Name: Ingénierie de cellules microgliales induites par le sang humain pour la recherche sur le cerveau à traduction inverse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Découvrez l'ingénierie de cellules microgliales induites par le sang humain pour étudier l'inflammation cérébrale et les troubles neuropsychiatriques. Ce modèle cellulaire innovant permet d'évaluer la fonction microgliale dynamique chez l'humain.

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Ce travail a été partiellement soutenu par les subventions suivantes pour la recherche scientifique : (1) La Société japonaise pour la promotion de la science (KAKENHI ; JP18H04042, JP19K21591, JP20H01773 et JP22H00494 à TAK, JP22H03000 à M.O.) ; (2) L’Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (AMED ; JP21wm0425010 à TAK, JP22dk0207065 à M.O.) et 3) l’Agence japonaise pour la science et la technologie CREST (JPMJCR22N5 à TAK). Les organismes de financement n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publication ou la préparation du manuscrit. Nous tenons à remercier Editage (www.editage.jp) pour l’édition en anglais.

Le protocole d’étude a été approuvé par le Comité d’éthique de l’Université de Kyushu et était conforme à toutes les dispositions de la Déclaration d’Helsinki. Tous les participants, y compris les volontaires en bonne santé et les patients, ont obtenu le consentement éclairé de tous les participants, pour analyser leur sang et publier leurs données. Les matériaux et les équipements sont répertoriés dans le tableau des matériaux, et les compositions des solutions sont détaillées dans le tableau 1.
1. Préparation des milieux et des tampons pour les expériences
<ol><li>Préparez le milieu d’isolement en complétant le RPMI-1640 avec 10 % de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (56 °C, 30 min) et 1 % de pénicilline-streptomycine.</li>
	<li>Préparez le tampon d’isolement en complétant la solution tampon basique avec une solution mère d’albumine sérique bovine (BSA) à 0,5 % et stérilisez-la par filtration (0,22 μm).</li>
</ol>2. Isolement de cellules mononucléées à partir du sang total
<ol><li>Transvaser 15 mL du milieu à gradient de densité dans un tube de centrifugation à gradient de densité de 50 mL et centrifuger à 1 000 × g pendant 1 min à 20 °C. REMARQUE : Isolez 15 ml de sang par tube de centrifugation à gradient de densité de 50 ml. Augmentez le nombre de tubes lorsque le volume sanguin est élevé.</li>
	<li>Homogénéiser le sang recueilli dans les tubes d’héparine par inversion et retirer le couvercle du tube de prélèvement sanguin à l’aide d’une pince à épiler stérilisée au feu.</li>
	<li>Distribuer un volume égal (10 à 15 ml) de sang dans le milieu à gradient de densité dans le tube de centrifugation à gradient de densité.</li>
	<li>Réglez le niveau de décélération de la centrifugeuse sur 1 des 4 niveaux et centrifugez à 1 000 × g pendant 10 min à température ambiante (RT). REMARQUE : À ce taux de décélération, une vitesse de rotation de 180 × g (1 000 tr/min) s’arrête en 3 min.</li>
	<li>Préparez un nombre égal de tubes à centrifuger de 50 mL et de tubes de centrifugation à gradient de densité de 50 mL et remplissez chaque tube avec 10 mL de PBS (−).</li>
	<li>Retirez la couche supérieure de plasma jusqu’à environ 1 cm au-dessus de la couche leucocytaire après la centrifugation. REMARQUE : Insérez une pipette d’aspiration verticalement dans le tube et aspirez soigneusement à partir du centre de la surface du liquide. Ne pas trop aspirer pour éviter de déranger la couche leucocytaire.</li>
	<li>Décantez tout le surnageant restant du tube de centrifugation à gradient de densité de 50 mL dans un tube à centrifuger contenant 10 mL de PBS (−).</li>
	<li>Réinitialisez le niveau de décélération de la centrifugeuse à 3 ou 4 niveaux et centrifugez à 250 × g pendant 10 min à RT. Au cours de cette étape, préparez un tube à centrifuger de 50 mL et deux tubes à centrifuger de 15 mL ainsi qu’une crépine à cellules de 100 m.</li>
	<li>Après la centrifugation, établissez la température de la centrifugeuse à 4 °C. Recherchez une pastille blanche avec une périphérie rouge au fond du tube de centrifugation. Retirer le surnageant par aspiration et détacher doucement la pastille en tapotant dessus.</li>
	<li>Placez une crépine à cellules de 100 μm sur le tube conique de 50 mL à l’aide d’une pince à épiler stérilisée au feu.</li>
	<li>Incorporer 13 ml de milieu d’isolement dans l’un des tubes centrifugés et laver la paroi interne pour bien recueillir les cellules. Prenez la suspension cellulaire et lavez les tubes centrifugés restants de manière consécutive. Après avoir recueilli les cellules de tous les tubes, filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine à cellules dans le tube conique de 50 ml. REMARQUE : Le fluide d’isolement doit être refroidi tout au long du processus d’isolement (étapes 2.11-2.16).</li>
	<li>Lavez de nouveau chaque tube avec 13 ml de milieu d’isolement comme décrit à l’étape 2.11. Prélever un total de 26 mL de suspension cellulaire.</li>
	<li>Répartissez des quantités égales dans deux tubes coniques de 15 mL, énumérez les cellules et calculez la concentration appropriée de tampon d’isolement (60 μL de tampon pour 107 cellules au total) pour l’étape 2.16. REMARQUE : Il est préférable de travailler avec le tube conique de 15 ml car le volume de liquide est faible et le liquide bouillonne facilement lors du pipetage à l’étape 2.16.</li>
	<li>Centrifugeuse à 250 × g pendant 10 min à 4 °C.</li>
	<li>Lors de la centrifugation, désinfectez soigneusement le support magnétique (en particulier la partie en contact avec la colonne) avec de l’éthanol à 70% et placez-le sur le banc pour le faire sécher à l’air. Gardez le tampon d’isolement sur de la glace.</li>
	<li>Retirez le surnageant par aspiration (à ce stade, recherchez des pastilles rouges de ~1 mm d’épaisseur en raison de la présence de globules rouges), ajoutez la quantité appropriée de tampon d’isolement et détachez doucement la pastille en pipetant ~20x.</li>
</ol>3. Isolement des monocytes à l’aide de microbilles CD11b
<ol><li>Réactif de blocage du FcR humain Vortex pendant 10 s avant l’application. Incorporer la quantité requise de réactif (20 μL de réactif bloquant FcR pour 10à 7 cellules au total) et incuber dans une chambre à 4 °C pendant 5 min.</li>
	<li>Vortex les microbilles CD11b pendant 10 s avant l’application. Incorporer la quantité requise de réactif (20 μL de microbilles CD11b pour 10à 7 cellules au total) et incuber dans une chambre à 4 °C pendant 20 min en agitant à la main toutes les 5 min.</li>
	<li>Après l’incubation, ajouter 10 mL de tampon d’isolement, suspendre par pipetage doux et centrifuger à 300 × g pendant 10 min à 4 °C.</li>
	<li>Pendant la centrifugation, placez la colonne magnétique sur le support magnétique et rincez-la avec 3 mL de tampon d’isolement. REMARQUE : Évitez de toucher la partie magnétique de la colonne et positionnez correctement la colonne. Si des bulles pénètrent dans la colonne, retirez-les à l’aide d’une pipette. Le tampon d’isolement doit être réfrigéré tout au long du processus d’isolement (étapes 3.4 à 3.9).</li>
	<li>Retirer le surnageant de postcentrifugation par aspiration, incorporer 1 mL de tampon d’isolement, mélanger par pipetage doux et appliquer la suspension sur la colonne.</li>
	<li>Lavez la colonne 3 fois en ajoutant 3 ml de tampon d’isolement chaque fois que le réservoir de la colonne est vide.</li>
	<li>Placez la colonne dans un tube conique de 15 mL sans toucher la partie magnétique ; incorporer 5 mL de tampon d’isolement dans la colonne et forcer le liquide à s’écouler à travers la colonne à l’aide d’un piston inséré dans le tube.</li>
	<li>Centrifuger la suspension cellulaire recueillie dans le tube à 300 × g pendant 10 min à 4 °C.</li>
	<li>Aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un milieu d’isolement. Comme ~5 à 10 % du nombre de cellules comptées à l’étape 2.13 sera récupéré, ajustez le volume de suspension en fonction du nombre de cellules. REMARQUE : Le fluide d’isolation doit être utilisé à RT et non chauffé pour éviter un changement rapide de température à partir de 4 °C.</li>
	<li>Énumérer les cellules et aliquote 500 μL de suspension cellulaire dans chaque puits de plaques à 24 puits à une concentration de 40 × 104 cellules/mL et incuber pendant la nuit. REMARQUE : Les suspensions cellulaires doivent être pipetées de manière appropriée en fonction du volume de semis ajusté requis pour différentes plaques. Par exemple, 1 mL pour un puits dans une plaque à 12 puits et 250 μL pour un puits dans une lame à chambre à 8 puits.</li>
	<li>Enfin, éliminer ou désinfecter l’équipement contaminé conformément à la politique de manipulation des déchets infectieux établie par l’installation.</li>
</ol>4. Induction de cellules iMG à partir de monocytes
<ol><li>Préparez le milieu d’induction en complétant le milieu d’induction basal avec une solution d’antibiotique-antimycosique à 1 %, 10 ng/mL de GM-CSF humain recombinant et 100 ng/mL d’IL-34 humaine recombinante.</li>
	<li>Remplacez le milieu d’isolement de l’ensemencement de la veille par un milieu à induction. Inclinez la plaque vers l’avant et aspirez rapidement le fluide appauvri par le bord avant du fond du puits à l’aide d’une pipette Pasteur. Remplacez le fluide à raison d’un maximum de 1 plaque (= 24 puits) à la fois, et incorporez immédiatement 500 μL de fluide à induction en douceur. REMARQUE : Les monocytes adhérents doivent être sélectionnés dans cette étape.</li>
	<li>Incuber les cellules pendant 14 jours pour terminer l’induction.</li>
	<li>Remplacez à nouveau le milieu par 500 μL de milieu à induction après 14 jours. Par la suite, pour l’entretien post-induction des cellules, remplacez le milieu d’induction par 500 μL de milieu d’induction frais chaque semaine.</li>
</ol>5. Immunocytochimie
<ol><li>Retirer le milieu de la lame de chambre à 8 puits ensemencée de cellules à l’étape 3.10 par aspiration et rincer avec du PBS (-).</li>
	<li>Fixez les cellules pendant 20 min à RT avec 4% de paraformaldéhyde.</li>
	<li>Retirer le réactif fixateur et rincer les cellules pendant 3 x 5 min avec du PBS (-).</li>
	<li>Perméabiliser les cellules avec du PBS (-) contenant 0,1 % de Triton X-100 à RT.</li>
	<li>Incuber les cellules perméabilisées avec une solution bloquante (3% BSA/PBS (−)) pendant 1 h à RT.</li>
	<li>Incuber les cellules pendant la nuit avec des anticorps primaires (Table des matières) à 4 °C. REMARQUE : Tous les anticorps sont dilués dans une solution bloquante.</li>
	<li>Rincez les cellules pendant 3 x 5 minutes avec du PBS (-) pendant 5 minutes chacune.</li>
	<li>Incuber les cellules rincées avec les anticorps secondaires appropriés marqués par fluorescence pendant 1 h à RT (Table of Materials).</li>
	<li>Rincez les cellules pendant 3 x 5 minutes avec du PBS (-) pour éliminer les anticorps secondaires.</li>
	<li>Incuber les cellules avec une solution de DAPI (1:10 000) diluée avec du PBS (-) pendant 5 min à RT.</li>
	<li>Rincer les cellules pendant 3 x 5 min avec du PBS (-).</li>
	<li>Montez le puits à l’aide du milieu de montage et visualisez les cellules au microscope à fluorescence.</li>
</ol>

Développement de cellules microgliales induites par le sang pour l’étude des troubles cérébraux humains

<ol><li>Steiner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+aspects+in+the+neurobiology+of+suicide%3A+elevated+microglial+density+in+schizophrenia+and+depression+is+associated+with+suicide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Psychiatr+Res%22%5BJournal%5D)">Immunological aspects in the neurobiology of suicide: elevated microglial density in schizophrenia and depression is associated with suicide.</a> J Psychiatr Res. 42 (2), 151-157 (2008).</li>
<li>Setiawan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+translocator+protein+total+distribution+volume+with+duration+of+untreated+major+depressive+disorder%3A+a+cross-sectional+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Association of translocator protein total distribution volume with duration of untreated major depressive disorder: a cross-sectional study.</a> Lancet Psychiatry. 5 (4), 339-347 (2018).</li>
<li>Holmes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+translocator+protein+in+anterior+cingulate+in+major+depression+and+a+role+for+inflammation+in+suicidal+thinking%3A+a+positron+emission+tomography+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Elevated translocator protein in anterior cingulate in major depression and a role for inflammation in suicidal thinking: a positron emission tomography study.</a> Biol Psychiatry. 83 (1), 61-69 (2018).</li>
<li>Meyer, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation+in+psychiatric+disorders%3A+PET+imaging+and+promising+new+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation in psychiatric disorders: PET imaging and promising new targets.</a> Lancet Psychiatry. 7 (12), 1064-1074 (2020).</li>
<li>Ohgidani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+induction+of+ramified+microglia-like+cells+from+human+monocytes%3A+dynamic+microglial+dysfunction+in+Nasu-Hakola+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Direct induction of ramified microglia-like cells from human monocytes: dynamic microglial dysfunction in Nasu-Hakola disease.</a> Sci Rep. 4, 4957(2014).</li>
<li>Method of producing microglial cells. France patent EP. , 3 092 305 B1 (2023).</li>
<li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li>
<li>Mattis, V. B., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+a+new+revolution+for+clinical+neurology%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: a new revolution for clinical neurology.</a> Lancet Neurol. 10 (4), 383-394 (2011).</li>
<li>Dimos, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321 (5893), 1218-1221 (2008).</li>
<li>Pfisterer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10343-10348 (2011).</li>
<li>Pang, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+human+neuronal+cells+by+defined+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of human neuronal cells by defined transcription factors.</a> Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-34+is+a+tissue-restricted+ligand+of+CSF1R+required+for+the+development+of+Langerhans+cells+and+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia.</a> Nat Immunol. 13 (8), 753-760 (2012).</li>
<li>Aloisi, F., De Simone, R., Columba-Cabezas, S., Penna, G., Adorini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maturation+of+adult+mouse+resting+microglia+into+an+APC+is+promoted+by+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+and+interaction+with+Th1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functional maturation of adult mouse resting microglia into an APC is promoted by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interaction with Th1 cells.</a> J Immunol. 164 (4), 1705-1712 (2000).</li>
<li>Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+colony+stimulation+factor-1+receptor+results+in+loss+of+microglia%2C+disrupted+brain+development+and+olfactory+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits.</a> PLoS One. 6 (10), e26317(2011).</li>
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<li>Douvaras, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to microglia.</a> Stem Cell Rep. 8 (6), 1516-1524 (2017).</li>
<li>Yonemoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+and+mitochondrial+vulnerability+configurate+the+divergent+immunoreactivity+of+human+induced+microglia-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity and mitochondrial vulnerability configurate the divergent immunoreactivity of human induced microglia-like cells.</a> Clin Immunol. 255, 109756(2023).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les techniques analytiques utilisant des cellules iMG peuvent constituer de puissants outils de recherche translationnelle inverse 5,6. Pour générer des quantités suffisantes de cellules iMG humaines, les expérimentateurs doivent concevoir leurs études en tenant compte de certains problèmes. Les échantillons de sang provenant d’êtres humains sont extrêmement sensibles ; Par conséquent, les échantillons obtenus nécessitent un traitement rapide et une manipulation méticuleuse pour éviter toute contamination. Plus précisément, les échantillons de sang doivent être séparés immédiatement après avoir été prélevés et ne pas être laissés sans surveillance pendant de longues périodes. Les expériences sont conventionnellement commencées dans les 3 heures suivant le prélèvement sanguin pour confirmer leur validité ; cependant, il est possible de conserver les échantillons de sang à 4 °C pendant plus de 3 h et de les ramener à température ambiante avant de commencer les protocoles de séparation.
Pour garantir des résultats stables, il est recommandé d’utiliser les réactifs tels que les milieux de culture dans le mois suivant le descellement et de les jeter à la date d’expiration. Lors de la séparation de cellules mononucléées du sang périphérique à l’aide de la centrifugation à gradient de densité, une agrégation cellulaire peut être observée dans certains échantillons. Dans de tels cas, l’échantillon de sang entier doit être dilué avec du PBS (-) pour éviter l’agrégation. Lors de l’induction de la différenciation en microglie, le milieu de culture n’est pas remplacé pendant 14 jours pour éviter une stimulation inutile des cellules. Après l’achèvement de l’induction de la différenciation, le remplacement du milieu par un milieu frais peut restaurer les cellules affaiblies et maintenir la viabilité pendant un certain temps.
La technique iMG établie dans cette étude présente une limite ; Les « cellules microglia-like » induites expérimentalement sont comparables, mais pas complètement identiques, aux cellules microgliales réelles du cerveau humain. De plus, des recherches antérieures ont documenté une méthodologie pour l’induction de cellules microgliales dérivées de monocytes humains, et différents groupes de recherche ont proposé leurs propres protocoles et noms distincts en fonction des méthodes iMG originales28. Par exemple, certains protocoles utilisent M-CSF 29,30,31,32 ou TGF-β 33, qui favoriseraient un phénotype de type microglie dans les cultures de microglie dérivées d’iPSC ou sur des revêtements tels que Geltrex 24,34 ; Ces facteurs peuvent s’avérer efficaces pour induire des cellules de type microglie.
La technologie iMG originale est avantageuse en raison de son protocole simple et facile à reproduire avec seulement deux cytokines et aucun revêtement, ce qui permet une variété d’expériences de traduction inverse utilisant du sang humain. À l’inverse, les progrès technologiques ont facilité le développement de nombreux produits. Les méthodes de séparation magnétique comprennent la sélection positive sur colonne, similaire à notre protocole, ainsi que la sélection négative et les méthodes sans colonne. De plus, au lieu de la séparation magnétique, une autre méthode de séparation utilisant l’adhérence plastique peut être envisagée. La sélection positive basée sur des colonnes garantit la pureté, mais la technique prend du temps et la stimulation par des billes magnétiques affecte considérablement les cellules35. Au contraire, la sélection négative et l’adhésion plastique peuvent être moins préjudiciables aux cellules ; Néanmoins, ces approches peuvent être moins pures35,36. D’autres modifications pourraient être nécessaires en fonction d’autres protocoles à l’avenir.
Les résultats susmentionnés confirment que l’avantage prédominant de cette technologie iMG est sa courte durée, sa méthodologie rentable et sa capacité à traiter un grand nombre d’échantillons pour des études à haut débit. Par conséquent, cette technologie peut être utilisée pour acquérir des connaissances à partir d’échantillons humains, puis mener d’autres études de validation à l’aide de différents modèles animaux. De plus, les résultats obtenus à partir d’investigations menées sur des modèles cellulaires et animaux en appliquant la technique iMG peuvent être bénéfiques. De cette façon, notre technique iMG peut être appliquée à la recherche translationnelle bidirectionnelle de manière à être du chevet au laboratoire et du laboratoire au chevet du patient.

Au cours des dernières années, il a été suggéré que l’inflammation cérébrale joue un rôle central dans la physiopathologie de divers troubles cérébraux et neuropsychiatriques ; les microglies ont été mises en évidence comme des cellules immunomodulatrices clés par l’analyse cérébrale post-mortem humaine et les techniques de bio-imagerie basées sur la tomographie par émission de positons (TEP) 1,2,3,4. Les analyses post-mortem du cerveau et de l’imagerie TEP révèlent des résultats significatifs ; Néanmoins, ces approches sont inefficaces en termes de capture des activités moléculaires dynamiques de la microglie humaine dans le cerveau dans leur intégralité. Par conséquent, de nouvelles stratégies sont nécessaires pour permettre une évaluation complète des fonctions et des dysfonctionnements microgliaux humains aux niveaux moléculaire et cellulaire.
En 2014, nous avons initialement mis au point une nouvelle technique pour produiredes cellules microglia-like (iMG) directement induites 5,6, avant la première publication de cellules microglia-like dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSC) en 20167. En seulement 2 semaines, nous avons réussi à convertir les monocytes du sang périphérique humain en cellules iMG en optimisant les cytokines, le facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) et l’interleukine 34 (IL-34). Lorsque nous avons développé cette technique, la méthode innovante de reprogrammation consistant à induire des cellules neuronales à partir de cellules iPS ou de fibroblastes commençait tout juste à s’imposer dans le monde 8,9,10,11. Cependant, à cette époque, une méthode pour induire des cellules microgliales dérivées d’iPS n’avait pas encore été rapportée, et la génération d’un modèle microglial dérivé de cellules somatiques humaines était souhaitée. Étant donné que des cytokines telles que GM-CSF et IL-34, facteur de stimulation des colonies de macrophages, ont été signalées comme étant nécessaires au développement et au maintien de la microglie 12,13,14,15, nous avons émis l’hypothèse qu’une combinaison de ces cytokines pourrait être appliquée directement pour générer un modèle cellulaire microglial à partir de monocytes sanguins. Enfin, nous avons réussi à développer un modèle de microglie dérivé des monocytes en combinant GM-CSF et IL-345. De plus, certaines de ces combinaisons de cytokines sont également utilisées pour induire des cellules microgliales à partir de cellules iPS 7,16 et sont supposées être un facteur important dans l’acquisition des caractéristiques microgliales.
Contrairement aux méthodes iPSC, les cellules iMG ne nécessitent aucune modification génétique et peuvent être générées en très peu de temps par simple induction chimique, ce qui permet de réduire les coûts en temps et en argent. De plus, les cellules iMG ne nécessitent pas de reprogrammation génétique, nous pensons donc que les cellules iMG sont de puissantes cellules de substitution pour évaluer non seulement les traits mais aussi les états de la microglie humaine. Dans l’article initial sur la technique iMG en 2014, nous avons confirmé que les cellules iMG présentent un phénotype de la microglie humaine, qui peut être distinct des monocytes et des macrophages. Par exemple, les cellules iMG ont présenté un rapport de surexpression du récepteur des chimiokines CX3C 1 (CX3CR1) et du récepteur des chimiokines C-C de type 2 (CCR2) par rapport aux monocytes et aux marqueurs microgliaux typiques, y compris la protéine transmembranaire 119 (TMEM 119) et le récepteur purinergique P2RY12 5,17. Récemment, nous avons validé que les cellules iMG dérivées du sang périphérique ressemblent à la microglie cérébrale dans leur profil d’expression génique de marqueurs microgliaux bien connus chez le même patient qui a subi une chirurgie cérébrale18. Les cellules iMG peuvent être analysées pour des fonctions dynamiques au niveau moléculaire, telles que la phagocytose et la production de cytokines, et devraient compenser les inconvénients de la recherche cérébrale post-mortem et des études TEP.
Nous avons découvert des mécanismes physiopathologiques dynamiques jusqu’alors inconnus impliquant la microglie chez des patients diagnostiqués avec la maladie de Nasu-Hakola5, la fibromyalgie19, le trouble bipolaire20,21 ou la maladie de Moyamoya22. De plus, sur la base de notre méthodologie originale, divers laboratoires ont utilisé les cellules iMG (certains laboratoires ont désigné d’autres noms pour ces cellules) comme un outil de recherche translationnel inverse crucial 23,24,25,26,27. Sellgren et al. ont réussi à générer des cellules iMG conformément à nos recommandations et ont effectué une analyse de microréseau, qui a révélé que ces cellules ressemblent étroitement à la microglie du cerveau humain23. Récemment, nous avons confirmé la ressemblance entre les cellules iMG humaines et la microglie primaire du cerveau en utilisant le séquençage de l’ARN18.
Cette étude visait à documenter la méthodologie de génération de cellules iMG à partir de sang périphérique humain afin de faciliter la recherche translationnelle inverse axée sur les maladies neuropsychiatriques. Cette technique présente le potentiel d’un outil analytique raisonnable qui peut produire sans effort des modèles de cellules microgliales en peu de temps, même dans des laboratoires mal équipés qui manquent d’appareils de transfert de gènes ou de personnel compétent.

<table><tbody><tr><td>0,1 % Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30-5140-5</td><td></td></tr><tr><td>4 % paraformaldéhyde</td><td>Nacalai Tesque</td><td>09154-14</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique-Antimycosique (100x)</td><td>gibco</td><td>15240-062</td><td>décrit comme « solution antibiotique-antimycosique"</td></tr><tr><td>solution de rinçage autoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>décrit comme une « solution tampon de base » et utilisé pour le « tampon d’isolement"</td></tr><tr><td>CD11b MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130&ndash ; 049-601</td><td></td></tr><tr><td>Solution DAPI</td><td>DOJINDO</td><td>28718-90-3</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Phosphate Buffered</td><td>Saline Nacalai Tesque</td><td>14249-24</td><td>décrit comme "PBS (&minus ;)"</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>biowest</td><td>S1760-500</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de blocage du FcR humain</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130&ndash ; 059-901</td><td></td></tr><tr><td>Leucosep</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227290</td><td>décrit comme « tube de centrifugation à gradient de densité"Colonnes</td></tr> <tr><td>MACS LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>décrit comme « colonne magnétique"</td></tr><tr><td>Solution mère MACS BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>décrit comme « solution mère d’albumine sérique bovine (BSA)"</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>décrit comme « support magnétique"</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26253&ndash ; 84</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>P10144</td><td>décrit comme « support de montage »</td></tr> <tr><td>recombinant humain GM-CSF</td><td>R& D Systems</td><td>215-GM</td><td></td></tr><tr><td>IL-34 humain recombinant</td><td>R& D Systems</td><td>5265-IL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium + GlutaMAX Supplement (milieu pré-supplémenté)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61870036</td><td>décrit comme « milieu d’induction basale"</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Nacalai Tesque</td><td>30264-56</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-P2RY12 anticorps</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA014518</td><td>anticorps primaire, lapin, 1:100</td></tr><tr><td>anticorps anti-TMEM119</td><td>Anticorps primaire Sigma-Aldrich</td><td>HPA051870</td>, <td>lapin, 1:100</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-Rabbit IgG (H+L) de chèvre, Alexa Fluor 568</td><td>invitrogen</td><td>A-11011</td><td>Anticorps secondaire, lapin, 1:1000</td></tr></tbody></table>

ingénierie de cellules microgliales induites par le sang humain pour la recherche sur le cerveau à traduction inverse

Engineering of Human Blood-Induced Microglia-like Cells for Reverse-Translational Brain Research

Des recherches récentes utilisant des modèles animaux ont mis en évidence l’importance de la microglie en tant que modulateurs immunologiques cruciaux dans diverses maladies neuropsychiatriques et physiques. L’analyse cérébrale post-mortem et l’imagerie par tomographie par émission de positrons sont des méthodes de recherche représentatives qui évaluent l’activation microgliale chez les patients humains. Les résultats ont révélé l’activation de la microglie dans le cerveau de patients présentant divers troubles neuropsychiatriques et des douleurs chroniques. Néanmoins, la technique susmentionnée ne fait que faciliter l’évaluation d’aspects limités de l’activation microgliale. 
Au lieu de la biopsie cérébrale et de la technique des cellules souches pluripotentes induites, nous avons initialement conçu une technique pour générer des cellules de type microglie (iMG) directement induites à partir de monocytes de sang périphérique humain fraîchement dérivés en les complétant avec du facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages et de l’interleukine 34 pendant 2 semaines. Ces cellules iMG peuvent être utilisées pour effectuer des analyses morphologiques et moléculaires dynamiques concernant la capacité phagocytaire et les libérations de cytokines suite à une stimulation du stress au niveau cellulaire. Récemment, une analyse complète du transcriptome a été utilisée pour vérifier la similitude entre les cellules iMG humaines et la microglie primaire du cerveau. 
Les cellules iMG dérivées de patients peuvent servir de marqueurs de substitution clés pour prédire l’activation microgliale dans le cerveau humain et ont contribué à dévoiler une physiopathologie dynamique de la microglie jusqu’alors inconnue chez les patients atteints de la maladie de Nasu-Hakola, de la fibromyalgie, du trouble bipolaire et de la maladie de Moyamoya. Par conséquent, la technique basée sur l’iMG constitue un outil précieux de traduction inverse et fournit de nouvelles perspectives pour élucider la dynamique de la physiopathologie moléculaire de la microglie dans diverses maladies mentales et physiques.

Il est important de noter qu’il existe une grande hétérogénéité au niveau de la personne et au niveau du moment dans les caractères des cellules iMG, y compris les morphologies et les expressions génétiques. Chez certains individus, les cellules iMG prennent une apparence de nombreuses ramifications (Figure 1A), tandis que chez d’autres, elles restent sphériques (Figure 1B). Les caractéristiques de l’iMG peuvent différer même au sein d’un même individu, ce qui fait des cellules iMG un outil essentiel pour détecter les biomarqueurs de l’état de la maladie. À l’inverse, l’examen de ces différences interindividuelles justifie la réduction des erreurs techniques. Les cellules iMG sont définies comme des monocytes induits par le GM-CSF et l’IL-34 pendant au moins 14 jours. Pour minimiser les erreurs techniques, il est recommandé de normaliser le temps d’induction, d’utiliser les mêmes quantités de réactifs et de ne pas utiliser de réactifs périmés.
La validation de l’immunomarquage confirme également que les cellules iMG expriment des marqueurs microgliaux, notamment P2RY12 et TMEM119 (Figure 2). Des recherches antérieures ont démontré que les caractéristiques morphologiques et d’expression génique des cellules iMG sont associées à la physiopathologie du trouble bipolaire 20,21. Les cellules ramifiées les plus précoces ont été observées le JOUR 3 après le traitement par GM-CSF et IL-34, et les cellules iMG dans un état optimal peuvent survivre plus d’un mois lorsque le changement de milieu est effectué une fois par semaine. Les cellules iMG peuvent être utilisées pour l’analyse de l’expression génique. Par exemple, lors de stimulations avec de l’interféron gamma ou de l’IL-4, les cellules iMG ont modifié le modèle d’expression génique, ce qui peut être utilisé pour l’évaluation fonctionnelle de la microglie polarisée M1 et M2 5,22. De plus, les billes FITC déclenchent des modifications morphologiques semblables à celles des amiboïdes et régulent à la hausse l’expression du TNFα et d’autres gènes5. De plus, la phagocytose peut être évaluée en mesurant l’intensité de fluorescence des billes 5,22. De plus, comme les cellules iMG sont des cellules viables, leur mouvement réel et leurs altérations morphologiques peuvent être observés en prenant des photos cellulaires (Figure 3) ou en prenant des photos en accéléré (Vidéo 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66819/66819fig01.jpg"> Figure 1 : Morphologie des cellules iMG. (A) Les iMG ramifiés typiques présentaient de minuscules corps soma et de nombreux collatéraux ramifiés. (B) Certains échantillons variaient en apparence, comme le type amiboïde. Barre d’échelle, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66819/66819fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66819/66819fig02.jpg"> Figure 2 : Immunocytocoloration des cellules iMG. Les cellules iMG expriment des marqueurs microgliaux typiques : (A) TMEM 119, (B) P2RY12. Les noyaux ont été colorés au DAPI (bleu). Barre d’échelle = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66819/66819fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66819/66819fig03.jpg"> Figure 3 : Modifications morphologiques dans les cellules iMG. Les iMG modifient leur morphologie au cours du processus d’induction. Les protubérances cellulaires apparaissent (A) vers le jour 3 et s’allongent les jours (B) 7 et (C) 14 au fur et à mesure que l’induction se poursuit. Barre d’échelle = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66819/66819fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Vidéo 1 : Photographie en accéléré des cellules iMG. La cellule iMG ramifiée au centre semblait établir un contact avec les cellules environnantes tout en étendant et en contractant leurs processus. De plus, la cellule a effectué la phagocytose des cellules endommagées. Les intervalles d’acquisition des images étaient de 46 secondes et la durée du tournage était d’environ 14 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66819/Mov.1.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.</a>
Tableau 1 : Composition des solutions <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66819/66819_Table%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

Cette étude définit une nouvelle approche pour l’établissement de cellules microgliales (iMG) dérivées de monocytes humains qui permettent l’évaluation indirecte de l’inflammation cérébrale. Il s’agit d’un modèle cellulaire qui pourrait être bénéfique pour la recherche axée sur l’inflammation potentielle du cerveau et les troubles neuropsychiatriques associés.

Ingénierie de cellules microgliales induites par le sang humain pour la recherche sur le cerveau à traduction inverse

Recent investigations employing animal models have highlighted the significance of microglia as crucial immunological modulators in various ...

Notre laboratoire à l’Université de Kyushu visait à clarifier les rôles de la dysfonction microgliale dans divers troubles neuropsychiatriques. Nous pensons que notre technologie de cellules iMG apportera un nouvel éclairage sur la fonction dynamique microgliale et le dysfonctionnement au niveau cellulaire chez l’homme au-delà des limites de l’analyse du cerveau humain, comme l’étude post-mortem et les études du cerveau des animaux de compagnie. Même aujourd’hui, les expériences sur les animaux sont essentielles pour clarifier la physiopathologie cérébrale des troubles mentaux, mais il n’est pas clair dans quelle mesure les données sur les rongeurs peuvent être appliquées à la physiopathologie humaine.Notre technologie de cellules iMG induites par le sang humain comble l’écart entre les données sur les rongeurs, les données cliniques et la fonction et/ou le dysfonctionnement microgliaux. D’autres modèles de maladies cellulaires dérivées de l’homme, des cellules microgliales dérivées de cellules iPS humaines sont également développées, qui nécessitent beaucoup de temps et d’argent pour être développées et peuvent évaluer les marqueurs de traits mais pas les marqueurs d’état. L’avantage de notre méthode iMG est qu’elle est beaucoup plus simple, moins chronophage et rentable.Nous avons déjà révélé plusieurs facteurs moléculaires candidats par notre recherche translationnelle inversée iMG axée sur les troubles neuropsychiatriques tels que la démence, le trouble bipolaire, la fibromyalgie, le gliome et la maladie. Nous pensons que notre technologie de cellules iMG jettera un nouvel éclairage sur la fonction dynamique microgliale et le dysfonctionnement au niveau cellulaire dans divers troubles neuropsychiatriques.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source : Parajuli, B., et.al. Transplantation de microglie dérivée de cellules souches pluripotentes humaines induites dans le cerveau de souris immunocompétentes par voie transnasale non invasive. J. Vis. Exp. (2022).Cette vidéo démontre la transplantation transnasale de cellules microgliales humaines dérivées de cellules souches pluripotentes induites (iPSMG) dans le cerveau d’une souris. L’hyaluronidase est appliquée sur les narines d’une souris appauvrie en microglies pour améliorer la...

Transplantation transnasale de cellules microgliales humaines dérivées de cellules souches pluripotentes induites dans le cerveau de souris

Nous présentons ici un protocole pour isoler microglies de souriceaux post - natal (jour 1) pour l' expérimentation in vitro. Cette méthode d'isolement improvisée génère à la fois un rendement et une pureté élevés, un avantage significatif par rapport aux méthodes de remplacement qui permet une expérimentation à large gamme pour les besoins de l'élucidation de la biologie de la microglie.

Rapide et raffiné CD11b Isolation magnétique de primaire microglies avec pureté améliorée et polyvalence

Nous fournissons un protocole pour l'isolement des microglies de différentes régions disséquées d'un hémisphère de cerveau de souris adulte, suivi de la préparation semi-automatisée de bibliothèque pour le séquençage profond d'ARN unicellulaire des transcriptomes pleine longueur. Cette méthode aidera à élucider l'hétérogénéité fonctionnelle des microglies dans la santé et la maladie.

Isolement des microglies spécifiques à la région de l'hémisphère cérébral d'une souris adulte pour le séquençage profond de l'ARN à une seule cellule

Ce protocole est une méthode efficace, rentable et robuste d’isoler les microglies primaires des tissus cérébraux vivants, adultes et humains. Les microglies humains primaires isolés peuvent servir d’outil pour étudier les processus cellulaires dans l’homéostasie et la maladie.

Obtention de microglies humaines à partir de tissus cérébraux humains adultes

Nous présentons une méthode (GM-free) génétiquement modifiée pour obtenir des cellules avec un phénotype neuronal des cellules sanguines périphériques reprogrammées. L’activation d’une voie de signalisation liée à une nouvelle protéine humaine liée au GPI révèle une méthode efficace sans OGM pour obtenir des cellules souches pluripotentes humaines.

Génération sans OGM de cellules neuronales dérivées du sang

Le protocole présenté ici permet la transplantation de microglies humaines induites dérivées de cellules souches pluripotentes (iPSMG) dans le cerveau par voie transnasale chez des souris immunocompétentes. La méthode de préparation et de transplantation transnasale de cellules et l’administration d’un mélange de cytokines pour le maintien de l’iPSMG est présentée.

Transplantation de microglies dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans le cerveau de souris immunocompétentes par voie transnasale non invasive

Ce protocole décrit le processus de différenciation des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPi) en cellules de type microglie pour l’expérimentation in vitro . Nous incluons également une procédure détaillée pour générer des synaptosomes humains à partir de motoneurones inférieurs dérivés de l’iPSC qui peuvent être utilisés comme substrat pour des tests de phagocytose in vitro utilisant des systèmes d’imagerie de cellules vivantes.

Cellules humaines de type microglie : différenciation à partir de cellules souches pluripotentes induites et dosage in vitro de la phagocytose sur cellules vivantes à l’aide de synaptosomes humains

Les microglies sont des cellules immunitaires résidentes uniques dans la rétine, jouant un rôle crucial dans diverses maladies dégénératives de la rétine. La génération d’un modèle de co-culture d’organoïdes rétiniens avec des microglies peut faciliter une meilleure compréhension de la pathogenèse et de la progression du développement des maladies rétiniennes.

Assemblage d’organoïdes rétiniens avec la microglie

Nous présentons un protocole pour générer un organoïde cérébral humain avec une microglie résidente en incorporant des cellules progénitrices hématopoïétiques (HPC) dérivées de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) dans le développement d’organoïdes.

Dérivation d’un organoïde du cerveau humain avec développement de la microglie

Une méthode nouvelle DC indépendante pour l'induction et l'expansion des cellules T spécifiques d'antigènes est décrite. HLA A2-Ig des cellules à base Antigène artificielle Présentation (AAPC) sont chargés avec des peptides HLA-A2 restreint efficacement l'expansion des CTL spécificité antigénique divers. Cette technologie offre un grand potentiel pour CTL à base d'immunothérapie adoptive.

HLA-Ig des cellules à base Antigène artificielle Présentation d&#39;Efficient Ex vivo Extension du CTL humaines

Découvrez l'ingénierie de cellules microgliales induites par le sang humain pour étudier l'inflammation cérébrale et les troubles neuropsychiatriques. Ce modèle cellulaire innovant permet d'évaluer la fonction microgliale dynamique chez l'humain.

Ingénierie de cellules microgliales induites par le sang humain pour la recherche sur le cerveau à traduction inverse

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