Name: Isolement et identification des cellules de niche limbique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Découvrez l'isolement et l'identification des cellules de niche limbique humaines pour la médecine régénérative. Cette méthode par séquençage unicellulaire aide les chercheurs à étudier les voies de signalisation et les applications cliniques pour restaurer la vision.

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Merci à Wei Wang, Lingjuan Xu et Rong Liu pour les conseils sur ce travail, Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You et Li Guigang pour avoir fourni une partie du matériel, Guanyu Su pour l’écriture du manuscrit, Xiao Zhou, Yihong Xiong et Huatao Xie pour la correction du manuscrit, et Guigang Li pour ses conseils complets. Cette étude a été soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 82070936, 81470606, 81570819), projet de recherche scientifique sur la santé et la planification familiale de la province du Hubei (n° 133). WJ2017M073), les dix principaux projets de recherche médicale translationnelle de l’hôpital de Tongji (n° 2016ZHYX20), le projet de formation des jeunes pionniers de la médecine dans la ville de Wuhan (n° 2015whzqnyxggrc10), le programme de recrutement de talents mondiaux (G2022154028L), le projet de la Commission nationale de la santé de la province du Hubei en 2022 (WJ2021ZH0005) et la fondation de construction du département des finances du Hubei en 2022 (42000022815T000000102)

Les tissus Limbus provenant de donneurs âgés de 50 à 60 ans ont été obtenus auprès de la banque d’yeux de la Croix-Rouge de l’hôpital de Tongji (Wuhan, Chine). Le protocole a été approuvé par le Comité d’éthique de Tongji et a été mené conformément à la Déclaration d’Helsinki.
1. Isolement
<ol><li>Obtenir du tissu limbique à partir d’un milieu de stockage cornéen à moyen terme et opérer dans des conditions aseptiques sur un établi ultra-propre.</li>
	<li>Grattez et retirez l’iris et l’endothélium autour de la cornée à l’aide d’une lame ronde chirurgicale stérile.</li>
	<li>Coupez le tissu limbique en douze morceaux de taille égale à l’aide d’une lame chirurgicale laissant 1 mm de part et d’autre de la cornée et de la sclérotique.</li>
	<li>Transférez les tissus du limbe dans une plaque de culture de 3,5 cm, ajoutez 1 mL de collagénase A (2 mg/mL, en milieu DF-12), pour immerger tous les tissus pour la digestion.</li>
	<li>Mettez la plaque dans l’incubateur cellulaire à 37 °C, digérez les tissus limbiques pendant 18 h. REMARQUE : Les procédures de suivi sont généralement effectuées le deuxième jour.</li>
	<li>Préparez une plaque de culture à 6 puits revêtue d’une matrice membranaire basale à 5 % (Matrigel).<ol><li>Enduire une matrice membranaire basale à 5 % (dissoute dans le MESCM [Tableau 1]) au fond du puits.</li>
		<li>Préparez des embouts de 200 μL et de 1 mL, un tube centrifuge de 15 mL et une plaque à 6 puits dans un sac stérilisé.</li>
		<li>Placez le sac stérilisé (y compris les embouts et le tube centrifuge) et une nouvelle plaque à 6 puits dans un environnement de -20 °C ou -80 °C pendant 20 minutes. Décongeler la matrice de la membrane basale au réfrigérateur à 4 °C.</li>
		<li>Retirez les pointes pré-refroidies, le tube centrifuge et la plaque à 6 puits de l’environnement à -20 °C ou -80 °C, puis effectuez les opérations suivantes sur l’établi ultra-propre.</li>
		<li>Transférez 50 μL de matrice de membrane basale à 5 % dans 1 mL de MESCM à l’aide d’un embout de 200 μL et mélangez-les doucement et uniformément.</li>
		<li>Transférer la matrice de la membrane basale à 5 % (dissoute dans MESCM) dans un puits d’une plaque de culture à 6 puits à l’aide de l’embout prérefroidi de 1 mL.</li>
		<li>Agitez doucement et horizontalement la plaque de culture à 6 puits, placez la plaque de culture à 6 puits dans l’incubateur cellulaire à 37 °C pendant environ 1 h, puis effectuez l’étape suivante.</li>
	</ol></li>
	<li>Après 18 heures de digestion, retirez le tissu limbique digéré par la collagénase A, il ne restera que quelques petits amas visibles et des tissus scléraux non digérés. REMARQUE : La microscopie à fort grossissement révèle un amas composé de nombreuses cellules densément emballées (y compris les LNC).</li>
	<li>À l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL, détacher les amas des tissus scléraux non digérés sous le stéréomicroscope.</li>
	<li>Transférez les grappes dans la plaque de culture de 3,5 cm et plongez-les dans 0,25 % d’ET, puis placez la plaque dans l’incubateur cellulaire pendant 15 min.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de MESCM avec 10 % de sérum knock-out pour arrêter la digestion cellulaire et pipeter doucement de haut en bas pour remettre les amas en suspension dans les cellules individuelles à l’aide d’un embout de pipette de 1 mL.</li>
	<li>Transférez la suspension cellulaire dans un tube centrifuge de 15 ml et centrifugez à 200 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Retirez le surnageant avec précaution sans perturber la précipitation des cellules, puis ajoutez 1 mL de MESCM pour remettre les cellules en suspension.</li>
	<li>Pipeter de haut en bas 2 à 3 fois jusqu’à ce que la précipitation de la cellule inférieure soit uniformément suspendue dans le MESCM à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL, et prendre une suspension de cellules de 20 μL pour le comptage des cellules.</li>
	<li>Transférez la suspension cellulaire sur la plaque à 6 puits revêtue d’une matrice de membrane basale à 5 % à l’aide d’un embout de pipette de 1 mL et augmentez le volume de MESCM à 2,5 mL.</li>
	<li>Secouez doucement la plaque à 6 puits horizontalement pour répartir uniformément les cellules.</li>
	<li>Transférez les cellules dans l’incubateur de culture après avoir été imagées et enregistrées. Observez et photographiez les cellules tous les jours, et changez de support tous les 3-4 jours.</li>
</ol>2. Identification de LNC
<ol><li>Coloration par immunofluorescence<ol><li>Digérer les LNC du fond de l’assiette à l’aide de 1 mL 0,25 % TE pendant 5 min dans l’incubateur cellulaire à 37 °C.</li>
		<li>Terminez la digestion en ajoutant 1 mL de MESCM (contenant du sérum knock-out), centrifugez la suspension cellulaire à 200 x g pendant 5 min et aspirez soigneusement le surnageant.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de MESCM pour remettre les cellules en suspension. Préparez une suspension cellulaire de 80 μL (4 × 103 cellules par lame) pour 4 lames (20 μL/lame) et utilisez un système de centrifugation pour déposer les cellules sur des lames de microscope selon les instructions du fabricant.</li>
		<li>Fixez les cellules (collées aux lames à l’étape 3) en utilisant du paraformaldéhyde à 4 % pendant environ 10 min, puis perméabilisez les cellules sur les lames avec 0,2 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 15 min.</li>
		<li>Bloquer les cellules pendant 1 h avec de l’albumine sérique bovine (BSA) à 2 % avant de les incuber avec des anticorps primaires (Pan-CK [1 :1000], Vim [1 :100], CD90 [1 :100], CD105 [1 :200], SCF [1 :100], PDGFRβ [1 :100]) sur un agitateur pendant une nuit à 4 °C. Après l’incubation, éliminer les anticorps primaires non liés en lavant (5 min/lavage, 3x) les lames avec du PBST (PBS + 0,1 % Tween 20).</li>
		<li>Incuber les anticorps secondaires correspondants (anticorps IgG anti-souris de l’âne TRITC [1 :1000], IgG anti-lapin de l’âne FITC [1 :500], IgG 488 anti-souris de l’âne [1 :300], IgG 594 anti-lapin de l’âne [1 :400]) pendant 1 h avec des anticorps IgG non spécifiques appropriés. Retirez l’anticorps secondaire non lié à l’aide de PBST (5 min/lavage, 3x).</li>
		<li>Contre-colorer les noyaux avec 5 μg/mL de DAPI (4',6-Diamidino-2-Phénylindole) et sceller les lames.</li>
		<li>Effectuer une imagerie par fluorescence à l’aide d’un microscope à fluorescence (grossissement : 400x ; Temps d’exposition : 50 ms).</li>
	</ol></li>
	<li>Réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (qPCR)<ol><li>Prenez le kit d’isolement de l’ARN pour extraire l’ARN total selon les instructions du fabricant.</li>
		<li>Utilisez un kit de transcription d’ADNc de grande capacité pour transcrire 1 à 2 μg d’ARN total en ADNc.</li>
		<li>Effectuez la transcription inverse (42 °C, 2 min ; 50 °C, 85 min) et la qPCR (95 °C, 5 min ; 95 °C, 10 s, 40 cycles) dans une solution de 20 μL contenant de l’ADNc (100 ng), du TaqMan Gene Expression Assay Mix (1 μL), du Master Mix PCR universel (10 μL) et du ddH2O (jusqu’à 20 μL).</li>
		<li>Utiliser la technique de tomodensitométrie comparative (ΔΔCT)4,9 pour examiner l’expression relative des gènes.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Caractérisation du LNC
<ol><li>Comptage cellulaire (hémocytomètre)<ol><li>Digérer les LNC du fond de la plaque en utilisant 0,25 % de TE pendant 5 min dans l’incubateur cellulaire à 37 °C.</li>
		<li>Terminez la digestion en ajoutant 1 mL de MESCM (contenant du sérum knock-out), centrifugez la suspension cellulaire à 200 x g pendant 5 min et aspirez soigneusement le surnageant.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de MESCM pour remettre les cellules en suspension, puis prélever 10 μL de suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 0,5 mL. Ajouter un volume égal de 0,4 % de solution colorante au bleu de trypan.</li>
		<li>Placez 10 μL de suspension de cellules colorées sur la zone de comptage de l’hémocytomètre et couvrez-la d’une lamelle pour le comptage. REMARQUE : Le nombre de cellules dans les cinq zones carrées du milieu est défini par « A » ; le nombre de cellules dans 1 mL est calculé comme suit : 5A × 10,4 × 2.</li>
	</ol></li>
	<li>Examen des marqueurs LNC et BMMSC par cytométrie en flux15<ol><li>Détecter l’expression de SCF, CD73, CD90 et CD105 dans les LNC et les BMMSCs à l’aide de la cytométrie en flux 15 (2-4 ×10 6 événements/échantillon, 2 000 cellules ont été obtenues à partir de chacun des échantillons, soit un total de 550 000 cellules qui ont été fermées simultanément).</li>
		<li>Prélever et colorer les cellules à 20-30 °C pendant 15 min dans un tampon bloquant (3 % de BSA et 0,05 % de Tween-20 dans le PBS) à l’aide d’anticorps prémarqués (SCF [1 :50], CD70 [1 :50], CD90 [1 :50] et CD105 [1 :50]) conformément aux instructions de la trousse.</li>
		<li>Effectuez une analyse de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) à l’aide d’un cytomètre en flux. Dans cette étude, les logiciels FACS Diva et FlowJo ont été utilisés. Pour chaque échantillon, enregistrez 10 000 événements et analysez les cellules vivantes.</li>
	</ol></li>
</ol>

Un protocole pour isoler, cultiver et identifier les cellules de niche limbaire humaines

<ol><li>Le, Q., Xu, J., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+of+limbal+stem+cell+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">The diagnosis of limbal stem cell deficiency.</a> Ocular Surface. 16 (1), 58-69 (2018).</li>
<li>Polisetty, N., Fatima, A., Madhira, S. L., Sangwan, V. S., Vemuganti, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cells+from+limbal+stroma+of+human+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye.</a> Molecular Vision. 14, 431-442 (2008).</li>
<li>Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+human+limbal+stromal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of human limbal stromal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 279-286 (2012).</li>
<li>Li, G. G., Zhu, Y. T., Xie, H. T., Chen, S. Y., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+limbal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5686-5697 (2012).</li>
<li>Li, G. G., Chen, S. Y., Xie, H. T., Zhu, Y. T., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+potential+of+human+limbal+stromal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis potential of human limbal stromal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3357-3367 (2012).</li>
<li>Hu, W., Zhang, Y., Tighe, S., Zhu, Y. T., Li, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+isolation+method+of+human+lacrimal+canaliculus+epithelial+stem+cells+by+maintaining+close+association+with+their+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A new isolation method of human lacrimal canaliculus epithelial stem cells by maintaining close association with their niche cells.</a> International Journal of Medical Sciences. 15 (12), 1260-1267 (2018).</li>
<li>Kumar, A., Xu, Y., Yang, E., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stemness+and+regenerative+potential+of+corneal+stromal+stem+cells+and+their+secretome+after+long-term+storage%3A+Implications+for+ocular+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Stemness and regenerative potential of corneal stromal stem cells and their secretome after long-term storage: Implications for ocular regeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3728-3738 (2018).</li>
<li>Xiao, Y. T., Qu, J. Y., Xie, H. T., Zhang, M. C., Zhao, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+methods+for+isolation+of+limbal+niche+cells%3A+Maintenance+of+limbal+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A comparison of methods for isolation of limbal niche cells: Maintenance of limbal epithelial stem/progenitor cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (14), 16(2020).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+niche+cells+and+three-dimensional+matrigel-induced+dedifferentiation+of+mature+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Limbal niche cells and three-dimensional matrigel-induced dedifferentiation of mature corneal epithelial cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (5), 1(2022).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+limbal+biopsy-derived+stromal+stem+cells+prevent+corneal+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human limbal biopsy-derived stromal stem cells prevent corneal scarring.</a> Science Translational Medicine. 6 (266), 266ra172(2014).</li>
<li>Acar, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+allogeneic+limbal+mesenchymal+stem+cell+therapy+in+corneal+healing%3A+role+of+administration+route%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of allogeneic limbal mesenchymal stem cell therapy in corneal healing: role of administration route.</a> Ophthalmic Research. 53 (2), 82-89 (2015).</li>
<li>Katikireddy, K. R., Dana, R., Jurkunas, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+potential+of+limbal+fibroblasts+and+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+to+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation potential of limbal fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells to corneal epithelial cells.</a> Stem Cells. 32 (3), 717-729 (2014).</li>
<li>Polisetti, N., Sharaf, L., Reinhard, T., Schlunck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+ex+vivo+expansion+of+limbal+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and ex vivo expansion of limbal mesenchymal stromal cells.</a> Bio-Protocols. 12 (14), e4471(2022).</li>
<li>Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells+attract+stromal+niche+cells+by+SDF-1%2FCXCR4+signaling+to+prevent+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Limbal epithelial stem/progenitor cells attract stromal niche cells by SDF-1/CXCR4 signaling to prevent differentiation.</a> Stem Cells. 29 (11), 1874-1885 (2011).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+limbal+niche+cells+are+a+powerful+regenerative+source+for+the+prevention+of+limbal+stem+cell+deficiency+in+a+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human limbal niche cells are a powerful regenerative source for the prevention of limbal stem cell deficiency in a rabbit model.</a> Scientific Reports. 8, 6566(2018).</li>
<li>Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+therapy+for+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+In+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regenerative therapy for the cornea.</a> Progress In Retinal and Eye Research. 87, 101011(2022).</li>
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<li>Guo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+niche+cells+are+a+potent+resource+of+adult+mesenchymal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Limbal niche cells are a potent resource of adult mesenchymal progenitors.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3315-3322 (2018).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+expression+between+limbal+niche+progenitors+and+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Differential gene expression between limbal niche progenitors and bone marrow derived mesenchymal stem cells.</a> International Journal of Medical Sciences. 17 (4), 549-557 (2020).</li>
<li>González, S., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+native+limbal+stromal+cells+increases+the+expansion+efficiency+of+limbal+stem%2Fprogenitor+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Presence of native limbal stromal cells increases the expansion efficiency of limbal stem/progenitor cells in culture.</a> Experimental Eye Research. 116, 169-176 (2013).</li>
<li>Funderburgh, M. L., Du, Y., Mann, M. M., SundarRaj, N., Funderburgh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX6+expression+identifies+progenitor+cells+for+corneal+keratocytes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">PAX6 expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes.</a> FASEB Journal. 19 (10), 1371-1373 (2005).</li>
<li>Funderburgh, J. L., Funderburgh, M. L., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+limbal+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the limbal stroma.</a> Ocular Surface. 14 (2), 113-120 (2016).</li>
<li>Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+isolation+method+of+human+limbal+progenitor+cells+by+maintaining+close+association+with+their+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (5), 537-548 (2011).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+Growing+organoids+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: Growing organoids from stem cells.</a> Cell. 161 (7), 1700-1701 (2015).</li>
</ol>

Aucun des auteurs n’a fourni d’informations financières pertinentes.

La transparence cornéenne est généralement maintenue par la disposition et la distribution régulières de petites fibres (25 à 30 nm de diamètre) dans le stroma cornéen, ce qui est crucial pour l’acuité visuelle normale16. Il y a 253 millions de personnes malvoyantes dans le monde, dont 36 millions sont aveugles17. L’Organisation mondiale de la santé (OMS) considère la cécité cornéenne comme l’un des risques les plus graves pour la vue humaine, représentant 5,1 % de toutes l...

L’incidence du déficit en cellules souches épithéliales cornéennes (CESD), également appelé déficit en cellules souches limbiques (LSCD)1, et de la régénération épithéliale cornéenne (CES) devient de plus en plus urgente en raison des infections et des lésions cornéennes. Si elle n’est pas correctement traitée, la CESD peut entraîner une cécité qui nécessite une greffe de cornée. En conséquence, la régénération du CES devient plus importante. Il existe un groupe de cellules de soutien appelées cellules de niche limbique (LNC) qui fournissent un soutien essentiel à la fonction CES. Les cellules souches stromales limbiques ont d’abord été isolées par Polisetty et al.2 et identifiées par Xie et al.3 comme des LNC qui sont localisées dans l’épithélium limbique sous-jacent et le stroma du limbe. Les LNC sont les principales cellules souches de soutien du bord cornéen et, avec la fonction des CSM dérivées de la moelle osseuse (BMMSC), et pourraient être induites à se développer en cellules épithéliales cornéennes et en cellules stromales cornéennes, etc.3,4,5,6,7. Des études antérieures ont montré que les qualités des cellules souches des LNC sont plus primitives que celles desBMMSCs 8, qui sont déjà largement utilisées en clinique. Les LNC pourraient même devenir la prochaine option viable après la CSM, en particulier pour le traitement du CESD. En tant que cellules de soutien importantes pour le CES, les LNC sont également des cellules souches dérivées de la structure de « niche » du limbe. Les LNC peuvent jouer un rôle clé dans la dédifférenciation des cellules épithéliales cornéennes matures (MCEC) en CES9. Cependant, les études sur les LNC sont encore relativement insuffisantes et il n’y a pas de consensus sur la terminologie, l’isolement, la purification, l’identification et les caractéristiques des LNC. Certains chercheurs ont nommé les cellules souches stromales dérivées de la biopsie limbique10, les cellules souches mésenchymateuses limbiques11, les cellules souches fibroblastiques limbiques 12 et les cellules stromales mésenchymateuses limbiques13. Étant donné que les caractéristiques de croissance des LNC n’ont pas été décrites en détail, et en raison de leurs applications scientifiques et cliniques prometteuses, et qu’elles pourraient être l’un des outils cliniques les plus importants à l’avenir, il est nécessaire de résumer l’isolement, la purification, l’identification et les caractéristiques des LNC.
Selon une étude antérieure14, les LNC sont principalement présents au niveau de l’épithélium limbique sous-jacent et du stroma du limbe. Ce protocole comprend le traitement du tissu limbique à l’aide de la collagénase A, l’obtention d’un cluster composé de LEPC et de LNC, et sa digestion en cellules uniques avec 0,25 % de trypsine-EDTA (TE). Les LNC ont ensuite été sélectivement cultivés dans un milieu de cellules souches embryonnaires modifiées (MESCM) pour être purifiés. Le protocole décrit dans cet article est simple et très efficace pour obtenir des LNC humains en grande quantité.
La procédure détaillée d’isolement, de culture et d’identification du LNC a été enregistrée dans la vidéo pour les scientifiques intéressés par l’étude du LNC, et elle peut être facilement répétée en cas de besoin.

<table><tbody><tr><td>4',6-Diamidino-2-Phénylindole</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>5&mu ; g/mL</td></tr><tr><td>d’amphotéricine B</td><td>Sigma</td><td>V900919</td><td>1,25 &mu ; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-CD73</td><td>Abcam</td><td>ab202122</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>MERCK</td><td>A1933-CD105</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Proteintech</td><td>67075-1-Ig</td><td>1:200</td></tr><tr><td>CD105</td><td>Abcam</td><td>ab114052</td><td>1:50</td></tr><tr><td>CD90 Proteintech</td><td></td><td>66766-1-Ig</td><td>1:100</td></tr><tr><td>CD90</td><td>Abcam</td><td>ab307736</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Incubateur cellulaire</td><td>Shanghai Lishen</td><td>K1119K4644</td><td>HF90(HT)</td></tr><tr><td>Système de centrifugation</td><td>StatSpin&nbsp ;</td><td>StatSpin CytoFuge</td> <td>12-Collagenase</td></tr> <tr><td>A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Zeiss&nbsp ;</td><td>LSM700-Plaque</td><td></td></tr> <tr><td>de culture</td><td>virya</td><td>3500356</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>DME/F-12 1:1 (1x)&nbsp ;</td><td>cytiva</td><td>SH30023.01</td><td>90 %</td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Anticorps secondaire</td><td>ThermoFisher</td><td>A16016</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Anticorps secondaire</td><td>ThermoFisher</td><td>31568</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>FACS Diva sofware</td><td>BD Biosciences</td><td>Tree</td> <td>Star-Flow</td></tr> <tr><td>Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>Becton Dickinson LSRII</td><td>-</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence</td><td>olympus</td><td>cx31&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Sigma</td><td>G1914</td><td>50 &mu ; g/mL</td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>MERCK</td><td>Z359629</td><td>Bright-Line</td></tr><tr><td>Kit de transcription d’ADNc haute capacité</td><td>ThermoFisher</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à contraste de phase inversé</td><td>&nbsp ; UOP</td><td>DSZ2000X</td><td></td></tr><tr><td>ITS (insuline, transferrine, sélénite de sodium)</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td>5 &mu ; g/mL d’insuline, 5 &mu ; g/mL de transferrine, 5 ng/mL de sélénite de sodium</td></tr><tr><td>KnockOut SR Sérum de remplacement pour ESC/iPSC</td><td>gibco</td><td>10828-028</td><td>10 %</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BioCoat</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>356234-Pan-CK</td><td>Abcam</td><td>ab7753</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>NoninBio</td><td>NBS0135</td><td>4,00</td></tr> %<tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>MKBio</td><td>MM-1505</td><td>4 %</td></tr><tr><td>PDGFR&beta ;</td><td>Abclonal</td><td>A1444</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Instrument de PCR quantitative par fluorescence en temps réel</td><td>Applied Biosystems</td><td>Step One</td> <td>Plus-Recombinant</td></tr> <tr><td>Human FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>4 ng/mL</td></tr><tr><td>Facteur inhibiteur de la leucémie humaine recommandée (Lif)</td><td>Peprotech</td><td>300-05</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit d’isolement d’ARN</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>-</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Bioss</td><td>bs-0545R</td><td>1:100</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Abcam</td><td>ab52603</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>ZEISS</td><td>SteREO Discovery. V8</td><td></td></tr><tr><td>Lame ronde chirurgicale stérile</td><td>Careforde</td><td>29500</td><td>taille 10</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4448489</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>MERCK</td><td>X100</td><td>0.20 %</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td>0.40</td></tr><tr><td> %Trypsin-EDTA</td><td>Genview</td><td>GP3108</td><td>0.25 %</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>MERCK</td><td>P9416-Ultra</td><td></td></tr> <tr><td>Clean Bench</td><td>LaiTe</td><td>LT20200705</td><td>SW-CJ-IFDG</td></tr><tr><td>Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>Vim&nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>ab92547</td><td>1:100</td></tr></tbody></table>

isolement et identification des cellules de niche limbique

Isolation and Identification of Limbal Niche Cells

Nous rapportons ici une procédure standard pour l’isolement et l’identification des cellules de niche limbique (LNC). Le tissu limbique obtenu à partir d’une banque d’yeux a été utilisé pour l’isolement des LNC. Le tissu a été divisé en 12 morceaux dans des conditions aseptiques et digéré pendant 18 h à 37 °C dans l’incubateur de culture cellulaire à l’aide de la collagénase A pour obtenir des amas cellulaires avec des LNC et des cellules progénitrices de l’épithélium limbique. Les amas de cellules ont ensuite été digérés pendant 15 minutes à 37 °C en utilisant 0,25 % de trypsine-EDTA pour obtenir des cellules individuelles, puis cultivés dans un milieu de cellules souches embryonnaires modifiées (MESCM) sur une surface plastique recouverte de 5 % de Matrigel. Les cellules ont été transmises à 70 % de confluence, et les LNC ont été identifiés à l’aide de l’immunofluorescence, de la PCR quantitative en temps réel (qPCR) et de la cytométrie en flux. Les LNC primaires ont été isolés et sont passés plus de 12 fois. L’activité de prolifération des LNC de P4 à P6 a été la plus élevée. Les LNC ont exprimé des marqueurs de cellules souches plus élevés que les BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR et PDGFRβ). De plus, les résultats ont montré que les LNC P4 exprimaient uniformément VIM, CD90, CD105 et PDGFRβ, mais pas Pan-CK, qui pourrait être utilisé comme marqueur pour l’identification des LNC. L’analyse par cytométrie en flux a montré qu’environ 95 %, 97 %, 92 % et 11 % des LNC exprimaient respectivement CD73, CD90, CD105 et SCF, alors qu’ils étaient respectivement de 68 %, 99 %, 20 % et 3 % dans les BMMSC. Le procédé normalisé d’isolement et d’identification des LNC pourrait fournir une base de laboratoire fiable pour l’utilisation généralisée des LNC.

Croissance de LNC Les LNC ont été isolés avec succès selon la méthode de digestion de la collagénase A (2 mg/mL) du tissu cornéo-scléral, telle que décrite ci-dessus (Figure 1). Conformément à une étude précédemment rapportée3, après la digestion de la collagénase A, des amas ressemblant à des chenilles ont été visualisés au microscope (Figure 2). La proportion de cellules fusiformes augmentait progressivement avec le ...

Nous présentons ici un protocole permettant d’isoler et d’identifier les cellules de niche limbique humaines.

Isolement et identification des cellules de niche limbique

Here we report a standard procedure for the isolation and identification of limbal niche cells (LNCs). Limbus tissue obtained from an eye bank was used ...

Nos études portent sur la reconstruction de la niche limbique pour traiter le déficit en cellules souches limbiques et restaurer la vision du patient. Nous essayons de répondre à la question de savoir si les cellules de niche limbique sont les cellules clés soutenant la fonction des cellules souches limbiques et, si oui, comment cela fonctionne. Des études récentes ont rapporté que la transplantation sous-conjonctivale de cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse empêchait la déficience en cellules souches limbiques des yeux brûlés par l’alcali.L’une des technologies actuellement utilisées pour faire avancer nos recherches est le séquençage de cellules uniques, qui permet d’analyser les activités clés des voies de signalisation au niveau d’une seule cellule pour la caractérisation des cellules de niche limbique. Bien que les LNC aient le potentiel de devenir un outil clinique important à l’avenir, leurs caractéristiques de croissance n’ont pas été explorées en détail. Compte tenu de leurs applications scientifiques et cliniques prometteuses, il est nécessaire de résumer l’isolement, la purification, l’identification et les caractéristiques du LNC.

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Nous rapportons une technique pour la fabrication de micropoches dans les membranes électrofilées dans lequel étudient le comportement des cellules. Plus précisément, nous décrivons une combinaison de microstéréolithographie électrofilage et pour la production de PLGA (poly (lactide-co-glycolide)), des dispositifs de biomatériaux équipés de micro-caractéristiques de la cornée.

Combinaison de Microstéréolithographie et Électrofilage à produire des membranes Equipé Niches pour la régénération de la cornée

Dans cet article, nous décrivons les principes de conception et de réalisation d’une expérience de traçage de lignage multicolore à l’aide de souris R26R-Confetti. Nous fournissons un protocole spécifique pour le suivi des cellules épithéliales cornéennes qui peuvent être modifiées pour d’autres tissus d’intérêt.

Une méthode pour Lineage Tracing de cellules de la cornée Utilisation du Multi-couleurs Souris rapporteur fluorescent

Un exemple de thérapie génique adénovirale dans les cornées cultivées d’organes diabétiques humains est présenté vers la normalisation du retard de cicatrisation des plaies et une expression nettement réduite des marqueurs des cellules souches épithéliales dans ces cornées. Il décrit également l’optimisation de ce processus dans les cultures épithéliales limbiques enrichies en cellules souches.

Adénovirus thérapie génique diabétique Kératopathie: Effets sur la cicatrisation des plaies et des cellules souches Marker Expression dans Human cornées Organ-culture et de cellules épithéliales limbiques

L'article suivant fournit, une technique reproductible facile de créer efficacement un modèle de souris durable de la carence en cellules souches limbiques (LSCD). Ce modèle animal est utile pour tester et comparer l'efficacité des traitements pour les maladies de cellules souches limbiques.

Une procédure mécanique simple pour créer Limbal Carence de cellules souches dans la souris

La surface oculaire normale exposée est constituée de cornée et de conjonctive. Les cellules épithéliales, les cellules caliciformes et les cellules immunitaires sont présentes dans la conjonctive. Ici, une technique non invasive de cytologie d'impression est décrite en utilisant un dispositif de cytologie d'impression et une cytométrie de flux pour analyser les cellules immunitaires dans la conjonctive.

Une manière non invasive d&#39;isoler et de phénotype des cellules de la conjonctivite

Ce protocole présente une méthode simple en deux étapes afin de différencier les cellules souches épithéliales cornéennes limbique de cellules souches pluripotentes humaines dans des conditions de culture acellulaire xeno - et chargeur. Les méthodes de culture cellulaire présentés ici permettent une production rentable, à grande échelle des cellules qualité clinique applicables à l’utilisation de la thérapie des cellules cornéenne.

Efficace et évolutive différenciation dirigée de cliniquement compatibles cornéenne limbique épithéliales cellules souches à partir des cellules souches pluripotentes humaines

La glande lacrymale (LG) a deux types de cellules exprimant l’actine du muscle lisse α (αSMA): les cellules myoépithéliales (CEM) et les périoctets. Les CEM sont d’origine ectodermique, trouvées dans de nombreux tissus glandulaires, tandis que les périoctets sont des cellules musculaires lisses vasculaires d’origine endodermique. Ce protocole isole les CEM et les périoctets des LGs murins.

Isolement des cellules myoépithéliales des glandes murines lacrimal et sous-mandibulaires adultes

Présenté ici est un protocole pour l’isolement et l’amplification des bactéries commensales conjonctivales anaérobies aérobies et facultatives de souris utilisant un écouvillon unique d’oeil et une étape basée sur culture d’enrichissement avec l’identification suivante par des méthodes basées microbiologiques et la spectrométrie de masse MALDI-TOF.

Isolement et identification commensaux conjonctivaux chez la souris

Ce protocole décrit une méthode permettant d’induire une lésion alcaline cornéenne et limbique précise et reproductible dans un modèle murin. Le protocole est avantageux car il permet une lésion uniformément répartie sur la cornée et le limbe de la souris, très incurvés.

Induction de lésions alcalines cornéennes et limbiques à l’aide d’une technique de poinçonnage-tréphine dans un modèle murin

Nous avons développé un modèle chez le rat d’inflammation cornéenne sévère par curetage de l’épithélium cornéen combiné à des sutures cornéennes. L’étude a évalué les modèles d’inflammation cornéenne, la prolifération épithéliale et les changements dans les cellules souches limbiques dans des conditions inflammatoires.

Etablissement d’un modèle d’inflammation cornéenne sévère chez le rat basé sur le curetage de l’épithélium cornéen combiné à des sutures cornéennes

Ici, nous présentons un protocole pour obtenir des suspensions unicellulaires de haute qualité à partir de cornées entières de souris par digestion séquentielle avec collagénase A et trypsine. Cette méthode permet de produire des cellules uniques viables avec une grande intégrité ARN, les rendant compatibles avec des applications en aval telles que le séquençage à ARN monocellulaire et le cytomètrey en flux.

Un protocole pour la récolte de la suspension unicellulaire sur les cornées de souris

Découvrez l'isolement et l'identification des cellules de niche limbique humaines pour la médecine régénérative. Cette méthode par séquençage unicellulaire aide les chercheurs à étudier les voies de signalisation et les applications cliniques pour restaurer la vision.

Isolement et identification des cellules de niche limbique

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