifier l’intensité fluorescente, ouvrez le fichier image dans le logiciel d’imagerie et sélectionnez la fenêtre de comptage et de mesure.Lisez le film pour identifier la cellule stimulée. Sélectionnez l’outil polygone et dessinez un retour sur investissement sur les limites de la cellule qui a été percée. Accédez à la fenêtre de mesure, sélectionnez le profil d’intensité, définissez la mesure sur les heures supplémentaires, les résultats sur la moyenne, la soustraction d’arrière-plan sur aucune, puis appuyez sur Exécuter.L’intensité moyenne de fluorescence sera calculée au fil du temps. Pour exporter les données du profil d’intensité, cliquez sur l’icône Excel dans la fenêtre des résultats du profil d’intensité et effectuez une analyse des données à l’aide d’un logiciel de représentation graphique et d’analyse de données scientifiques. Dans cette étude, la cellule parapluie a été piquée pour évaluer les transitoires de calcium évoqués mécaniquement.L’image capturée à 10 secondes montre une vue fluorescente de la pipette stimulante positionnée au-dessus d’une cellule parapluie exprimant un capteur de calcium fluorescent GCaMP5G. La stimulation mécanique de la cellule parapluie exprimant le capteur de calcium provoque une déformation suivie d’une augmentation rapide de l’émission de fluorescence. Le graphique montre un changement dans l’intensité de fluorescence tracée en fonction du temps pour plusieurs cellules.Le piqûre évoque une réponse calcique dans la plupart des cellules parapluies transduite avec un capteur de calcium fluorescent. L’étape la plus importante consiste à prélever la vessie et l’urètre, puis à les fixer sur un tampon de support en caoutchouc de silicone. Évitez les lésions tissulaires lors de la séparation de la muqueuse de la vessie de la couche musculaire sous-jacente.Les méthodes d’imagerie telles que celle décrite ici peuvent fournir un aperçu unique de la façon dont les canaux activés par mécano envoient des changements dans leur environnement natif et génèrent des réponses physiologiques.

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