Name: Génération de modèles de lésions rétiniennes chez les têtards Xénope (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Découvrez les mécanismes de régénération rétinienne chez les têtards Xenopus laevis. Cette méthode permet d'étudier le rôle des cellules gliales de Müller et de la neuroinflammation pour développer de futures thérapies.

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Cette recherche a été soutenue par des subventions à M.P. de l’Association Retina France, de la Fondation de France, de la FMR (Fondation Maladies Rares), de la BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) et de l’UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) en partenariat avec l’ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).

Génération de la dégénérescence rétinienne pour étudier les stratégies de réparation cellulaire chez le xénope

<ol><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).</li>
<li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina%3A+An+overview+across+vertebrate+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).</li>
<li>García-García, D., Locker, M., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+M%C3%BCller+glia+regenerative+potential+for+retinal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).</li>
<li>Todd, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+stimulation+of+retinal+regeneration+from+M%C3%BCller+glia+in+adult+mice+using+combinations+of+proneural+bHLH+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors.</a> Cell Reports. 37 (3), 109857(2021).</li>
<li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. 370 (6519), (2020).</li>
<li>Langhe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell+reactivation+in+Xenopus+models+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration.</a> Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).</li>
<li>Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+chemogenetic+ablation+of+photoreceptor+cells+in+Xenopus+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina.</a> Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).</li>
<li>Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod-specific+ablation+using+the+nitroreductase%2Fmetronidazole+system+to+investigate+regeneration+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).</li>
<li>Zahn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+Table+of+Xenopus+development%3A+a+new+graphical+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource.</a> Development. 149 (14), (2022).</li>
<li>McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Husbandry%2C+general+care%2C+and+transportation+of+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis.</a> Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).</li>
<li>Parain, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+models+of+retinitis+pigmentosa+reveal+differential+proliferative+response+of+M%C3%BCller+cells+between+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis.</a> Cells. 11 (5), 807(2022).</li>
<li>Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+care+of+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).</li>
<li>Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+from+three+cellular+sources+and+ectopic+mini-retina+formation+upon+neurotoxic+retinal+degeneration+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+regeneration+in+the+Xenopus+laevis+tadpole%3A+a+new+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system.</a> Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).</li>
<li>Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+tadpoles+can+regenerate+neural+retina+lost+after+physical+excision+but+cannot+regenerate+photoreceptors+lost+through+targeted+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).</li>
<li>Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+homeobox+%28Rx%29+gene+is+necessary+for+retinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration.</a> Developmental Biology. 353 (1), 10-18 (2011).</li>
<li>Choi, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+degeneration+following+rod+ablation+in+a+reversible+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Avantages et inconvénients de divers paradigmes de lésions rétiniennes chez les têtards de Xénope
Lésion mécanique de la rétine Diverses lésions chirurgicales de la rétine neurale ont été développées chez les têtards de Xénope. La rétine neurale peut être soit entièrement enlevée 15,16, soit partiellement excisée 16,17. La ...

Des millions de personnes dans le monde sont atteintes de diverses maladies dégénératives de la rétine conduisant à la cécité, telles que la rétinite pigmentaire, la rétinopathie diabétique ou la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). À ce jour, ces affections restent en grande partie incurables. Les approches thérapeutiques actuellement à l’étude comprennent la thérapie génique, les transplantations de cellules ou de tissus, les traitements neuroprotecteurs, l’optogénétique et les prothèses. Une autre stratégie émergente est basée sur l’auto-régénération par l’activation de cellules endogènes ayant un potentiel de cellules souches. Les cellules gliales de Müller, le principal type de cellules gliales de la rétine, font partie des sources cellulaires d’intérêt dans ce contexte. En cas de blessure, ils peuvent se dédifférencier, proliférer et générer des neurones 1,2,3. Bien que ce processus soit très efficace chez le poisson-zèbre ou le Xénope, il est largement inefficace chez les mammifères.
Néanmoins, il a été démontré que des traitements appropriés avec des protéines mitogènes ou une surexpression de divers facteurs peuvent induire la réentrée dans le cycle des cellules gliales de Müller chez les mammifères et, dans certains cas, déclencher leur engagement neurogénique ultérieur 1,2,3,4,5. Cela reste cependant largement insuffisant pour les traitements. Par conséquent, il est nécessaire d’accroître nos connaissances sur les mécanismes moléculaires sous-jacents à la régénération afin d’identifier des molécules capables de transformer efficacement les propriétés des cellules souches de Müller en nouvelles stratégies thérapeutiques cellulaires.
Dans ce but, nous avons développé plusieurs paradigmes de lésions dans Xenopus qui déclenchent la dégénérescence des cellules rétiniennes. Ici, nous présentons (1) une lésion mécanique de la rétine qui n’est pas spécifique à un type de cellule, (2) un modèle d’ablation cellulaire conditionnelle et réversible utilisant le système NTR-MTZ qui cible les cellules en bâtonnets, (3) un knock-out de la rhodopsine médié par CRISPR/Cas9, un modèle de rétinite pigmentaire qui déclenche une dégénérescence progressive des cellules en bâtonnet, et (4) un CoCl2-modèle cytotoxique induit qui, selon la dose, peut cibler spécifiquement les cônes ou conduire à une dégénérescence plus large des cellules rétiniennes. Nous mettons en évidence les particularités, les avantages et les inconvénients de chaque paradigme.

<table><tbody><tr><td>1,2-Propanediol (propyle&egrave ; Ne glycol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398039</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol absolu &ge ; 99,8 %</td><td>Produits chimiques VWR</td><td>20821-365</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-caspase 3 clivé (lapin)</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>9661S</td><td>Dilution 1/300</td></tr><tr><td>Anticorps anti-GFP (poulet)</td><td>Aveslabs</td><td>GFP-1020</td><td>Dilution 1/500</td></tr><tr><td>Anticorps anti-M-Opsine (lapin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5405</td><td>Dilution 1/500</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-souris, Alexa Fluor 594 (chèvre)</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>A11005</td><td>Dilution 1/1 000</td></tr><tr><td>Anticorps anti-Otx2 (lapin)</td><td>Abcam</td><td>Ab183951</td><td>Dilution 1/100</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-lapin, Alexa Fluor 488 (chèvre)</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>A11008</td><td>Dilution 1/1 000</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-lapin, Alexa Fluor 594 (chèvre)</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>A11012</td><td>Dilution 1/1 000</td></tr><tr><td>Anticorps anti-Recoverin (lapin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5585</td><td>Dilution 1/500</td></tr><tr><td>Anticorps anti-Rhodopsine (souris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MABN15</td><td>Dilution 1/1 000</td></tr><tr><td>Anticorps anti-S-Opsin (lapin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5407</td><td>Dilution 1/500</td></tr><tr><td>Kit de détection de l’apoptote (système TUNEL fluorimétrique sans issue)</td><td>Promega</td><td>G3250</td><td></td></tr><tr><td>Benzocaïne&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1501</td><td>Solution mère 10 %</td></tr> <tr><td>bisBenzimide H 33258 (Hoechst)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2883</td><td>Solution mère 10 mg/mL</td></tr><tr><td>Butanol-1 &ge ; 99,5 %</td><td>Produits chimiques VWR</td><td>20810.298</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté (CaCl2, 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich (Supelco)</td><td>1.02382</td><td>Utilisation à 0,1 M</td></tr><tr><td>Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0646T</td><td></td></tr><tr><td>Clark Capillary Glass modèle GC100TF-10</td><td>Warner Instruments (Harvard Apparatus)</td><td>30-0038</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de cobalt(II) hexahydraté (CoCl2, 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8661</td><td>Solution mère 100 mM</td></tr><tr><td>Lamelle 24 x 60 mm</td><td>VWR</td><td>631-1575</td><td></td></tr><tr><td>Dako REAL ab diluant&nbsp ;</td><td>Agilent</td><td>S202230-2</td><td></td></tr><tr><td>Diméthyl sulfoxyde (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Microtome rotatif électronique</td><td>Thermo Scientific</td><td>Microm HM 340E&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Éosine 1 % aqueuse</td><td>RAL Diagnostics</td><td>312740</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescéine lysine dextran&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>D1822</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope fluorescent</td><td>Olympus</td><td>SZX 200</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycine</td><td>Euromedex</td><td>EU0410-B</td><td></td></tr><tr><td>Glycérine albumine selon Mallory</td><td>Diapath</td><td>E0012</td><td>Utilisation à 3 % dans</td></tr><tr><td>l’eau Hématoxyline (Mayer’s Hemalun)</td><td>RAL Diagnostics</td><td>320550</td><td></td></tr><tr><td>HEPES sel</td> <td>de potassiumSigma-Aldrich</td><td>H0527</td><td></td></tr><tr><td>Hormone gonadotrophine chorionique humaine</td><td>MSD Santé animale</td><td>Chorulon 1500</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique fumant, 37 % (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich (SAFC)</td><td>1.00314</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de L-cystéine monohydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7880</td><td>Utilisation à 2 % dans 0,1x MBS (pH 7,8 - 8,0)</td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO4, 7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich (Supelco)</td><td>1.05886</td><td></td></tr><tr><td>Métronidazole&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich (Supelco)</td><td>M3761</td><td>Utilisation à 10 mM</td></tr><tr><td>Pointes de microchargeur</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipette (P-97 Flaming/Brown)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modèle P-97</td><td>Programme : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500</td></tr><tr><td>Support de montage pour préserver la fluorescence, FluorSave Reagent</td><td>Millipore</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Medium de montage, Eukitt</td><td>Chem-Lab</td><td>CL04.0503.0500</td><td></td></tr><tr><td>MX35 Ultra Microtome</td> blade <td>Epredia</td><td>3053835</td><td></td></tr><tr><td>Needle Agani 25 G x 5/8''</td><td>Terumo</td><td>AN*2516R1</td><td></td></tr><tr><td>Porte-goupille nickelé</td><td>Outils de science fine</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Tissu de filtration en nylon (tissu de tamisage) NITEX, ouverture de maille 1 000 & micro ; m</td><td>Sefar</td><td>06-1000/44</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine histowax sans DMSO</td><td>Histolab</td><td>00403</td><td></td></tr><tr><td>Solution de paraformaldéhyde (32 %)</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>EM-15714-S</td><td>Utilisation à 4 % dans 1x PBS pH 7.4</td></tr><tr><td>Peel-A-Way Moules d’enrobage jetables</td><td>Epredia</td><td>2219</td><td></td></tr><tr><td>Pilon</td><td>VWR</td><td>431-0094</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 100 mm</td><td>Corning Gosselin</td><td>SB93-101</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 55 mm</td><td>Corning Gosselin</td><td>BP53-06</td><td></td></tr><tr><td>Tampon phosphate solution saline (PBS) 10x</td><td>Euromedex</td><td>ET330-A</td><td></td></tr><tr><td>PicoSpritzer Système de micro-injection</td><td>Parker Instrumentation Products</td><td>PicoSpritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Pins&nbsp ;</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Polysaccharose (Ficoll PM 400 )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4375</td><td>Utilisation à 3 % dans 0,1x MBS</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Poudre d’alevinage : sera Micron Nature</td><td>sera</td><td>45475 (00720)</td><td></td></tr><tr><td>Dissection des ciseaux</td><td>Outils de science fine</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Slide Superfrost&nbsp ;</td><td>&nbsp ; KNITTEL Glass</td><td>VS11171076FKA&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Chauffe-lames</td><td>Kunz instruments</td><td>HP-3</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Citrate de sodium sel trisodique dihydraté (C6H5Na3O7, 2H2O)</td><td>VWR</td><td>chemicals 27833.294</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich (Supelco)</td><td>1.06329</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium 30 % solution aqueuse (NaOH)</td><td>Produits chimiques VWR</td><td>28217-292</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Seringues Omnifix-F Solo 1 mL</td><td>B-BRAUN</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>ARNcr trans-activateur (tracrRNA)</td><td>Technologies</td> <td>d’ADN intégrées</td><td></td>1072533</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 200DC Illuminateur à fluorescence</td><td>X-Cite&nbsp ;</td><td>200DC</td><td></td></tr><tr><td>Xylène &ge ; 98,5 %&nbsp ;</td><td>Produits chimiques VWR</td><td>28975-325</td><td></td></tr></tbody></table>

génération de modèles de lésions rétiniennes chez les têtards xénope

Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles

Les maladies neurodégénératives de la rétine sont les principales causes de cécité. Parmi les nombreuses stratégies thérapeutiques explorées, la stimulation de l’autoréparation s’est récemment révélée particulièrement attrayante. Une source cellulaire d’intérêt pour la réparation de la rétine est la cellule gliale de Müller, qui abrite un potentiel de cellules souches et une capacité de régénération extraordinaire chez les anamniotes. Ce potentiel est cependant très limité chez les mammifères. L’étude des mécanismes moléculaires sous-jacents à la régénération rétinienne dans des modèles animaux dotés de capacités de régénération devrait permettre de mieux comprendre comment libérer la capacité latente des cellules de Müller chez les mammifères à régénérer la rétine. Il s’agit d’une étape clé pour le développement de stratégies thérapeutiques en médecine régénérative. Dans ce but, nous avons développé plusieurs paradigmes de lésions rétiniennes dans Xenopus : une lésion mécanique de la rétine, une lignée transgénique permettant l’ablation conditionnelle des photorécepteurs médiée par la nitroréductase, un modèle de rétinite pigmentaire basé sur le knock-out de la rhodopsine médié par CRISPR/Cas9, et un modèle cytotoxique piloté par des injections intraoculaires de CoCl2 . En mettant en évidence leurs avantages et leurs inconvénients, nous décrivons ici cette série de protocoles qui génèrent diverses conditions dégénératives et permettent l’étude de la régénération rétinienne chez Xenopus.

Lésion mécanique de la rétine Des coupes rétiniennes de têtards soumis à la lésion mécanique décrite dans la section 1 du protocole montrent que la lésion rétinienne englobe toutes les couches du tissu tout en restant limitée au site de ponction (Figure 2A,B).
Ablation conditionnelle des cellules en bâtonnets à l’aide du système NTR-MTZ Les yeux de têtards transgéniques Tg(rho :GFP-NTR) anesthésiés ...

Nous avons développé plusieurs protocoles pour induire des lésions rétiniennes ou une dégénérescence rétinienne chez les têtards de Xenopus laevis . Ces modèles offrent la possibilité d’étudier les mécanismes de régénération rétinienne.

Génération de modèles de lésions rétiniennes chez les têtards Xénope

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair ...

Mon laboratoire travaille sur la régénération rétinienne. Nous utilisons la grenouille Xénope comme système modèle. Cet amphibien est en effet assez fascinant car contrairement aux mammifères, comme nous, il peut régénérer sa rétine très efficacement en cas de blessure.Et nous étudions le mécanisme sous-jacent car, à l’avenir, il pourrait être utile de déclencher la régénération rétinienne chez les patients humains atteints de maladies neurodégénératives rétiniennes. Nous avons récemment découvert qu’en plus des cellules souches à la périphérie de la rétine et de l’épithélium pigmenté de la rétine, les cellules neurogliales peuvent également être recrutées pour la régénération rétinienne en cas de lésion. Nous étudions donc maintenant les liens entre la neuroinflammation et la capacité de régénération de ces cellules.En effet, il semblerait que la niche neuro-inflammatoire soit un acteur clé dans la modulation de la régénération de la rétine. Pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la régénération rétinienne, nous avons développé plusieurs paradigmes de lésions rétiniennes chez Xenopus. La première est une lésion mécanique de la rétine.La seconde est une lignée transgénique permettant l’ablation conditionnelle des photorécepteurs médiée par la nitroréductase. Le troisième est un modèle de rétinite pigmentaire basé sur le knock-out de la rhodopsine médié par CRISPR/Cas9 et, pour finir, un modèle cytotoxique piloté par injection intraoculaire de chlorure de cobalt ou de CoCl2. Mon laboratoire d’accueil a montré que si le Xénope peut régénérer sa rétine, l’efficacité est très variable et dépend des stades du têtard ou de l’espèce, Xenopus laevis ou tropicalis.Cela fait de Xenopus un modèle fantastique pour illustrer les mécanismes moléculaires qui déclenchent ou limitent la régénération rétinienne.

generating-retinal-injury-models-in-xenopus-tadpoles

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Une méthode pour l'expression conditionnelle knockdown une protéine cible dans la rétine de poisson zèbre adulte est décrite, qui consiste à injecter par voie intravitréenne morpholinos antisens et les électroporation dans la rétine. La protéine résultante est assommée pendant plusieurs jours, ce qui permet de tester le rôle de la protéine dans la régénération ou de la rétine intacte.

En électroporation in vivo de morpholinos dans la rétine de poisson zèbre adulte

Xenopus laevis fournit un système modèle idéal pour étudier la spécification du destin cellulaire et la fonction physiologique des différentes cellules rétiniennes en culture cellulaire primaire. Ici, nous présentons une technique de dissection des tissus rétiniens et générer des cultures de cellules primaires qui sont imagées pour l'activité de calcium et analysés par hybridation in situ.

Dissection, de la culture, et de l&#39;analyse des<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tissus embryonnaires rétine

La vidéo montre une méthode de culture de cellules ganglionnaires rétiniennes primaires à partir d’embryons de poisson-zèbre. Les embryons à un stade précoce subissent une dissection pour isoler les yeux, qui sont ensuite dissociés mécaniquement en une suspension de cellules ganglionnaires rétiniennes. Cette suspension cellulaire est cultivée sur des lamelles recouvertes de protéines adhésives pour faciliter le développement des axones.

Génération de cultures de cellules ganglionnaires rétiniennes primaires à partir d’embryons de poisson-zèbre

Cette vidéo montre une procédure pour induire la dégénérescence rétinienne chez le poisson-zèbre adulte à l’aide d’une lésion laser. Le laser cible les cellules photoréceptrices de la rétine, déclenchant la mort cellulaire et un processus dégénératif. Ces dommages activent les cellules gliales de Müller (MG), entraînant leur dédifférenciation en progéniteurs de cellules souches qui aident à la régénération rétinienne.

Modélisation de la dégénérescence et de la régénération rétiniennes chez le poisson-zèbre à l’aide d’une lésion focale au laser

Protocoles de légers dégâts multiples ont été décrits pour les photorécepteurs des dommages et par conséquent induire une réponse de régénération rétinienne chez le poisson zèbre adulte. Ce protocole décrit une méthode améliorée qui peut être utilisé chez les animaux pigmentés et qui endommage la grande majorité de la tige et des cônes photorécepteurs dans la rétine entière.

A Novel lumière paradigme de dommages pour utilisation dans les études de régénération rétinienne chez le poisson zèbre adulte

Têtards de Xenopus laevis préfèrent nager sur le côté blanc d'un réservoir noir / blanc. Ce comportement est guidé par la vision. Sur la base de ce comportement, nous présentons un test simple pour tester la fonction visuelle des têtards.

Un test comportemental simple pour tester la fonction visuelle dans<em&gt; Xenopus laevis</em

Ce protocole décrit un procédé pour disséquer, expérimentalement et manipuler des explants de rétine entière de la culture d'embryons de poulet. Les cultures d'explants sont utiles lorsque le taux de réussite élevé, l'efficacité et la reproductibilité sont nécessaires pour tester les effets de plasmides pour l'électroporation et / ou des substances réactives, à savoir, les inhibiteurs enzymatiques.

Explants rétiniens entières de poulet embryons pour Traitements électroporation et réactif chimique

la régénération rétinienne Zebrafish a surtout été étudiée en utilisant des rétines fixes. Cependant, les processus dynamiques tels que la migration nucléaire interkinetic se produisent au cours de la réponse régénérative et nécessitent imagerie des cellules vivantes pour étudier les mécanismes sous-jacents. Ici, nous décrivons la culture et d'imagerie conditions pour surveiller Interkinetic Migration nucléaire (INM) en temps réel en utilisant la microscopie multiphoton.

Culture des adultes Zebrafish Retinal explants Transgenic pour des cellules vivantes par imagerie multiphotonique Microscopie

Cellules épithéliales pigmentaire rétinien pouvaient constituer une thérapie cellulaire-remplacement de la forme avancée de la dégénérescence maculaire sèche liée à l’âge. Ce protocole décrit la génération d’un modèle grand aux yeux de l’atrophie géographique et la sous-rétinienne transplantation de cellules épithéliales pigmentaire rétinien dérivé de cellules souches embryonnaires humaines dans ce modèle de la maladie.

Sous-rétinienne Transplantation de cellules souches embryonnaires humaines pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules épithéliales dans un modèle grand aux yeux de l’atrophie géographique

Ce protocole vise à démontrer comment microinjecter un mélange ADN/DOTAP dans les œilcs d'embryons de Xenopus laevis d'un jour, et comment imager et reconstruire la protéine fluorescente verte individuelle (GFP) exprimant des arborescences axonales optiques dans les midbrains tectal de intacts, les têtards Xenopus vivants.

Microinjection d'ADN dans eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Ce protocole décrit la méthodologie pour ablation génétique de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à l’aide d’un modèle transgénique de poisson-zèbre. L’adaptation du protocole pour incorporer la modulation de la voie de signalisation à l’aide de composés pharmacologiques est très détaillée. Une plate-forme MATLAB pour quantifier la régénération RPE basée sur la pigmentation a été développée et est présentée et discutée.

Ablation médiée par la nitroréductase/métronidazole et une plate-forme MATLAB (RpEGEN) pour l’étude de la régénération de l’épithélium pigmentaire rétinien du poisson-zèbre

Découvrez les mécanismes de régénération rétinienne chez les têtards Xenopus laevis. Cette méthode permet d'étudier le rôle des cellules gliales de Müller et de la neuroinflammation pour développer de futures thérapies.

Génération de modèles de lésions rétiniennes chez les têtards Xénope

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