Essai de vide en temps réel

La méthode décrite dans ce rapport peut être utilisée pour comprendre les aspects physiologiques et neuro-comportementaux de la miction volontaire dans les états de santé et de maladie. Cette technique nous permet de surveiller le comportement du volume de la souris dans les phases claires et sombres de la journée et fournit des informations temporelles, spatiales et volumétriques sur les événements de miction. Pour préparer un test de taches vides en temps réel ou une chambre d’enregistrement RT-VSA, placez un papier filtre mince ou épais, selon l’heure de la journée, au fond de la cage d’enregistrement RT-VSA.

Sur le papier filtre, placez un igloo en plastique pour l’espace de couchage; un tube microcentrifuge stérile de 1,5 ml à des fins d’enrichissement; et un plat en plastique de 60 mm x 15 mm contenant deux ou trois morceaux de chow sec de souris; et 14 à 16 grammes d’eau sous forme de sachet de gel. Une fois la chambre d’enregistrement prête, placez délicatement la souris sur le papier filtre. Assurez-vous que le transfert de la souris de la cage de logement à la cage d’enregistrement se produit avec un minimum de stress.

Une fois que la souris est à l’intérieur de la cage d’enregistrement, placez le couvercle et couvrez le haut du couvercle avec un tampon bleu de banc absorbant pour minimiser les réflexions directes de la lumière ambiante sur la surface du couvercle en plexiglas. Allumez les lumières ultraviolettes dans la chambre inférieure. Pour enregistrer des vidéos RT-VSA à partir des caméras supérieures et inférieures, utilisez un logiciel d’enregistrement de vidéosurveillance configuré pour enregistrer simultanément à partir de plusieurs webcams ou caméras en réseau.

Lancez l’enregistrement en appuyant sur Cmd R dans la fenêtre du programme. Effectuez des enregistrements vidéo à raison d’une image par seconde. Immédiatement après le début des enregistrements, quittez la pièce et fermez doucement la porte.

Assurez-vous que la pièce reste silencieuse pendant toute la durée de l’expérience. Arrêtez les enregistrements en appuyant sur Cmd T.Éteignez les lumières ultraviolettes. Après avoir arrêté l’enregistrement, le logiciel génère automatiquement un fichier vidéo au format m4v pour chaque caméra et l’enregistre sous le nom de la caméra dans un dossier de destination précédemment sélectionné.

Vérifiez que dans le dossier de chaque caméra, les expériences sont organisées en dossiers par date. Dans chaque dossier de date ou d’expérience, vérifiez qu’il existe un fichier m4v et tous les fichiers jpeg individuels qui correspondent à chaque image vidéo. Créez un dossier sur le bureau avec le nom et la date de l’expérience et transférez les fichiers m4v dans ce dossier.

Copiez le dossier du film dans un lecteur flash pour analyse sur un ordinateur externe. Ouvrez un fichier vidéo collecté par la caméra inférieure pendant la phase d’éclairage ou par la caméra supérieure pendant la phase sombre pour analyse. Après avoir évalué la qualité du film, analysez les expériences en passant à la fenêtre temporelle appropriée à l’aide de la commande d’avance rapide ou du curseur de barre de temps.

L’activité de vidange pendant la phase lumineuse est enregistrée entre 11h00 et 17h00, et pendant la phase sombre, entre minuit et 6h00. Lisez le film en mode avance rapide en cliquant sur l’icône d’avance rapide ou faites défiler manuellement le film, à la recherche de preuves que la souris est en train de s’annuler. Recherchez l’apparition soudaine de taches d’urine brillantes sur le papier filtre ou les changements de comportement, y compris le mouvement vers les coins de la cage et une brève période d’inactivité lorsque la souris urine. Enregistrez l’heure à laquelle chaque vide se produit.

Par convention, le temps du vide est enregistré au premier signe de détection de l’urine. Pour prendre des mesures du vide, utilisez d’abord la barre de défilement pour avancer ou reculer dans le temps, en recherchant le moment où la diffusion maximale de la tache d’urine s’est produite. Mettez le film en pause à ce stade et placez la flèche de la souris de l’ordinateur à l’endroit analysé pour marquer le point d’intérêt dans la capture d’écran.

Nommez le fichier de capture d’écran en utilisant des numéros corrélatifs pour tenir compte de l’ordre d’apparition dans le film. Une fois que toutes les taches de vide ont été analysées, mesurez la surface totale du papier filtre en capturant une capture d’écran et en délimitant la bordure du papier filtre. Calculez le pourcentage de surface de chacune des taches d’urine.

Transformez les valeurs de la zone en pourcentage en volume d’urine pour chaque point vide à l’aide des courbes d’étalonnage et de la fonction d’interpolation du logiciel graphique. Le comportement mictionnel des souris femelles et mâles Piezo1, 2, knockout et témoins a été enregistré pendant la phase sombre et claire de la journée. Au cours de leur phase lumineuse inactive, aucune différence significative n’a été observée dans les paramètres analysés pour les souris knockout femelles ou mâles par rapport au témoin.

Cependant, dans la phase sombre active, les souris knockout femelles et mâles ont montré un phénotype de miction altéré, caractérisé par une augmentation significative du nombre et du volume total de petites taches vides. Il n’y avait pas de différences significatives dans les taches de vides primaires ou le nombre de PVS, le volume moyen par PVS ou le volume PVS total chez les souris knockout femelles ou mâles par rapport aux souris témoins. Le comportement mictionnel des souris femelles a été testé dans des conditions basales et après un traitement au cyclophosphamide.

Par rapport aux conditions basales, la quantité d’urine libérée par vide est plus faible après le traitement par cyclophosphamide et les événements de miction sont beaucoup plus fréquents. Un aspect clé de la reproductibilité des essais est de manipuler les animaux aussi doucement que possible et de les maintenir sous un stress minimal pendant toute la période d’essai. Comme il s’agit d’un test non invasif, des procédures supplémentaires peuvent être effectuées par la suite, y compris la cytométrie et l’électromyographie pour évaluer respectivement les fonctions du sphincter urinaire et urinaire externe.

La mise en œuvre de cette technique permettra aux chercheurs de définir la contribution de voies spécifiques au comportement de miction dans les états de santé et de maladie.