Name: Cryoconservation de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules souches embryonnaires humaines au stade optimal (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-03T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Apprenez la cryoconservation optimale des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules souches embryonnaires humaines. Ce protocole améliore les taux de survie pour les thérapies de remplacement rétinien.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été financé par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81970816) à Mei Jiang ; la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82201223) à Xinyue Zhu ; et le Plan d’action pour l’innovation scientifique et technologique de la Commission de Shanghai pour la science et la technologie (2014090067000) à Haiyun Liu.

1. Dissociation cellulaire
<ol><li>Maintenir les cellules EPR comme décrit précédemment 17,22. REMARQUE : Toutes les cellules sont cultivées à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO2 pendant toute la durée des protocoles.</li>
	<li>Préparez la quantité requise de PBS et de milieu de culture dans un bain-marie à 37°C et placez le réactif de dissociation cellulaire à température ambiante.</li>
	<li>Jeter la solution de culture et laver les plaques deux fois avec 1 mL de PBS préchauffé par puits.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de réactif de dissociation cellulaire dans les plaques à 6 puits et digérer les cellules à 37 °C pendant 15 min. Après l’incubation, observez au microscope les cellules qui rétrécissent et brillent sur les bords pour confirmer la fin de la digestion. REMARQUE : La dissociation à base de trypsine n’est pas recommandée car elle donne une faible viabilité cellulaire.</li>
	<li>Pipeter doucement de haut en bas 10x avec une pipette de 1 mL pour dissocier les cellules, et diluer la suspension cellulaire avec un milieu de culture préchauffé (sans Y-27632) dans un rapport de 1:10. Ensuite, centrifugez les cellules à température ambiante pendant 3 min à 250 × g.</li>
	<li>Versez rapidement le surnageant après la centrifugation, remettez doucement en suspension la pastille cellulaire dans 2 mL de milieu de culture et remettez les cellules en suspension 10 à 15 fois à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Filtrez la suspension cellulaire à l’aide d’une crépine de 40 μm pour obtenir une suspension unicellulaire et calculez le nombre de cellules. REMARQUE : Une suspension à cellule unique est essentielle pour un comptage précis des cellules et une densité d’ensemencement uniforme après décongélation.</li>
</ol>2. Détermination de l’étape cellulaire optimale pour la cryoconservation
REMARQUE : Étant donné que l’état cellulaire varie entre les méthodes de différenciation et les lignées cellulaires, la phase exponentielle des cellules EPR cultivées dans différents laboratoires doit être déterminée avant la congélation.
<ol><li>Décongeler un flacon de solution matricielle de membrane basale sur de la glace à 4 °C pendant la nuit. Diluer la matrice dans 12 mL de DMEM/F-12 froid et bien mélanger. Ajouter une lamelle par puits et enduire chaque puits d’une plaque de 24 puits avec 0,25 mL de solution diluée. Incuber la plaque pendant 1 h à température ambiante ou une nuit à 4 °C avant utilisation et aspirer la solution d’enrobage juste avant de plaquer les cellules. REMARQUE : Les instructions pour le volume aliquote sont spécifiques au lot en fonction de la concentration en protéines et se trouvent dans la fiche technique du produit.</li>
	<li>Ensemencer les cellules individuelles EPR de l’étape 1.7 sur les lamelles recouvertes d’une matrice de membrane basale à une densité de 105/cm2 dans 1 mL de milieu de culture. Rafraîchissez le milieu de culture tous les 2-3 jours.</li>
	<li>Aux points temporels indiqués (1, 3, 5, 7 et 11 jours après le passage), incuber des cellules EPR avec 10 μM d’EdU dans le milieu pendant 24 h. Fixez, perméabilisez et colorez les cellules avec le cocktail réactionnel comme décrit dans le manuel pour détecter l’EdU incorporé.</li>
	<li>Capturez des images de cinq champs aléatoires à l’aide d’un microscope à fluorescence et calculez le pourcentage de cellules EdU positives. Tracez les courbes proportionnelles-temps positives EdU correspondantes pour générer une courbe de croissance. Ensuite, déterminez la fenêtre de congélation ou la phase exponentielle pour chaque lignée cellulaire en fonction de la courbe de croissance. REMARQUE : La morphologie cellulaire hexagonale rétablie indique que les cellules sortent de la phase exponentielle.</li>
</ol>3. Cryoconservation
<ol><li>En suivant les étapes 1.1 à 1.7, sauf que le temps de digestion diminue à 5 min, centrifuger la suspension cellulaire à température ambiante pendant 3 min à 250 × g.</li>
	<li>Jeter le surnageant en le versant rapidement après la centrifugation et remettre doucement en suspension la pastille cellulaire dans le milieu de cryoconservation à une densité de 2 × 106 cellules/mL et transférer 1 mL de suspension cellulaire dans des flacons cryogéniques de 1,2 mL.</li>
	<li>Placez immédiatement les flacons cryogéniques dans un récipient de congélation, congelez-les à −80 °C pendant la nuit pour atteindre une vitesse de refroidissement de −1 °C/min, puis transférez les flacons dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme.</li>
</ol>4. Décongélation
<ol><li>Réchauffez le milieu de culture dans un bain-marie à 37 °C et préremplissez 10 ml de milieu de culture préchauffé dans un tube de 15 ml.</li>
	<li>Décongelez rapidement les flacons cryogéniques directement prélevés du stockage d’azote liquide à l’aide d’un système de décongélation automatisé.</li>
	<li>Verser 0,5 à 1 mL de milieu de culture préchauffé dans le flacon cryogénique pour s’assurer que les cellules congelées s’adaptent progressivement au nouvel environnement. Ensuite, transférez 1,5 à 2 ml de suspension cellulaire dans 10 ml de milieu de culture dans un tube de 15 ml et centrifugez les cellules à 250 × g pendant 3 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Jeter le surnageant en le versant rapidement après la centrifugation, remettre la pastille en suspension dans 2 mL de milieu de culture préchauffé et compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre pour déterminer les taux de récupération et de survie à l’aide de l’exclusion standard du bleu de trypan (0,4 % de coloration au bleu de trypan).</li>
	<li>Cultiver les cellules sur des surfaces recouvertes d’une matrice de membrane basale à une densité de 10à 5 cellules viables/cm2 dans un milieu de culture complété par de l’Y-27632 (concentration finale : 10 μM). Retirez Y-27632 après 24 h.</li>
	<li>Pour déterminer le taux d’attachement, dissociez à nouveau les cellules et comptez le nombre de cellules 24 h après la décongélation.</li>
</ol>5. Validation de la phase de congélation optimale
<ol><li>Pour valider la phase de congélation optimale déterminée à l’étape 2.4, décongeler les cellules EPR congelées à différents moments et les cultiver pendant 28 jours. Récoltez les cellules pour l’analyse qPCR et l’immunocoloration afin d’évaluer l’expression des marqueurs RPE, comme décrit précédemment17.</li>
</ol>

Progrès de la cryoconservation de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules souches humaines

<ol><li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846(2020).</li>
<li>Mcbain, V. A., Townend, J., Lois, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+retinal+pigment+epithelial+atrophy+in+stargardt+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthamology%22%5BJournal%5D)">Progression of retinal pigment epithelial atrophy in stargardt disease.</a> American Journal of Ophthamology. 154 (1), 146-154 (2012).</li>
<li>George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium%3A+Development%2C+injury+responses%2C+and+regenerative+potential+in+mammalian+and+non-mammalian+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969(2021).</li>
<li>Rizzolo, L. J., Nasonkin, I. O., Adelman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+cell+transplantation%2C+biomaterials%2C+and+in+vitro+models+for+developing+next-generation+therapies+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Retinal cell transplantation, biomaterials, and in vitro models for developing next-generation therapies of age-related macular degeneration.</a> Stem Cells Translational Medicine. 11 (3), 269-281 (2022).</li>
<li>Bertolotti, E., Neri, A., Camparini, M., Macaluso, C., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+as+source+for+retinal+pigment+epithelium+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Stem cells as source for retinal pigment epithelium transplantation.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 130-144 (2014).</li>
<li>Da Cruz,, L,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+1+clinical+study+of+an+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+patch+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).</li>
<li>Mehat, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells+in+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration.</a> Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).</li>
<li>Buchholz, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (5), 384-393 (2013).</li>
<li>Li, Q. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assessment+of+cryopreserved+clinical+grade+hESC-RPE+cells+as+a+qualified+cell+source+for+stem+cell+therapy+of+retinal+degenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Functional assessment of cryopreserved clinical grade hESC-RPE cells as a qualified cell source for stem cell therapy of retinal degenerative diseases.</a> Experimental Eye Research. 202, 108305(2021).</li>
<li>Francois, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+display+impaired+immunosuppressive+properties+as+a+result+of+heat-shock+response+and+impaired+interferon-gamma+licensing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunosuppressive properties as a result of heat-shock response and impaired interferon-gamma licensing.</a> Cytotherapy. 14 (2), 147-152 (2012).</li>
<li>Moll, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+display+impaired+immunomodulatory+and+therapeutic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties.</a> Stem Cells. 32 (9), 2430-2442 (2014).</li>
<li>Ekpo, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+cryopreservation+evaluations+into+the+design+of+cell-based+drug+delivery+systems%3A+an+opinion+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Incorporating cryopreservation evaluations into the design of cell-based drug delivery systems: an opinion paper.</a> Frontiers in Immunology. 13, 967731(2022).</li>
<li>Bailey, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+osmolytes+in+cryopreserving+adherent+neuroblastoma+%28Neuro-2a%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Protective effects of osmolytes in cryopreserving adherent neuroblastoma (Neuro-2a) cells.</a> Cryobiology. 71 (3), 472-480 (2015).</li>
<li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+of+a+cryopreservation+of+cultured+human+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Feasibility of a cryopreservation of cultured human corneal endothelial cells.</a> PLoS One. 14 (6), e0218431(2019).</li>
<li>Pennington, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-free+cryopreservation+of+adherent+retinal+pigmented+epithelium+yields+viable+and+functional+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Xeno-free cryopreservation of adherent retinal pigmented epithelium yields viable and functional cells in vitro and in vivo.</a> Scientific Reports. 11 (1), 6286(2021).</li>
<li>Woods, E. J., Thirumala, S., Badhe-Buchanan, S. S., Clarke, D., Mathew, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off+the+shelf+cellular+therapeutics%3A+Factors+to+consider+during+cryopreservation+and+storage+of+human+cells+for+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Off the shelf cellular therapeutics: Factors to consider during cryopreservation and storage of human cells for clinical use.</a> Cytotherapy. 18 (6), 697-711 (2016).</li>
<li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+optimal+stage+for+cryopreservation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Determining the optimal stage for cryopreservation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 454(2022).</li>
<li>Leach, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigmented+epithelium%3A+a+comparative+study+between+cell+lines+and+differentiation+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium: a comparative study between cell lines and differentiation Methods.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 317-330 (2016).</li>
<li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+iPS+cells+in+Xeno-free+and+feeder-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in Xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).</li>
<li>Brandl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+characterisation+of+retinal+pigment+epithelium+%28RPE%29+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28hiPSC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromolecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">In-depth characterisation of retinal pigment epithelium (RPE) cells derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC).</a> Neuromolecular Medicine. 16 (3), 551-564 (2014).</li>
<li>Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-+and+feeder-free+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+two+distinct+ocular+epithelial+cell+types+using+simple+modifications+of+one+method%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method.</a> Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 291(2017).</li>
<li>Foltz, L. P., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+directed+differentiation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+human+embryonic+or+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Rapid, directed differentiation of retinal pigment epithelial cells from human embryonic or induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), 10.3791/56274(2017).</li>
<li>Marcantonini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+cryoprotective+and+cytoprotective+agents+in+cryopreservation%3A+a+focus+on+melatonin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Natural cryoprotective and cytoprotective agents in cryopreservation: a focus on melatonin.</a> Molecules. 27 (10), 3254(2022).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Dans la présente étude, un protocole de congélation-décongélation efficace pour les cellules EPR dérivées de CSEh pour la recherche et les besoins cliniques est décrit. Contrairement à la lignée cellulaire APR immortalisée, ARPE-19, les cellules EPR avec un phénotype et une fonction épithéliales caractéristiques appropriés, comme les cellules EPR dérivées de cellules souches, sont plus sensibles à la cryoconservation. Moins de 32 % des cellules sont restées à 24 h après la décongélation si elles n’ont pas été correctemen...

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche pigmentée de cellules nécessaires au maintien du bon fonctionnement de la rétine1. Le dysfonctionnement et la mort de l’EPR sont étroitement associés à de nombreuses maladies dégénératives de la rétine, notamment la dégénérescence maculaire liée à l’âge, la rétinite pigmentaire et la maladie de Stargardt 2,3. La thérapie de remplacement de l’EPR est l’un des schémas thérapeutiques les plus prometteurs pour ces maladies 4,5,6,7. Un approvisionnement stable en cellules EPR de donneur est essentiel pour la thérapie cellulaire. Les cellules EPR dérivées de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont une source cellulaire idéale pour la thérapie cellulaire car elles imitent la fonction des cellules EPR primaires et peuvent produire un approvisionnement théoriquement illimité8. Cependant, le processus de différenciation est laborieux et la durée de conservation des cellules EPR obtenues est relativement courte en raison de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) ultérieure. Par conséquent, la cryoconservation des cellules EPR dérivées de CSEh est une étape indispensable nécessaire au stockage à long terme et à la distribution à la demande9.
Les dommages cellulaires induits par la cryoconservation peuvent compromettre par inadvertance l’efficacité thérapeutique10,11. Par conséquent, des études récentes sur la cryoconservation ont suggéré que les conditions optimales de stockage cryogénique devraient être déterminées lors de la conception de thérapies cellulaires12. Une cryoconservation réussie garantit une récupération efficace des cellules, une viabilité élevée et la restauration de la fonction cellulaire après le cycle de congélation-décongélation. Cependant, des études antérieures sur la cryoconservation des monocouches adhérentes de cellules de mammifères ont rapporté des taux de survie très variables (35%-95%) après décongélation 13,14,15. De nombreux facteurs affectent considérablement les résultats de la cryoconservation, en particulier pendant l’étape de congélation16,17. Des recherches récentes ont montré que les cellules EPR congelées à différents moments présentaient une récupération variée après décongélation17. À notre connaissance, il n’existe pas d’études sur la détermination de la fenêtre de temps de congélation optimale pour les cellules EPR dérivées de cellules souches. Dans différentes études, les cellules ont été congelées à différents stades : certaines cellules ont été congelées peu de temps après le passage ou avant la confluence ou la pigmentation 8,15,18, tandis que d’autres ont été congelées à d’autres moments 9,19,20,21. De plus, il n’existe aucune preuve claire indiquant si la phase ou l’étape des cellules EPR utilisées pour la cryoconservation affecte la fonction de l’EPR après la décongélation. Dans notre étude précédente, nous avons démontré pour la première fois que la phase exponentielle de croissance cellulaire (P2D5) est la meilleure étape pour la cryoconservation des cellules EPR dérivées de hESC en termes de viabilité cellulaire et de récupération des propriétés et fonctions cellulaires17.
La méthode établie ici vise à cryoconserver les EPR dérivés de hESC à un stade optimal pour obtenir la meilleure conservation en termes de viabilité cellulaire et de fonction après décongélation. À l’aide du test de marquage à la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU) pour détecter la phase exponentielle de la synthèse de l’ADN avant la cryoconservation, les cellules EPR décongelées ont présenté une viabilité et un taux d’attachement de >80 %, une expression génique spécifique de l’EPR, une morphologie cellulaire polarisée, une sécrétion de facteurs dérivés de l’épithélium pigmentaire, une résistance transépithéliale appropriée et une capacité phagocytaire 8,17,22. Bien que ce protocole se concentre sur les cellules RPE dérivées de hESC et que toutes les cellules thérapeutiques ne soient pas cryopréservées de la même manière, la stratégie de congélation en phase exponentielle peut être appliquée à de nombreuses autres cellules thérapeutiques.

<table><tbody><tr><td>40 &mu ; m Filtre cellulaire</td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Kit de prolifération cellulaire pour l’imagerie, Alexa Fluor 488 Colorant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10337</td><td></td></tr><tr><td>Conteneur cryogénique</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Biolife Solutions</td><td>07930</td><td>milieu de cryoconservation #1</td></tr><tr><td>DPBS, sans calcium, sans magnésium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>14190144</tr><tr><td>Genxin</td><td>Selcell</td><td>YB050050</td><td>milieu de cryoconservation #2</td></tr><tr><td>Cellules souches embryonnaires humaines</td><td>fournies par Wicell, États-Unis</td><td>Lignée</td><td></td>cellulaire H9</tr><tr><td>Matrigel, matrice qualifiée hESC</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>matrice de membrane basale</td></tr><tr><td>ThawSTAR CFT2 Système automatisé de décongélation de cellules</td><td>BioLife Solutions</td><td>AST-601</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Solution bleue 0,4 %</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>TryPLE Select</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563029</td><td>réactif de dissociation cellulaire</td></tr><tr><td>XVIVO-10 milieu</td><td>Lonza</td><td>BEBP04-743Q</td><td>Milieu de culture RPE</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

cryoconservation de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules souches embryonnaires humaines au stade optimal

Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells at the Optimal Stage

Les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (EPR) dérivées de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont des sources cellulaires supérieures pour la thérapie de remplacement cellulaire chez les personnes atteintes de maladies dégénératives de la rétine. Cependant, les études sur la mise en banque stable et sûre de ces cellules thérapeutiques sont rares. La viabilité cellulaire très variable et la récupération fonctionnelle des cellules EPR après cryoconservation sont les problèmes les plus fréquemment rencontrés. Dans le protocole actuel, nous avons cherché à obtenir le meilleur taux de récupération cellulaire après décongélation en sélectionnant la phase cellulaire optimale pour la congélation en fonction des conditions expérimentales d’origine. Les cellules ont été congelées dans la phase exponentielle déterminée à l’aide du test de marquage de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine, ce qui a amélioré la viabilité cellulaire et le taux de récupération après décongélation. Des cellules stables et fonctionnelles ont été obtenues peu de temps après la décongélation, indépendamment d’un long processus de différenciation. Les méthodes décrites ici permettent la conservation et la décongélation simples, efficaces et peu coûteuses des cellules RPE dérivées d’ESCh. Bien que ce protocole se concentre sur les cellules RPE, cette stratégie de congélation peut être appliquée à de nombreux autres types de cellules différenciées.

Ici, les cellules EPR dérivées de CSEh à P1D35 ont été passées et ensemencées à une densité de 105/cm2. Dans la semaine qui a suivi l’ensemencement, la morphologie hexagonale et la pigmentation caractéristiques ont été perdues pendant la phase de latence (environ 2 jours). Les cellules de l’EPR ont progressivement réadopté la morphologie hexagonale dans la phase exponentielle (environ 5 jours, Figure 1A) et sont entrées dans la phase de décélération (environ 6 jours) av...

Cette étude fournit un protocole détaillé pour la cryoconservation efficace des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules souches humaines.

Cryoconservation de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules souches embryonnaires humaines au stade optimal

Retinal pigment epithelial&#160;(RPE) cells derived from human embryonic stem cells (hESCs) are superior cell sources for cell replacement therapy in ...

Notre laboratoire vise à mieux comprendre le mécanisme moléculaire des maladies de la rétine, en mettant l’accent sur les besoins médicaux non satisfaits des patients. Nous visons à développer des traitements efficaces, tels que des thérapies à base de cellules souches, pour eux. La cryoconservation des cellules EPR dérivées de cellules souches est une étape importante de la thérapie de remplacement de l’EPR.Actuellement, les cellules sont congelées à différents stades, ce qui entraîne des taux de survie très variables pour la décongélation. Ceci est nécessaire pour déterminer le stade cellulaire optimal pour la congélation de ces cellules. Notre protocole fournit un moyen simple, efficace et peu coûteux de congeler les cellules EPR en déterminant la phase exponentielle des cellules EPR pour la congélation.Il est moins dépendant des méthodes différenciées ou des lignées cellulaires.

cryopreservation-human-embryonic-stem-cell-derived-retinal-pigment

Research

Recherche

JoVE Journal

Medicine

Médecine

Les cellules d’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dérivées de cellules souches peuvent être utilisées pour de multiples applications, notamment des thérapies cellulaires pour la dégénérescence rétinienne, la modélisation de maladies et des études de médicaments. Nous présentons ici un protocole simple pour dériver de manière reproductible l’EPR à partir de cellules souches.

Dérivation efficace des cellules d&#39;épithélium pigmentaire de la rétine à partir de cellules souches

Nous présentons ici un protocole accepté par la communauté en format multimédia pour l’injection sous-rétinienne d’un bolus de cellules EPR chez le rat et la souris. Cette approche peut être utilisée pour déterminer les potentiels de sauvetage, les profils d’innocuité et les capacités de survie des cellules EPR greffées lors de l’implantation dans des modèles animaux de dégénérescence rétinienne.

Exécution sous-rétinienne injections chez les rongeurs de produire des cellules de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien Suspension

Ce protocole décrit comment produire les cellules épithéliales pigmentaire rétinien (EPR) de cellules souches pluripotentes. La méthode utilise une combinaison de facteurs de croissance et de petites molécules pour diriger la différenciation des cellules souches en RPE immature en quatorze jours et RPE mature et fonctionnel après trois mois.

Rapide, réalisée la différenciation des cellules épithéliales pigmentaire rétinien de cellules souches pluripotentes humaines embryonnaires ou induit

Cellules épithéliales pigmentaire rétinien pouvaient constituer une thérapie cellulaire-remplacement de la forme avancée de la dégénérescence maculaire sèche liée à l’âge. Ce protocole décrit la génération d’un modèle grand aux yeux de l’atrophie géographique et la sous-rétinienne transplantation de cellules épithéliales pigmentaire rétinien dérivé de cellules souches embryonnaires humaines dans ce modèle de la maladie.

Sous-rétinienne Transplantation de cellules souches embryonnaires humaines pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules épithéliales dans un modèle grand aux yeux de l’atrophie géographique

La production de cellules spécialisées de la rétine de cellules souches pluripotentes est un tournant dans le développement de la thérapie à base de cellules souches pour les maladies de la rétine. Le présent document décrit une méthode simple pour une génération efficace d’organoïdes rétinienne et l’épithélium pigmentaire rétinien pour la recherche fondamentale, translationnelle et clinique.

Xeno-libre défini et exempte d’engraissement des Conditions de Culture pour les modèles de cellule rétinienne Generation of Human dérivés iPSC

Les auteurs décrivent une méthode pour un tissu rétinien composé de cellules épithéliales pigmentaire rétinien dérivés des cellules souches pluripotentes humaines cultivées sur le dessus des membranes amniotiques humaines et de sa préparation pour les greffes dans des modèles animaux de l’ingénieur.

Ingénierie de tissu d’épithélium pigmentaire rétinien Transplantation-convient dérivées de cellules souches embryonnaires humaines

Ce protocole présente une méthode simple en deux étapes afin de différencier les cellules souches épithéliales cornéennes limbique de cellules souches pluripotentes humaines dans des conditions de culture acellulaire xeno - et chargeur. Les méthodes de culture cellulaire présentés ici permettent une production rentable, à grande échelle des cellules qualité clinique applicables à l’utilisation de la thérapie des cellules cornéenne.

Efficace et évolutive différenciation dirigée de cliniquement compatibles cornéenne limbique épithéliales cellules souches à partir des cellules souches pluripotentes humaines

Une technique chirurgicale de transplantation de tissu rétinien dérivé de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) dans l’espace sous-rétinien d’un grand modèle animal est présentée ici.

Transplantation sous-rétinienne de tissu rétinien dérivé de cellules souches embryonnaires humaines dans un modèle félin de grand animal

Nous décrivons un protocole détaillé pour la préparation de cellules progénitrices photoréceptrices dérivées de hESC post-cryopréservées et l’administration sous-rétinienne de ces cellules chez des souris rd10 .

Livraison sous-rétinienne de progéniteurs de photorécepteurs dérivés de cellules souches embryonnaires humaines chez des souris rd10

La méthode décrite isolement et la caractérisation de l'homme dentaires cellules souches de pulpe (hDPSCs) en utilisant...

Différenciation isolement, caractérisation et comparative de l&#39;homme dentaires cellules souches de pulpe Dérivé de dents permanentes à l&#39;aide de deux méthodes différentes

Apprenez la cryoconservation optimale des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules souches embryonnaires humaines. Ce protocole améliore les taux de survie pour les thérapies de remplacement rétinien.

Cryoconservation de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules souches embryonnaires humaines au stade optimal (Vidéo) | JoVE Journal

Cryoconservation de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules souches embryonnaires humaines au stade optimal

Explorer plus de vidéos