Name: Dans limagerie in situ de la souris en utilisant deux Thymus microscopie biphotonique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-01-25T19:52:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: Apprenez l'imagerie in situ du thymus par microscopie biphotonique chez la souris. Cette méthode permet d'observer la migration cellulaire et les mécanismes de sélection des lymphocytes T en immunologie.

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Nous remercions Matt Paul et Jimmy Wu pour l&#39;assistance technique.

Le transfert adoptif Injecter nouveau-nés avec 50 100 ul de la moelle osseuse à l&#39;aide d&#39;une seringue d&#39;insuline 2-4 fois durant les 3-7 premiers jours de vie, avec une finale donateurs-to-host ratio de 1:1. But pour un site d&#39;injection sous le sternum et la cage thoracique, mais au-dessus de l&#39;intestin et l&#39;estomac. Insérez l&#39;aiguille suffisamment loin pour pénétrer le péritoine, attention à ne pas percer la membrane. Il n&#39;est pas rare pour certains de la moelle osseuse d&#39;être perdus lors de l&#39;injection. Vous pouvez réduire la perte en desserrant votre emprise sur le chiot que vous injectez de manière à permettre à la peau de l&#39;expansion et, puis, lentement retirer l&#39;aiguille. Dissection de Thymus Faire une incision dans la ligne médiane et couper ou déchirer la peau pour révéler la cage thoracique. Accrochez-vous à le sternum et couper à travers le péritoine et le diaphragme. Coupez les côtés de la cage thoracique pour révéler la cavité thoracique. Le thymus est au-dessus du cœur. Afin de préserver la structure du thymus, s&#39;accrocher à des tissus environnants comme vous disséquer le thymus. Rincer le thymus avec du PBS pour l&#39;empêcher de sécher durant la dissection. Doucement taquiner loin l&#39;excès de tissu sur la surface de la capsule du thymus et coupent les deux lobes. Préparation des tissus pour l&#39;imagerie Utilisez une colle tissulaire vétérinaires de coller le thymus pas d&#39;une lamelle carré. Utilisez un pipetteman de mettre une fraction d&#39;un microlitre de colle. Étendre la colle à la longueur et la largeur approximative du thymus. Steady le thymus contre la lamelle et le faire glisser en place. Deux-Photon Imaging Le tissu est immergé dans du DMEM sans rouge de phénol qui est perfusé avec 95% d&#39;oxygène et de dioxyde de carbone de 5% et chauffé à 37 ° C. D&#39;excitation à deux photons a été réalisée en utilisant un Spectra-Physics MaiTai laser réglé à 900nm, et de la PCP, la GFP, YFP et Texas Red émission de lumière a été séparé en utilisant un 495, 515, 560 miroirs dichroïques et recueillies à l&#39;aide de détecteurs de PMT.

<ol><li>Kyewski, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeding+of+thymic+microenvironments+defined+by+distinct+thymocyte-stromal+cell+interactions+is+developmentally+controlled%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled.</a> J Exp Med. 166, 520-538 (1987).</li>
<li>Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+microenvironments+for+T+cell+differentiation+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection.</a> Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).</li>
<li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Migration+of+Positively+Selected+Thymocytes+Visualized+in+Real+Time%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time.</a> PLoS Biol. 3, (2005).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

L&#39;imagerie à deux photons dans le thymus nous permet d&#39;examiner dans la vie, les organes intacts les interactions et les migrations qui sous-tendent les épreuves de sélection dans le thymus.

dans l&#39;imagerie in situ de la souris en utilisant deux thymus microscopie biphotonique

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Microscopie à deux photons (TPM) nous permet de l&#39;image en profondeur dans le thymus et de documenter les événements qui sont importants pour le développement des thymocytes. Pour suivre la migration des individus dans une foule de thymocytes, nous générons des chimères néonatale où moins de un pour cent des thymocytes sont issus d&#39;un donneur qui est transgénique pour une protéine ubiquitaire expresse fluorescentes. Pour générer ces chimères hématopoïétiques partielle, les bénéficiaires néonatale sont injectés avec de la moelle osseuse entre 3-7 jours d&#39;âge. Après 4-6 semaines, la souris est sacrifiée et le thymus est soigneusement disséquée et bissected préservant l&#39;architecture du tissu qui sera imagé. Le thymus est collé sur une lamelle en préparation pour l&#39;imagerie ex vivo par TPM. Pendant l&#39;imagerie du thymus est conservé dans du DMEM sans rouge de phénol qui est perfusé avec 95% d&#39;oxygène et de dioxyde de carbone de 5% et chauffé à 37 ° C. En utilisant cette approche, nous pouvons étudier les événements requis pour la génération d&#39;un répertoire des cellules T diverses.

Nous présentons, étape par étape les instructions pour la génération des chimères néonatale ainsi que la dissection et la préparation du thymus pour l&#39;imagerie ex vivo par microscopie biphotonique 2.

Dans l&#39;imagerie in situ de la souris en utilisant deux Thymus microscopie biphotonique

La microscopie biphotonique (TPM) nous permet d'imager les zones profondes du thymus et de documenter les événements importants pour le développement des thymocytes. Pour suivre le ...

L'imagerie à deux photons est utile en immunologie car elle nous permet de suivre la migration d'une cellule unique au moment où elle interagit avec son environnement. En suivant la migration au niveau du thymus, nous pouvons caractériser à l'aide de la microscopie à deux photons le mécanisme de sélection positive et négative.Bonjour, je suis Ina Lottie du laboratoire de la Dre Ellen Roby à l'Université de Californie à Berkeley. Et moi, c'est Paul Herzmark, également du laboratoire d'Ellen Roby. Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment nous réalisons l'imagerie in situ du tissu thymique, et je vais vous expliquer comment nous utilisons notre microscope à deux photons pour imager le thymus.Et je vais vous montrer les étapes menant à l'imagerie à deux photons. Celles-ci incluent les procédures suivantes : l'isolement de cellules souches hématopoïétiques à partir de la moelle osseuse, le transfert adoptif de cellules de la moelle osseuse chez des nouveau-nés, la dissection et la bissection du thymus, ainsi que la préparation du tissu pour l'imagerie par microscopie à balayage laser à deux photons. Commençons donc.Avant de pouvoir préparer le thymus pour l'imagerie, nous devons d'

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Dissection et 2-Photon Imaging des ganglions lymphatiques périphériques chez les souris

Nous décrivons une méthode pour visualiser plusieurs reprises la microglie et les monocytes circulants...

Une technique de la fenêtre mince crâne pour chronique à deux photons In vivo</emImagerie> de Murine microglies dans les modèles de la neuro-inflammation

Nous avons développé des outils de laboratoire roman et de protocoles pour l'acquisition d'imagerie intravitale du thymus. Notre technique devrait aider à l'identification de «niches» dans le thymus où le développement des cellules T se produit.

Imagerie intravitale du Thymus souris utilisant la 2-microscopie biphotonique

L’imagerie en accéléré chez l’animal vivant fournit des informations précieuses sur la réorganisation structurelle du cerveau intact. Ici, nous introduisons une préparation de crâne aminci qui permet l’imagerie transcrânienne de structures synaptiques marquées par fluorescence dans le cortex de souris vivantes par microscopie à deux photons.

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L’objectif du protocole est de montrer longitudinale intravitale suivi en temps réel des thymocytes par laser, microscopie dans les implants du thymus dans la chambre antérieure de l’oeil de la souris. La transparence de la cornée et la vascularisation du greffon permettant pour l’enregistrement en continu de recrutement de cellules progénitrices et évacuation des lymphocytes mature.

Real Time In Vivo suivi des Thymocytes dans la chambre antérieure de le œil par microscopie à balayage Laser

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Les changements morphologiques se produisent dans les cellules de fibroblaste sensibles au système immunitaire après l'activation et favorisent des changements dans le recrutement cellulaire. Utilisation de l'imagerie à 2 photons en conjonction avec une protéine génétiquement modifiée spécifique au fibroblaste 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) ligne de souris et vert fluorescent marqué lipopolysaccharide-FITC, nous pouvons illustrer l'apport très spécifique de lipopolysaccharide...

In Vivo Deux-Couleur 2-Photon Imagerie des cellules de reporter génétiquement marqués dans la peau

Le présent protocole décrit une procédure de radiologie interventionnelle établie pour l’injection intrathymique chez la souris afin d’éviter le risque de chirurgie ouverte et d’améliorer la précision des injections percutanées à l’aveugle.

Une technique mini-invasive, précise et efficace pour l’injection intrathymique chez la souris

Ici, nous présentons un protocole d’imagerie intravitale du poumon gauche de souris transplantée à l’aide de la microscopie à deux photons. Il s’agit d’un outil précieux pour étudier la dynamique cellulaire et les interactions en temps réel après une transplantation pulmonaire murine.

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Cette étude présente une approche in vivo d’imagerie à deux photons pour visualiser les structures des terminaisons axoniques des mécanorécepteurs (LTMR) à faible seuil dans la peau des pattes avant des souris. Utilisant des images répétées et haute résolution d’axones individuels, cette méthode offre une nouvelle plateforme pour étudier la structure et la fonction du circuit sensoriel cutané pendant le développement et chez l’adulte.

Imagerie intravitale à deux photons de la morphologie des axones sensoriels tactiles dans la peau de souris

Apprenez l'imagerie in situ du thymus par microscopie biphotonique chez la souris. Cette méthode permet d'observer la migration cellulaire et les mécanismes de sélection des lymphocytes T en immunologie.

Dans l'imagerie in situ de la souris en utilisant deux Thymus microscopie biphotonique

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