Name: Isolement des cellules endothéliales lymphatiques dermiques murines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Découvrez l'isolation de cellules endothéliales lymphatiques dermiques murines par billes magnétiques, une méthode alternative au tri cellulaire par fluorescence. Ce protocole permet d'obtenir des cellules LYVE1+ avec haute pureté pour études physiologiques in vitro.

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Ce travail a été soutenu par la Fondation hellénique pour la recherche et l’innovation (00376), les National Institutes of Health, le National Cancer Institute (NCI) [Grant R15CA231339], la subvention de l’école de pharmacie du Texas Tech University Sciences Center (TTUHSC) School of the Sciences Office of the Sciences (à C.M.M.), et par le College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe start-up, les National Institutes of Health (NIH) par l’intermédiaire du National Institute of General Medical Science [Subvention P20 GM103424-21] et le Research Competitiveness Subprogram (RCS) du Louisiana Board of Regents par l’intermédiaire du Board of Regents Support Fund (LEQSF(2021-24)-RD-A-23) (à G.M.). L’équipement TTUHSC commun utilisé a été obtenu grâce aux subventions RP190524 et RP200572 de l’Institut de recherche sur la prévention du cancer du Texas (CPRIT). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la décision d’écrire ou la préparation du manuscrit. Le résumé graphique de la figure 1A a été créé avec BioRender.com.

Isolement des cellules endothéliales des capillaires lymphatiques dermiques murins

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<li>Lapinski, P. E., King, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+lymphatic+endothelial+cells+from+lung+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).</li>
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<li>Schledzewski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+endothelium-specific+hyaluronan+receptor+LYVE-1+is+expressed+by+stabilin-1%2B%2C+F4%2F80%2B%2C+CD11b%2B+macrophages+in+malignant+tumours+and+wound+healing+tissue+in+vivo+and+in+bone+marrow+cultures+in+vitro%3A+implications+for+the+assessment+of+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Lymphatic endothelium-specific hyaluronan receptor LYVE-1 is expressed by stabilin-1+, F4/80+, CD11b+ macrophages in malignant tumours and wound healing tissue in vivo and in bone marrow cultures in vitro: implications for the assessment of lymphangiogenesis.</a> Journal of Pathology. 209 (1), 67-77 (2006).</li>
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<li>Connell, F., Brice, G., Mortimer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+of+primary+lymphedema%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization of primary lymphedema.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 140-146 (2008).</li>
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<li>Garrafa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+purification%2C+and+heterogeneity+of+human+lymphatic+endothelial+cells+from+different+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphology%22%5BJournal%5D)">Isolation, purification, and heterogeneity of human lymphatic endothelial cells from different tissues.</a> Lymphology. 38 (4), 159-166 (2005).</li>
<li>Kazenwadel, J., Secker, G. A., Betterman, K. L., Harvey, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assays+using+primary+embryonic+mouse+lymphatic+endothelial+cells+uncover+key+roles+for+FGFR1+signalling+in+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro assays using primary embryonic mouse lymphatic endothelial cells uncover key roles for FGFR1 signalling in lymphangiogenesis.</a> PLoS One. 7 (7), e40497(2012).</li>
<li>Steele, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+egress+via+lymphatic+vessels+is+tuned+by+antigen+encounter+and+limits+tumor+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cell egress via lymphatic vessels is tuned by antigen encounter and limits tumor control.</a> Nature Immunology. 24 (4), 664-675 (2023).</li>
<li>Mammoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+age-dependent+changes+in+cell+size+on+endothelial+cell+proliferation+and+senescence+through+YAP1%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Effects of age-dependent changes in cell size on endothelial cell proliferation and senescence through YAP1.</a> Aging. 11 (17), 7051-7069 (2019).</li>
<li>Regina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+ageing+and+endothelial+cell+senescence%3A+Molecular+mechanisms+of+physiology+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Vascular ageing and endothelial cell senescence: Molecular mechanisms of physiology and diseases.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 159, 14-21 (2016).</li>
<li>Muhleder, S., Fernandez-Chacon, M., Garcia-Gonzalez, I., Benedito, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+sprouting%2C+proliferation%2C+or+senescence%3A+tipping+the+balance+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Endothelial sprouting, proliferation, or senescence: tipping the balance from physiology to pathology.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (4), 1329-1354 (2021).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Le système lymphatique est un régulateur important de la fonction homéostatique du corps, les fonctions les plus importantes étant le maintien du plasma liquide, l’élimination des sous-produits du métabolisme cellulaire et des molécules toxiques, l’absorption des lipides et le trafic des cellules immunitaires 1,19. L’identification de marqueurs appropriés a provoqué une explosion de nouvelles données dans le domaine lymphatique, révélant de nouvelles fonctions du...

Le système lymphatique joue un rôle central dans la physiologie humaine. Il est considéré comme un facteur homéostatique vital, qui facilite des fonctions importantes, telles que le maintien de l’équilibre hydrique tissulaire-plasmatique, la surveillance immunitaire et l’absorption des lipides1, ainsi que des fonctions récemment identifiées, telles que la capacité de réparation du cœur2 et la capacité de régénération de l’os et l’hématopoïèse3. Malgré le rôle important du système lymphatique, plusieurs aspects du rôle des lymphatiques, ainsi que les mécanismes moléculaires régissant certains paramètres physiologiques et les réponses restent insaisissables. De plus, les anomalies vasculaires lymphatiques sont des facteurs déclenchants ou détériorants dans certaines conditions physiopathologiques. Des exemples bien connus sont les lymphœdèmes primaires et secondaires, en fonction de l’origine génétique ou non génétique de la maladie, respectivement, tandis que le rôle du système lymphatique sur la croissance tumorale primaire et la dissémination métastatique est crucial, car il peut agir comme un conduit pour les métastases et un modulateur des fonctions immunitaires1.
Le retard dans l’étude et la connaissance du système vasculaire lymphatique par rapport au système vasculaire sanguin est principalement dû à la découverte ultérieure du système lymphatique par rapport au système vasculaire sanguin et au retard dans l’identification des marqueurs moléculaires spécifiques du lymphe. Cela s’est considérablement amélioré au cours des dernières décennies, conduisant à l’altération de l’image conventionnelle des lymphatiques à l’état d’équilibre et dans des états pathologiques1. Semblable à l’angiogenèse, la lymphangiogenèse est la formation de nouveaux vaisseaux lymphatiques à partir de vaisseaux préexistants et joue un rôle central dans le développement d’un large éventail de maladies 4,5,6. Cependant, contrairement à l’angiogenèse, l’étude de la lymphangiogenèse a été limitée à des modèles principalement in vivo axés sur la formation de vaisseaux développementaux et les défauts structurels dans des modèles pathologiques. L’isolement des cellules endothéliales lymphatiques est important pour les études in vitro, et cela peut être fourni par le protocole présenté.
Plusieurs protocoles d’isolement endothélial lymphatique chez la souris ont été développés, qui nécessitent l’utilisation du tri cellulaire activé par fluorescence7. L’avantage du trieur de cellules, lorsqu’il est disponible, est le degré de pureté plus élevé, contrairement à l’isolement à base de billes, ce dernier offrant un rendement plus élevé. Le protocole utilise l’expression du récepteur endothélial lymphatique 1 (LYVE-1), un marqueur endothélial lymphatique, important pour le trafic cellulaire dans les vaisseaux lymphatiques 4,8. Étant donné que l’expression de LYVE-1 est limitée aux capillaires lymphatiques et non aux vaisseaux lymphatiques collecteurs, la technique convient à l’isolement des cellules endothéliales lymphatiques spécifiquement à partir des capillaires lymphatiques, contrairement à d’autres marqueurs lymphatiques, tels que la podoplanine, qui sont exprimés uniformément dans toutes les cellules endothéliales lymphatiques9. Pour le protocole, d’autres marqueurs lymphatiques importants qui n’étaient pas transmembranaires, tels que Prox1, ont été exclus.
Comme le résultat physiologique était la lymphangiogenèse, qui est généralement initiée au niveau des capillaires lymphatiques, LYVE-1 a été sélectionné comme cible en raison de sa sélectivité dans ces cellules et parce que l’anticorps sélectionné offrait un rendement élevé. Les enzymes utilisées étaient la collagénase de type II, qui est généralement connue pour être plus efficace dans la dissociation du collagène que le type I10, et la dispase, une protéase plus large, régulièrement utilisée pour la séparation dermis-épiderme11 ; Cependant, d’autres enzymes pour la séparation des tissus ont été signalées12,13 et peuvent être utilisées. L’objectif de ce protocole est de décrire une méthode d’isolement des cellules endothéliales lymphatiques dermiques à partir des capillaires lymphatiques de souris adultes à haut rendement en utilisant la purification par billes magnétiques, en particulier dans les endroits où le tri cellulaire activé par fluorescence n’est pas facilement disponible. La méthode convient aux applications où la pureté des cellules endothéliales lymphatiques peut être compromise pour les applications en aval.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mu ; m Filtres à seringue</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-719C</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture tissulaire 100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Boîtes de culture tissulaire</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012921</td><td></td></tr><tr><td>Tondeuse à poils d’animaux</td><td>Wahl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution antibiotique-antimycosique 100x</td><td>Fisher Scientific</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Pince émoussée</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>11992-20</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>Passoire cellulaire 40 &mu ; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>542040</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à cellules 70 &mu ; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>542070</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td></td><td></td><td></td>de CO2</tr><tr><td>Collagène I, haute concentration Queue de rat</td><td>Corning</td><td>354249</td><td>diluer dans 0,02 M Acide acétique dans H2O</td></tr><tr><td>Collagénase Type II</td><td>Life Technologies</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-995-073</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’ADN I (2 500 U/mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>90083</td><td></td></tr><tr><td>Dynal MPC-L Concentrateur de particules</td><td>magnétiques Invitrogen</td><td>120-21D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3690</td><td></td></tr><tr><td>Base de croissance des cellules endothéliales Medium & Supplément (moyen LEC)</td><td>R& D Systems</td><td>CCM027</td><td></td></tr><tr><td>Chambre d’euthanasie</td><td>Euthanex Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td> fins <td>Outils scientifiques</td><td>fins 11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux fins-Outils scientifiques fins tranchants</td><td></td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-souris F4/80 Anticorps Biolegend</td><td></td><td>123107</td><td></td></tr><tr><td>Perles magnétiques IgG anti-lapin de chèvre</td><td>New England Biolabs</td><td>S1432S</td><td></td></tr><tr><td>LARC-A E-Z Chambre d’induction d’anesthésie</td><td>Euthanex Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG Beads</td><td>Thermo Scientific</td><td>21356</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Solution 4 % dans PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30256FS</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-souris LYVE-1</td><td>ReliaTech GmbH</td><td>103-PA50</td><td></td></tr><tr>Incubateur <td></td><td></td><td></td><td>rotatif/secouant</td></tr><tr><td>Tubes en polypropylène à fond rond</td><td>Corning</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Filtres à seringue w 0.2 &mu ; m Pores</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-719C</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-300-120</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement des cellules endothéliales lymphatiques dermiques murines

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

Le système lymphatique participe à la régulation de la surveillance immunitaire, de l’absorption des lipides et de l’équilibre des fluides tissulaires. L’isolement des cellules endothéliales lymphatiques murines est un processus important pour la recherche lymphatique, car il permet de réaliser des expériences in vitro et biochimiques sur les cellules isolées. De plus, le développement de la technologie Cre-lox a permis de dénombrer des gènes spécifiques aux tissus qui ne peuvent pas être ciblés à l’échelle mondiale, ce qui a permis de déterminer avec précision leur rôle dans les tissus étudiés. La dissection du rôle de certains gènes dans la physiologie lymphatique et la physiopathologie nécessite l’utilisation de promoteurs spécifiques lymphatiques, et donc, la vérification expérimentale des niveaux d’expression des gènes ciblés.
Les méthodes d’isolement efficace des cellules endothéliales lymphatiques de souris de type sauvage ou transgéniques permettent d’utiliser des essais ex vivo et in vitro pour étudier les mécanismes régulant les fonctions lymphatiques et l’identification des niveaux d’expression des protéines étudiées. Nous avons développé, normalisé et présenté un protocole pour l’isolement efficace des cellules endothéliales lymphatiques dermiques (DLEC) murines par purification par billes magnétiques basée sur l’expression de LYVE-1. Le protocole décrit vise à doter les chercheurs d’un outil permettant de mieux comprendre et d’élucider les acteurs importants des fonctions des cellules endothéliales lymphatiques, en particulier dans les installations où l’équipement de tri cellulaire activé par fluorescence n’est pas disponible.

La méthode a été développée pour identifier l’expression protéique d’une petite GTPase, RhoA, dont le gène codant a été floxé dans les deux allèles et supprimé sous l’effet du promoteur endothélial lymphatique spécifique induit par le tamoxifène, Prox1-CreERT2 18. Les LEC isolés peuvent être cultivés jusqu’à quatre générations, après quoi ils deviennent sénescents. Ils ont été congelés, décongelés et stimulés avec succès avec de l’angiopoïétine-2. En raison du nombre limité de ...

Cet article décrit une méthode d’isolement par billes magnétiques de cellules endothéliales murines à partir de capillaires lymphatiques dermiques. Les cellules endothéliales lymphatiques isolées peuvent être utilisées pour des expériences in vitro en aval et l’analyse de l’expression des protéines.

Isolement des cellules endothéliales lymphatiques dermiques murines

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic ...

Les recherches de notre groupe portent sur la délimitation des mécanismes régulant la physiologie des cellules endothéliales. Ce protocole décrit une méthode d’isolement des cellules endothéliales rénales à base de billes magnétiques, en particulier à partir de capillaires lymphatiques thermiques, dans des installations où le tri cellulaire activé par fluorescence n’est pas disponible. Le protocole permet d’isoler des cellules endothéliales lymphatiques de souris transgéniques pour étudier leur physiologie in vitro.Il est particulièrement adapté lorsque la pureté des cellules endothéliales lymphatiques peut être compromise pour des applications en aval. Ce processus fournit un rendement élevé de cellules endothéliales lymphatiques obtenues à partir des capillaires lymphatiques et non d’autres vaisseaux collecteurs. C’est aussi une belle alternative dans le cas de l’absence d’installations de tri cellulaire.

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Une préparation hautement purifiée de cellules de souris pulmonaires dendritiques est décrite. Un accent particulier est donné à l'isolement de sous-ensemble de cellules dendritiques conventionnelles.

L&#39;isolement des cellules de souris poumon dendritiques

Ce protocole décrit en détail une méthode pour isoler des cellules présentant l'antigène à partir de thymus humain par l'intermédiaire de différentes étapes de digestion enzymatique du tissu suivie d'une centrifugation de densité de la suspension de cellules individuelles et enfin le tri magnétique et / ou FACS des populations de cellules d'intérêt.

Isolement des cellules dendritiques myéloïdes et les cellules épithéliales du thymus humain

L’isolement des cellules stromales des ganglions lymphatiques est une procédure en plusieurs étapes comprenant la digestion enzymatique et la désagrégation mécanique pour obtenir des cellules réticulaires fibroblastiques, des cellules endothéliales lymphatiques et sanguines. Dans la procédure décrite, une digestion courte est combinée à une désagrégation mécanique automatisée pour minimiser la dégradation des marqueurs de surface des cellules stromales viables des ganglions lymphatiques.

Isolement de cellules murines ganglions lymphatiques stromales

L'objectif de ce protocole est d'isoler les cellules endothéliales lymphatiques qui tapissent malformation lymphatique navires et prépuces kystiques humains en utilisant des cellules activées par fluorescence (FACS). La culture de cellules et de l'expansion ultérieure de ces cellules permet un nouveau niveau de sophistication expérimental pour les études génétiques, protéomiques, fonctionnels et de différenciation cellulaire.

Isolement des cellules endothéliales humaines lymphatique par multi-paramètres fluorescence tri cellulaire activé

Le comportement des fibroblastes sous-tend un spectre d’entités cliniques, mais ils restent mal caractérisés, en grande partie en raison de leur hétérogénéité inhérente. La recherche traditionnelle sur les fibroblastes repose sur la manipulation in vitro, masquant le comportement des fibroblastes in vivo. Nous décrivons un protocole basé sur FACS pour l’isolement des fibroblastes de peau de souris qui ne nécessite pas de culture cellulaire.

Murin fibroblastes dermiques Isolation par FACS

Ce protocole décrit la digestion enzymatique de la peau de souris dans un milieu riche en nutriments, suivie d’une séparation par gradient pour isoler les leucocytes.  Les cellules ainsi dérivées peuvent être utilisées pour diverses applications en aval. Il s’agit d’une alternative efficace, économique et améliorée aux machines de dissociation des tissus et aux protocoles de digestion tissulaire basés sur la trypsine et la dispase.

Isolement de leucocytes infiltrant de la peau de souris Utilisation de digestion enzymatique et séparation par gradient

Nous décrivons ici un protocole permettant d’isoler les cellules myéloïdes de la peau de souris et de drainer les ganglions lymphatiques après injection intradermique de sporozoïtes de Plasmodium. La cytométrie en flux des cellules collectées fournit un test fiable pour caractériser la réponse inflammatoire de la peau et des ganglions lymphatiques drainants au parasite.

Myéloïde cellule d&#39;isolement de la peau de souris et Vidange ganglion Après intradermique immunisation avec Live Atténuée<em&gt; Plasmodium</em&gt; sporozoïtes

Ce protocole vise à identifier les populations de cellules endothéliales lymphatiques dans le foie à l’aide de marqueurs décrits. Nous utilisons la collagénase IV et DNase et un hachage doux de tissu, combiné à la cytométrie en flux, afin d’identifier une population distincte de cellules endothéliales lymphatiques.

Digestion du foie murin pour une cytométrie de cellules endothéliales lymphatiques

Les cellules endothéliales microvasculaires des muscles squelettiques (CEMG) forme la paroi des capillaires musculaires et réglementer les deux, échange de fluides/molécules et la migration des cellules (système immunitaires) entre le sang et les tissus musculaires. Isolement des primaire murine CEMG, comme décrit ici, permet des études in vitro complètes de l’unité « myovascular ».

Isolement de cellules endothéliales microvasculaires primaires murines Muscle squelettique

Ici, nous décrivons et démontrons un protocole pour l’isolement des cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques primaires (LSEC) de souris. Le protocole est basé sur la perfusion de collagénase hépatique, la purification des cellules non parenchymateuses par centrifugation à basse vitesse et la sélection de billes magnétiques CD146. Nous phénotypons et caractérisons également ces LSTEC isolés à l’aide de la cytométrie en flux et de la microscopie électronique à balayage.

Isolement et caractérisation des cellules endothéliales sinusoïdales primaires du foie de souris

Les cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées (LLECs), un type de cellules intracrâniennes récemment identifiées, ont des fonctions mal comprises. Cette étude présente un protocole reproductible pour la récolte de LLEC à partir de souris et l’établissement de cultures primaires in vitro . Ce protocole est conçu pour permettre aux chercheurs de se plonger dans les fonctions cellulaires et les implications cliniques potentielles des LLECs.

Récolte et culture primaire de cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées

Découvrez l'isolation de cellules endothéliales lymphatiques dermiques murines par billes magnétiques, une méthode alternative au tri cellulaire par fluorescence. Ce protocole permet d'obtenir des cellules LYVE1+ avec haute pureté pour études physiologiques in vitro.

Isolement des cellules endothéliales lymphatiques dermiques murines

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