Expression de transgènes dans l’urothélium vésical natif par transduction médiée par adénovirus

Ce protocole décrit des méthodes qui permettent aux chercheurs d’exprimer des ADNC ou des SIRNA dans l’urothélium natif de la vessie. Les principaux avantages de cette technique sont sa relative simplicité, la capacité d’exprimer des ADNc, des siRNA dans l’urothélium avec une grande efficacité, et dans un laps de temps relativement court. La partie la plus difficile de cette technique est le cathétérisme.

Cependant, la technique globale est relativement facile à maîtriser une fois apprise. Giovanni Ruiz, spécialiste de recherche IV dans mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, placez la souris anesthésiée sur un coussin chauffant à côté des cônes nasaux.

Maintenir l’animal sous anesthésie pendant toute la durée du protocole. Confirmez que la souris est complètement anesthésiée avec un pincement d’orteil. Pour éviter d’introduire de l’air dans la vessie, remplissez la partie du cathéter en plastique d’un cathéter IV et du moyeu associé avec du PBS stérile à l’aide d’une pipette de transfert ou d’une seringue stérile.

Avec l’animal en décubitus dorsal, écouvillonner le méat urétral externe avec 70% d’alcool. Ensuite, saisissez doucement le tissu formant le méat urétral externe et étendez-le verticalement loin de l’animal à l’aide de pinces fines. Insérez le cathéter stérile dans le méat externe.

En utilisant l’autre main, insérez soigneusement le cathéter verticalement d’environ trois à quatre millimètres dans le méat urétral. Ensuite, abaissez le cathéter inséré dans le méat externe vers la queue de l’animal, ce qui facilite son entrée dans la partie de l’urètre qui passe sous l’os pubien et finalement dans la vessie. Laissez l’urine dans la vessie s’écouler.

Enlevez toute urine résiduelle en effectuant la manœuvre de Crede en massant et en appuyant doucement sur la bosse de la vessie dans la région abdominale inférieure. Pour rendre l’urothélium réceptif à la transduction, lavez la vessie de souris ou de rat en fixant une seringue stérile d’un millilitre remplie de PBS au moyeu du cathéter. Injectez 100 microlitres de PBS stérile dans la vessie de la souris.

Après avoir détaché la seringue de l’ajustement du cathéter, laissez le PBS s’égoutter. Instiller 100 microlitres de N-dodécyl-bêta-D-maltoside à 0,1% dissous dans du PBS et un filtre à 0,2 micromètre stérilisé dans la vessie de souris à l’aide d’une seringue stérile d’un millilitre. Retenir le N-dodécyl-bêta-D-maltoside dans la vessie pendant 10 minutes en laissant la seringue en place.

Retirez le N-dodécyl-bêta-D-maltoside de la vessie en détachant la seringue et en la laissant s’écouler. Pour introduire le virus dans la vessie, attachez une seringue stérile d’un millilitre au moyeu du cathéter et instillez 5 000 000 000 à 100 000 000 IVP d’adénovirus dilué dans 100 microlitres de PBS stérile pour les souris, ou 450 microlitres pour les rats dans la vessie. Après 30 minutes, détachez la seringue et laissez la solution virale évacuer la vessie sur une serviette jetable.

Éponger toute solution virale résiduelle avec une lingette absorbante tout en jetant le tampon et essuyer les déchets biologiques dangereux. Afin de permettre à l’animal de récupérer, cesser l’écoulement de l’isoflurane. Laissez l’animal se rétablir et être complètement mobile avant de le remettre dans sa cage, en particulier si les animaux sont logés en groupe.

Analyser les effets de l’expression transgénique 12 à 72 heures après le traitement à l’aide de méthodes telles que l’hybridation in situ de l’ARNm, le transfert Western ou l’immunofluorescence. L’analyse par transfert Western des lysats urothéliaux a révélé l’expression de l’hormone de croissance humaine marquée V5 dans l’urothélium des vessies transduites, mais pas dans les vessies non transduites. L’expression a également été confirmée par immunofluorescence à l’aide d’anticorps qui ont reconnu l’hormone de croissance humaine, ou le marqueur d’épitope V5.

L’analyse par transfert Western a confirmé l’expression de Claudin-2 chez les rats transduits avec l’adénovirus, mais pas chez ceux transduits avec un virus contrôlé codant pour la GFP. L’analyse par immunofluorescence a confirmé l’expression exogène de Claudin-2 dans les cellules parapluies urothéliales transduites avec l’ADNc de Claudin-2 codant pour le virus. La détection de la claudine-2 exogène dans la protéine 1 de la jonction serrée par immunofluorescence et microscopie confocale de l’urothélium entier monté ou en coupe transversale a révélé la présence de jonctions serrées et d’accumulations intracellulaires de claudine-2 dans le cytoplasme cellulaire.

Le champ d’image montre que compter le nombre de cellules parapluies transduites révèle une efficacité qui approche 95% et dans l’ensemble de la paroi de la vessie, seul l’urothélium est transduit, et aucun autre tissu n’est ciblé par l’adénovirus instillé. Le cathétérisme est essentiel pour que le protocole fonctionne comme prévu. Cette technique permet aux chercheurs d’étudier la biologie urothéliale normale, ainsi que de comprendre les conditions dans lesquelles la surexpression ou la sous-expression des protéines conduit à la maladie.