AGRÉGATION DE CELLULES ENCAPSULÉES DANS UNE MATRICE DE MEMBRANE BASALE POUR ÉTUDIER LA FORMATION DE TISSU DE RATE MURIN

L’objectif global de ce protocole est d’agréger et d’enfermer des cellules dans une matrice semi-solide. Les agrégats cellulaires intégrés peuvent ensuite être utilisés en aval dans une culture in vitro tridimensionnelle, ou comme véhicule pour des expériences de transplantation in vivo. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle utilise une méthodologie et un équipement simples pour réaliser l’agrégation de cellules.

Il peut également être appliqué à une gamme de types et de nombres de cellules. Cette technique a révélé un type de cellule spécifique nécessaire à la régénération de la rate. Il pourrait découvrir d’autres régulateurs de la régénération des tissus de la rate ou servir de plate-forme pour des études d’ingénierie tissulaire plus larges.

Commencez par pré-refroidir une boîte de pointes de pipette de 200 microlitres dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, immergez Parafilm dans de l’éthanol à 80 % pendant 10 minutes, suivi d’un lavage de 10 minutes dans du PBS. Pour préparer la solution cellulaire, aliquotez le numéro de cellule souhaité dans un tube conique de 14 millilitres.

Centrifugez les cellules à 200 g et 4 degrés Celsius pendant 5 minutes. Aspirez ensuite soigneusement le surnageant, en laissant environ 20 microlitres de volume derrière vous. La pastille cellulaire peut ensuite être remise en suspension dans le volume surnageant restant.

À l’aide d’une pointe de pipette pré-refroidie, aspirer 2 microlitres de Matrigel glacé. Tournez doucement et éjectez pour retirer la pointe de la pipette. Étirez une bande de Parafilm pré-stérilisée et placez-la sur l’extrémité de la pointe de la pipette en prenant soin de ne pas percer le film.

Continuez à enrouler le Parafilm sur le côté pour vous assurer que la pointe est scellée. Ensuite, superposez doucement la solution cellulaire sur le Matrigel. Laissez la pointe de la pipette sur de la glace et préparez un tube conique de 14 millilitres avec un tube en grappe de 1,2 millilitre placé à l’intérieur.

La pointe de la pipette peut ensuite être insérée à l’intérieur de la configuration du tube emboîté et centrifugée à 400 g et 4 degrés Celsius pendant 5 minutes. Incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Le tube peut être placé sur de la glace jusqu’à nouvel ordre.

Retirez délicatement le Parafilm de la pointe de la pipette, puis insérez un piston à fil fin et expulsez le bouchon Matrigel dans le milieu de culture tissulaire. Les cellules agrégées peuvent être cultivées à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Rasez la fourrure à l’aide d’une tondeuse électrique et tamponnez la peau avec de l’éthanol à 80 %.

Faites une incision de deux centimètres dans la peau perpendiculairement à la colonne vertébrale et exposez la paroi péritonéale. Une deuxième incision plus petite est ensuite pratiquée dans la paroi péritonéale au-dessus du rein. Appliquez une pression et extériorisez le rein.

Assurez-vous que le rein est maintenu humide en appliquant régulièrement du PBS stérile. Pincez la capsule rénale avec une paire de pinces ultra-fines et, à l’aide d’une deuxième paire, déchirez doucement dans des directions opposées. Séparez soigneusement la membrane de la capsule du parenchyme rénal.

Soulevez la capsule rénale avec une paire de pinces et faites glisser lentement la pointe de la pipette à travers l’ouverture. Insérez délicatement un piston métallique dans la pointe de la pipette et expulsez le bouchon Matrigel. Humidifiez le rein avec du PBS et réintériorisez dans la cavité péritonéale.

Fermez la paroi péritonéale avec des sutures 5-O-Vicryl et fermez l’incision cutanée à l’aide d’un applicateur AutoClip et de deux pinces de plaie de 9 millimètres. Une étape clé de ce protocole consiste à agréger des cellules dans une matrice semi-solide. Un positionnement de couche intermédiaire est obtenu grâce à des vitesses de centrifugation optimales.

Des vitesses plus élevées propulsent les cellules jusqu’à l’extrémité de la pipette, tandis que des vitesses insuffisantes empêchent les cellules de se déplacer à travers la matrice. Après solidification, la construction Matrigel peut être éjectée de la pointe de la pipette. Les constructions stromales de la rate qui sont cultivées in vitro forment des structures organoïdes sphériques tridimensionnelles.

Les organoïdes présentent une structure non creuse avec des cellules présentes sur tout le diamètre du tissu. Ils sont composés de trois grandes populations cellulaires, à savoir les globules blancs, les globules rouges et les cellules stromales et endothéliales non hémopoïétiques. Les constructions peuvent également être transplantées sous la capsule rénale pour des études de régénération tissulaire.

Après quatre semaines, une structure tissulaire organisée de la rate peut être observée, y compris les artérioles centrales, les follicules des lymphocytes B, les cellules réticulaires fibroblastiques, les cellules myéloïdes de la pulpe rouge, les macrophages métallophiles de la zone marginale, les sinusoïdes de la pulpe rouge et les réseaux de cellules dendritiques folliculaires, la zone des lymphocytes T, les macrophages de la pulpe rouge et les cellules réticulaires de la zone marginale. Lorsque vous tentez d’agréger et d’encapsuler des cellules, il est important de ne pas oublier de travailler rapidement et de garder tous les matériaux sur la glace. L’étape la plus importante pour les transplantations est l’expulsion du bouchon Matrigel tout en retirant l’embout de pipette du rein.

Il faut veiller à ne pas perforer la membrane de la capsule ou à rompre le parenchyme rénal. Ce protocole a été utilisé pour étudier les besoins de deux populations de cellules stromales dans la régénération du tissu de la rate. Dans cette expérience représentative, seuls les agrégats appauvris en cellules négatives MAdCAM bêta positif au récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes n’ont pas réussi à initier la croissance tissulaire, ce qui suggère que cette population cellulaire particulière est essentielle à la régénération de la rate.