Name: Dans limagerie in situ de la souris en utilisant deux Thymus microscopie biphotonique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-01-25T19:52:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: Apprenez l'imagerie in situ du thymus par microscopie biphotonique chez la souris. Cette méthode permet d'observer la migration cellulaire et les mécanismes de sélection des lymphocytes T en immunologie.

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Nous remercions Matt Paul et Jimmy Wu pour l&#39;assistance technique.

Le transfert adoptif Injecter nouveau-nés avec 50 100 ul de la moelle osseuse à l&#39;aide d&#39;une seringue d&#39;insuline 2-4 fois durant les 3-7 premiers jours de vie, avec une finale donateurs-to-host ratio de 1:1. But pour un site d&#39;injection sous le sternum et la cage thoracique, mais au-dessus de l&#39;intestin et l&#39;estomac. Insérez l&#39;aiguille suffisamment loin pour pénétrer le péritoine, attention à ne pas percer la membrane. Il n&#39;est pas rare pour certains de la moelle osseuse d&#39;être perdus lors de l&#39;injection. Vous pouvez réduire la perte en desserrant votre emprise sur le chiot que vous injectez de manière à permettre à la peau de l&#39;expansion et, puis, lentement retirer l&#39;aiguille. Dissection de Thymus Faire une incision dans la ligne médiane et couper ou déchirer la peau pour révéler la cage thoracique. Accrochez-vous à le sternum et couper à travers le péritoine et le diaphragme. Coupez les côtés de la cage thoracique pour révéler la cavité thoracique. Le thymus est au-dessus du cœur. Afin de préserver la structure du thymus, s&#39;accrocher à des tissus environnants comme vous disséquer le thymus. Rincer le thymus avec du PBS pour l&#39;empêcher de sécher durant la dissection. Doucement taquiner loin l&#39;excès de tissu sur la surface de la capsule du thymus et coupent les deux lobes. Préparation des tissus pour l&#39;imagerie Utilisez une colle tissulaire vétérinaires de coller le thymus pas d&#39;une lamelle carré. Utilisez un pipetteman de mettre une fraction d&#39;un microlitre de colle. Étendre la colle à la longueur et la largeur approximative du thymus. Steady le thymus contre la lamelle et le faire glisser en place. Deux-Photon Imaging Le tissu est immergé dans du DMEM sans rouge de phénol qui est perfusé avec 95% d&#39;oxygène et de dioxyde de carbone de 5% et chauffé à 37 ° C. D&#39;excitation à deux photons a été réalisée en utilisant un Spectra-Physics MaiTai laser réglé à 900nm, et de la PCP, la GFP, YFP et Texas Red émission de lumière a été séparé en utilisant un 495, 515, 560 miroirs dichroïques et recueillies à l&#39;aide de détecteurs de PMT.

<ol><li>Kyewski, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeding+of+thymic+microenvironments+defined+by+distinct+thymocyte-stromal+cell+interactions+is+developmentally+controlled%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled.</a> J Exp Med. 166, 520-538 (1987).</li>
<li>Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+microenvironments+for+T+cell+differentiation+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection.</a> Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).</li>
<li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Migration+of+Positively+Selected+Thymocytes+Visualized+in+Real+Time%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time.</a> PLoS Biol. 3, (2005).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

L&#39;imagerie à deux photons dans le thymus nous permet d&#39;examiner dans la vie, les organes intacts les interactions et les migrations qui sous-tendent les épreuves de sélection dans le thymus.

dans l&#39;imagerie in situ de la souris en utilisant deux thymus microscopie biphotonique

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Microscopie à deux photons (TPM) nous permet de l&#39;image en profondeur dans le thymus et de documenter les événements qui sont importants pour le développement des thymocytes. Pour suivre la migration des individus dans une foule de thymocytes, nous générons des chimères néonatale où moins de un pour cent des thymocytes sont issus d&#39;un donneur qui est transgénique pour une protéine ubiquitaire expresse fluorescentes. Pour générer ces chimères hématopoïétiques partielle, les bénéficiaires néonatale sont injectés avec de la moelle osseuse entre 3-7 jours d&#39;âge. Après 4-6 semaines, la souris est sacrifiée et le thymus est soigneusement disséquée et bissected préservant l&#39;architecture du tissu qui sera imagé. Le thymus est collé sur une lamelle en préparation pour l&#39;imagerie ex vivo par TPM. Pendant l&#39;imagerie du thymus est conservé dans du DMEM sans rouge de phénol qui est perfusé avec 95% d&#39;oxygène et de dioxyde de carbone de 5% et chauffé à 37 ° C. En utilisant cette approche, nous pouvons étudier les événements requis pour la génération d&#39;un répertoire des cellules T diverses.

Nous présentons, étape par étape les instructions pour la génération des chimères néonatale ainsi que la dissection et la préparation du thymus pour l&#39;imagerie ex vivo par microscopie biphotonique 2.

Dans l&#39;imagerie in situ de la souris en utilisant deux Thymus microscopie biphotonique

La microscopie biphotonique (TPM) nous permet d'imager les zones profondes du thymus et de documenter les événements importants pour le développement des thymocytes. Pour suivre le ...

L'imagerie à deux photons est utile en immunologie car elle nous permet de suivre la migration d'une cellule unique au moment où elle interagit avec son environnement. En suivant la migration au niveau du thymus, nous pouvons caractériser à l'aide de la microscopie à deux photons le mécanisme de sélection positive et négative.Bonjour, je suis Ina Lottie du laboratoire de la Dre Ellen Roby à l'Université de Californie à Berkeley. Et moi, c'est Paul Herzmark, également du laboratoire d'Ellen Roby. Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment nous réalisons l'imagerie in situ du tissu thymique, et je vais vous expliquer comment nous utilisons notre microscope à deux photons pour imager le thymus.Et je vais vous montrer les étapes menant à l'imagerie à deux photons. Celles-ci incluent les procédures suivantes : l'isolement de cellules souches hématopoïétiques à partir de la moelle osseuse, le transfert adoptif de cellules de la moelle osseuse chez des nouveau-nés, la dissection et la bissection du thymus, ainsi que la préparation du tissu pour l'imagerie par microscopie à balayage laser à deux photons. Commençons donc.Avant de pouvoir préparer le thymus pour l'imagerie, nous devons d'abord transférer de manière adoptive des cellules de la moelle osseuse dans une souris néonatale. Ces cellules de la moelle osseuse ont été isolées à partir des pattes postérieures de souris transgéniques exprimant de manière ubiquitaire la GFP. Il s'agit d'une seringue à insuline contenant 50 microlitres de moelle osseuse.Nous effectuons deux à quatre injections chez des hôtes âgés de trois à sept jours, en utilisant la moelle osseuse d'un donneur pour chaque petit injecté. Ici, nous avons un petit âgé de cinq jours ; pincez la peau vers l'arrière pour empêcher le petit de bouger pendant l'injection et pour maintenir la peau tendue. Visez un site d'injection situé sous les poumons et la cage thoracique, mais au-dessus de l'intestin et de l'estomac.Pendant l'injection, relâchez progressivement votre prise sur la peau pour permettre son expansion. Enfin, retirez lentement la seringue afin de limiter la quantité de moelle osseuse perdue. Ces souris seront laissées à se développer pendant quatre à six semaines, puis le thymus pourra être prélevé pour l'imagerie.Après quatre à six semaines, le thymus peut être retiré. Pour l'imagerie, j'utiliserai une paire de pinces et de ciseaux de grande taille ainsi qu'une paire de pinces et de ciseaux de petite taille. Cet animal a donc été sacrifié conformément à notre protocole d'utilisation des animaux et aspergé d'éthanol.Et je vais utiliser la pince large pour pincer la peau et pratiquer une incision au niveau de la ligne médiane. Ensuite, je peux soit utiliser les ciseaux pour couper le long de la ligne médiane, soit déchirer la peau en la séparant du péritoine, puis épingler la peau pour exposer la cavité thoracique. Je vais utiliser le sternum comme point d'ancrage pendant que je coupe à travers le péritoine, que je pénètre dans la cavité thoracique à travers le diaphragme, puis que je coupe le long des bords de la cage thoracique.Et vous pouvez voir le thymus qui se trouve juste au-dessus du cœur. Je vais les remettre en place. Voilà le thymus.Je vais éviter de le toucher. Utilisez la plus petite pince, tout en maintenant toujours le tissu autour du thymus. Bon, maintenant je vais le pulvériser avec du PBS et commencer à retirer certains tissus excédentaires.Je vais donc utiliser le tissu autour du thymus pour le maintenir. Lorsque je nettoie le thymus, je vais retirer le tissu excédentaire en le coupant soigneusement. Le thymus comporte deux lobes qu'il faut également séparer pendant le nettoyage.Mais tout d'abord, je vais retirer tous ces vaisseaux sanguins supplémentaires qui se trouvent à la surface du thymus. Je fais très attention de ne pas perturber l'architecture du thymus que nous allons imager. Je n'enlève donc que les tissus situés exactement à la surface.Maintenant, je vais commencer doucement à séparer les deux lobes. Il s'agit du lobe ventral et du lobe dorsal que nous allons séparer, en coupant délicatement le tissu et en l'écartant progressivement. Nous devons éviter que le tissu ne s'assèche, nous allons donc y projeter un peu de PBS.J'ai maintenant séparé les deux lobes. Voici le lobe dorsal, qui présente une forme caractéristique de guitare. Et voici le lobe ventral, juste ici.Je vais retirer les tissus excédentaires de chacun de ces lobes afin que la zone d'imagerie soit débarrassée des tissus superflus. Toutefois, je vais laisser une petite quantité de tissu pour pouvoir tenir le thymus. Lors de l'imagerie, nous serions en train d'acquérir des images à travers ce tissu excédentaire, ce qui n'est vraiment pas nécessaire, et la suppression de ce tissu améliorera la qualité de nos images.Nous disposons désormais de deux lobes divisés, prêts à être montés sur une lame couvre-objet pour l'imagerie. Pour préparer les lobes thymiques divisés en deux en vue de l'imagerie, vous aurez besoin d'un adhésif tissulaire vétérinaire et de lames couvre-objets de 18 par 18. J'aime utiliser une pipette à piston pour déposer une fraction de microlitre de colle sur la lame couvre-objet.Je vais donc déposer une goutte de colle d'une longueur approximative du thymus que nous allons imager. Ensuite, j'aime l'étaler. Si elle a la largeur du thymus, je vais à nouveau placer les deux lobes sur le même coverslip.Je vais donc en placer un autre juste ici. Je vais donc prendre le lobe à partir du tissu excédentaire et simplement le déposer sur la lamelle, puis le déplacer vers la zone où se trouve la colle. Je vais faire de même pour l'autre lobe, en touchant à nouveau la lamelle là où il n'y a pas de colle afin de stabiliser ma main, puis en posant l'autre globe thymique sur la lamelle.Maintenant que nous avons fixé les deux hémisphères thymiques sur la lamelle, nous allons la remettre à Paul pour l'observation en microscopie. Merci Ina. Prenons cet échantillon et plaçons-le dans le milieu DME que nous utiliserons pour l'observation.Voici donc notre dispositif de microscopie à deux photons. La microscopie à deux photons est très efficace pour l'imagerie des cellules immunitaires, car elle permet d'observer en profondeur dans le thymus et de visualiser les cellules fluorescentes en mouvement. Elle utilise un laser infrarouge pulsé pour induire la fluorescence des cellules.Nous disposons dans notre microscope à ceinture quatre caméras différentes qui nous permettent de visualiser simultanément quatre couleurs distinctes, ainsi que d'utiliser un objectif spécial, offrant un grossissement de 20 x. Il s'agit d'un objectif particulier qui plonge dans le milieu DME dans lequel nous avons immergé le thymus, ce qui lui confère une ouverture numérique de 0,95, excellente, rendant nos cellules très lumineuses. Afin de maintenir le tissu en bon état, nous faisons barboter à travers le milieu DMEM un mélange de 95 % d’oxygène et de 5 % de CO₂.Ensuite, elle est pompée vers la chambre de perfusion où elle est chauffée à 37 degrés, et c'est là que les lobes du thymus sont immergés. Grâce à ce système, nous pouvons maintenir les cellules du thymus en bon état pendant quatre heures d'observation. J'ai donc montré comment configurer l'observation au microscope à deux photons.Examinons maintenant certains de nos résultats dans ce film en boucle. Vous pouvez voir le thymus que nous avons imagé en quatre couleurs différentes ici. Les vaisseaux sanguins du thymus apparaissent en rouge, et les cellules dendritiques de l'hôte, exprimant la protéine fluorescente jaune sous le contrôle d'un promoteur spécifique aux cellules dendritiques, apparaissent en jaune.Les thymocytes bleus et verts que vous voyez ici proviennent de deux donneurs différents que nous utilisons pour créer une chimère néonatale à l’aide d’une technique de transfert adoptif que Ena vous a montrée précédemment. Les cellules vertes sont des thymocytes exprimant la protéine fluorescente verte, et les cellules bleues sont des thymocytes provenant du donneur qui exprimait la protéine fluorescente cyan. Il s’agit de la même vidéo en boucle que je vous ai montrée auparavant, mais je souhaite vous montrer la tridimensionnalité des jeux de données que nous recueillons pour obtenir ces vidéos.Nous nous concentrons sur un plan et prenons une image, puis nous focalisons légèrement plus en profondeur et prenons une autre image, et encore un peu plus profondément une autre image. Ensuite, pour ce film, nous sommes descendus d’environ 60 micromètres, puis nous avons répété ce volume d’images environ toutes les 30 secondes afin d’obtenir un volume en mouvement. Ce film a été enregistré pendant environ 20 minutes.Ainsi, nous pouvons suivre les cellules en trois dimensions au fil du temps. Nous venons de vous montrer comment nous imager le thymus à l’aide de la microscopie à deux photons. Les aspects les plus importants de cette procédure sont, premièrement, l’injection de moelle osseuse provenant de donneurs chez les nouveau-nés.Deux, disséquer et bi, disséquer le thymus sans endommager sa structure. Trois, fixer fermement le thymus sur un verre de couverture quatre imagerie à l’aide d’un microscope à deux photons. L’imagerie dans le thymus peut répondre à de nombreuses questions concernant le développement des thymocytes et la génération d’un répertoire diversifié de lymphocytes T.Voilà, c'est terminé. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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