Name: Isolement de cellules souches mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical à haut rendement et à faible dommage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-05T14:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: Découvrez une technique de dissection par écrasement pour isoler le gel de Wharton intact du cordon ombilical. Cette méthode améliore le rendement et la viabilité des cellules souches mésenchymateuses pour la recherche en médecine régénérative.

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Ce travail a été soutenu financièrement par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82172107), la Fondation des sciences naturelles de la province du Guangdong, Chine (2021A1515011927, 2021A1515010918, 2020A1515110347), le Fonds de recherche médicale de Shenzhen (SMRF. D2301015), le Comité municipal d’innovation scientifique et technologique de Shenzhen (JCYJ20210324135014040, JCYJ20220530172807016, JCYJ20230807150908018, JCYJ20230807150915031) et le Fonds spécial du district de Longgang pour le développement économique et technologique (LGKCYLWS2022007).

Des échantillons ont été prélevés auprès de donneurs consentants et en bonne santé de l’hôpital de maternité et de santé infantile du district de Shenzhen Longgang, dans le Guangdong, en Chine. L’utilisation d’échantillons humains pour l’étude a été approuvée par le comité d’éthique de l’hôpital de Shenzhen, de l’Université de médecine chinoise de Pékin (SZLDH2020LSYM-095) et le comité d’éthique médicale de l’hôpital de maternité et de santé infantile du district de Shenzhen Longgang (LGFYYXLLS-2020-005). Toutes les expériences ont été menées conformément aux directives approuvées. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisé sont répertoriés dans la table des matériaux.
1. Prélèvement du cordon ombilical humain
<ol><li>Obtenir des échantillons de cordon ombilical humain de l’hôpital coopératif dans des conditions stériles. REMARQUE : Choisissez un donneur de moins de 35 ans, de préférence un primipare, sans antécédents d’hépatite, de maladies sexuellement transmissibles ou de troubles génétiques. Les résultats de l’examen d’admission pour le virus de l’hépatite B, le virus de l’hépatite C et le cytomégalovirus doivent être négatifs. Choisissez la césarienne comme mode d’accouchement.</li>
	<li>Sélectionnez un morceau droit et intact de UC d’environ 10 à 15 cm de longueur.</li>
	<li>Fermez les deux extrémités avec une pince hémostatique et ligaturez avec des nœuds chirurgicaux à l’extrémité intérieure entre les pinces juste après l’accouchement d’un nouveau-né à terme par césarienne. (CU collecté comme le montre la figure 1, étape 1). REMARQUE : Le fonctionnement de la césarienne garantit que le prélèvement est stérile. Utilisez des nœuds chirurgicaux de taille 0 ou 2-0 pour une meilleure résistance à la traction.</li>
	<li>Coupez le cordon ombilical attaché entre la pince et les nœuds à l’aide de ciseaux chirurgicaux (Figure 1, étape 1).</li>
	<li>Rincez-le avec une solution saline pour éliminer tous les caillots sanguins contaminants à la surface et transférez-le rapidement dans un tube en plastique stérile de 50 ml contenant 20 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile. REMARQUE : Aucun antibiotique n’a été utilisé pendant le transfert.</li>
	<li>Scellez le tube. Placez-le sur de la glace dans une boîte en polystyrène et stockez-le à 4 °C avant de le transporter au laboratoire. REMARQUE : Disséquez le cordon dans les 4 heures suivant le prélèvement.</li>
</ol>2. Isolement de la gelée de Wharton du cordon ombilical
<ol><li>Traitez le cordon ombilical en suivant les étapes ci-dessous :<ol><li>Préparez un plateau stérilisé avec des instruments chirurgicaux, des boîtes de 90 mm emballées de manière aseptique, des pipettes de 1000 μL, du PBS stérile, une solution d’éthanol à 75 % et un milieu de culture de CSM humaine sans xéno. REMARQUE : Les pinces dentées et les pinces anti-moustiques permettent de traiter efficacement le cordon ondulant.</li>
		<li>Décontaminer la surface des articles requis et la zone de travail avant de les placer dans l’enceinte de sécurité biologique. REMARQUE : Laissez l’air de la zone de travail se purger pendant quelques minutes avant de commencer le travail.</li>
		<li>Désinfectez la surface du tube et retirez l’échantillon dans une boîte de Pétri dans l’enceinte de biosécurité. Immergez l’échantillon avec les nœuds dans de l’éthanol à 75 % pendant 30 secondes, puis rincez-le plusieurs fois avec du PBS stérile dans une nouvelle boîte de Pétri. REMARQUE : Le cordon doit être ligaturé avant d’être immergé dans de l’éthanol à 75%, et le temps d’immersion doit être limité à 30 s à 1 min pour désinfecter complètement le cordon sans l’endommager.</li>
		<li>Coupez les nœuds et coupez le cordon entre deux nœuds transversalement en petits morceaux d’environ 2 cm de long avec des ciseaux chirurgicaux et des pinces. REMARQUE : Les extrémités du cordon avec des nœuds doivent être jetées. La longueur de la CU ne doit être ni trop longue ni trop courte ; Les deux conditions peuvent augmenter la difficulté de l’opération.</li>
		<li>Perfuser la veine (vaisseau plus gros) avec du PBS à l’aide de pipettes de 1000 μL jusqu’à ce que le liquide sortant de l’autre extrémité du cordon devienne complètement transparent19.</li>
	</ol></li>
	<li>Disséquez le cordon ombilical.<ol><li>Transférez l’un des morceaux déjà coupés dans une nouvelle boîte de Pétri. REMARQUE : Deux artères et une veine doivent être exposées de manière visible sur la coupe transversale8 (Figure 2B).</li>
		<li>Ajoutez la quantité appropriée de PBS pour garder le cordon mouillé tout au long de l’opération.</li>
		<li>Saisissez le cordon à l’aide d’une pince et tirez les artères le long de son grand axe à l’aide de pinces anti-moustiques. REMARQUE : Essayez de tirer de l’autre extrémité du cordon si l’artère a été arrachée, car la paroi de l’artère a une grande élasticité.</li>
		<li>Fixez le cordon horizontalement avec le côté le plus épais vers le haut en insérant une lame de la pince dans la veine ombilicale, puis en serrant fermement, en veillant à ce que la pince se bloque du côté le plus épais.</li>
		<li>Faites une incision linéaire sur la couche de l’épithélium amniotique d’une extrémité à l’autre le long du bord de l’autre lame de la pince à l’aide d’un scalpel (Figure 3). REMARQUE : Préservez l’intégrité de la gelée de Wharton en coupant le moins de WJ possible.</li>
		<li>Commencez par un coin de l’espace de coupe. Soulevez le coin de l’épithélium amniotique à l’aide de pinces dentées et continuez à couper horizontalement un peu plus loin avec des ciseaux cornéens le long de la surface interne de l’épithélium.<ol><li>Séparez la gelée de Wharton et l’épithélium amniotique à l’aide de pinces et étendez-vous progressivement à l’ensemble du cercle d’une extrémité de la CU. Décollez la couche épithéliale dans le sens de la longueur (Figure 3). REMARQUE : La gelée de Wharton est un tissu conjonctif muqueux entouré par l’épithélium amniotique dense8. L’ensemble de l’opération devrait se dérouler sans heurts, mais des pinces anti-moustiques pourraient être utilisées pour la dissection émoussée si l’on rencontre des difficultés lors de l’épluchage.</li>
		</ol></li>
		<li>Insérez les deux lames de la pince à l’intérieur de la veine, clampez une partie de WJ, puis retournez-la pour exposer l’épithélium de la veine ombilicale (Figure 3).</li>
		<li>Décollez facilement l’épithélium de la veine, car la tension interne crée une séparation entre l’épithélium de la veine et le WJ périvasculaire (Figure 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Disséquer la CU à l’aide de la méthode conventionnellede comparaison 20.<ol><li>Choisissez un autre échantillon déjà coupé et presque du même poids que le cordon précédent et transférez-le dans une nouvelle boîte de Pétri.</li>
		<li>Coupez le long de la veine ombilicale longitudinalement avec des ciseaux et étalez le CU pour exposer les vaisseaux et WJ.</li>
		<li>Retirez la veine ombilicale et deux artères, et dégagez le WJ de la couche endothéliale avec des ciseaux et un scalpel.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Isolement et culture des UC-MSCs
<ol><li>Placez le WJ collecté dans une boîte de Pétri de 90 mm pré-étiquetée et coupez-le en morceaux de 1 à 3 mm avec des ciseaux et des pinces.</li>
	<li>Retournez le plat avec le capuchon sur le fond et placez-le dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C pendant 30 min pour renforcer la fixation entre les morceaux et la surface en plastique.</li>
	<li>Retournez le plat et ajoutez doucement une quantité appropriée de milieu de culture MSC humain pour une culture ultérieure. REMARQUE : Utilisez la vitesse la plus basse pour vous assurer que les pièces sont toujours attachées.</li>
	<li>Changer le milieu de culture MSC humain tous les 3 jours. Échangez les deux tiers du milieu et observez l’apparition d’une excroissance des cellules fibreuses tous les 2 jours pendant les 7 premiers jours, changez le milieu complet et observez-le quotidiennement par la suite. REMARQUE : Évitez de déplacer la boîte de Pétri pendant les 7 premiers jours. L’excroissance distinguée de cellules semblables à des fibroblastes a été observée en 4 jours environ.</li>
	<li>Sous-culture jusqu’à ce que la confluence atteigne 80%. REMARQUE : Cette étape prend 7 à 10 jours.<ol><li>Préchauffer le PBS, la trypsine à 0,25 % et le milieu de culture de CSM humaines sans xéno à 37 °C dans un bain-marie.</li>
		<li>Rincer avec du PBS après avoir aspiré le surnageant avec des pipettes, et détacher les cellules avec de la trypsine préchauffée à 0,25 % jusqu’à ce qu’elles puissent être délogées en tapotant la boîte de Pétri.</li>
		<li>Inactiver la trypsine en mélangeant le milieu de culture MSC préchauffé dans un rapport de 4:1, recueillir la suspension cellulaire et centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. REMARQUE : Ces cellules sont considérées comme le passage 0 (P0).</li>
		<li>Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette, remettre les cellules en suspension dans le milieu de culture humain des CSM et inoculer dans de nouvelles boîtes de Pétri à une densité d’ensemencement de 1 x 104 cellules/cm2 pour la propagation.</li>
	</ol></li>
	<li>À l’aide d’un hémocytomètre, comptez le nombre total de cellules des deux méthodes après amplification au premier, deuxième et troisième passage. Déterminez la morphologie cellulaire au microscope dans les premier, troisième et cinquième passages. REMARQUE : La morphologie de ces cellules doit être similaire à celle des cellules P0.</li>
	<li>Utilisez des cellules au cinquième passage pour la cytométrie en flux et d’autres expériences.</li>
</ol>4. Expression de marqueurs de surface cellulaire par cytométrie en flux
<ol><li>Détachez les cellules de passage 5 (P5) avec de la trypsine à 0,25 %, lavez les cellules avec un tampon de coloration cellulaire et centrifugez-les à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Remettre les pastilles en suspension avec un tampon de coloration cellulaire à 100 μL chacune.</li>
	<li>Étiquetez chaque tube et ajoutez les quantités appropriées d’anticorps, qui ont été conjugués avec de l’allophycocyanine (APC), de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ou de la phycoérythrine (PE) : CD44-APC, CD73-APC, CD90-FIFC, CD105-FIFC, CD11B-PE, CD19-PE, CD43-PE, HLA-DR-PE en suivant les instructions du fabricant21. Incuber pendant 15-20 min dans l’obscurité à température ambiante.</li>
	<li>Centrifuger les cellules colorées à 300 x g pendant 5 min à 4 °C, aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette et laver une fois avec un tampon de coloration cellulaire.</li>
	<li>Répétez la centrifugation et la remise en suspension des cellules avec 300 μL de tampon de coloration cellulaire.</li>
	<li>Faites passer les cellules dans le cytomètre en flux et analysez les cellules colorées par des anticorps selon les instructions du fabricant.</li>
</ol>5. Détermination de la courbe de croissance cellulaire par la méthode de comptage cellulaire
<ol><li>Préparez une suspension unicellulaire de cellules P5 en utilisant deux méthodes en les diluant dans un milieu de culture MSC humain.</li>
	<li>Ensemencez 8 000 cellules par puits dans une plaque de 24 puits, avec un total de 21 puits de chaque méthode ensemencés. REMARQUE : Mélangez doucement les cellules en soufflant et en aspirant avec des pipettes avant l’ensemencement.</li>
	<li>Récoltez les cellules de trois puits après 24 h de semis. Effectuez le comptage des cellules à l’aide d’un hémocytomètre pour calculer la valeur moyenne. REMARQUE : Secouez la plaque avant de compter les cellules. La durée de l’agitation peut être prolongée pour éviter la formation d’agrégats cellulaires.</li>
	<li>Répétez le comptage cellulaire toutes les 24 heures pendant une durée totale de 7 jours. Tracez une courbe de croissance en utilisant le temps (d) sur l’axe des X et le nombre de cellules (x104/mL) sur l’axe des Y.</li>
</ol>

Dissection et isolement des CSM-WJ du cordon ombilical humain

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</ol>

Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts.

Les CSM représentent un domaine de recherche dynamique qui a de profondes implications pour la médecine régénérative22. Leurs propriétés uniques en font un point central pour la recherche scientifique et ont le potentiel de révolutionner le traitement d’un large éventail de maladies et de blessures7. Les CSM-WJ sont un sous-ensemble distinct des CSM, qui peuvent être obtenues à partir du tissu conjonctif gélatineux au sein de la CU situé entre l’épithélium intervasculaire et amniotique23. L’application clinique des CSM réside dans l’obtention d’un nombre suffisant de cellules24. Cependant, à mesure que le nombre de passages augmentait, les cellules commençaient à présenter un certain phénomène de vieillissement, et la capacité proliférative des CSM diminuait progressivement après P524. Il est donc impératif d’optimiser les méthodes pour améliorer le rendement des CSM.
Le moyen le plus efficace d’isoler les WJ-MSC est de disséquer l’ensemble du WJ tout en préservant son intégrité6. Les recherches montrent que ces cellules frontalières des régions frontalières du cordon ombilical ont une caractéristique de migration plus élevée et un taux de prolifération plus élevé que les WJ-MSCs intervasculaires23. Cependant, les régions et les méthodes de dissection de WJ n’ont pas été normalisées, et il n’est pas clair si les populations de cellules souches au sein des WJ-MSCs partagent les mêmes qualités en raison de l’absence de limites histologiques claires entre les partitions3. 
Des études antérieures ont indiqué des différences significatives dans les propriétés des WJ-MSC dérivées de divers compartiments du cordon ombilical, les cellules situées près de la surface amniotique présentant une capacité de prolifération accrue3. La méthode unique actuelle de dissection de la colite ulcéreuse et d’isolement des WJ-MSC vise à réduire à la fois la perte de la muqueuse WJ et les dommages cellulaires, ce qui améliore le rendement et la viabilité des cellules. Ce protocole démontre une méthode qui a facilité le traitement de la CU en WJ presque intact. La première étape du protocole consiste à enlever la couche épithéliale par pelage et dissection émoussée. L’étape d’innovation consiste à décoller la couche épithéliale dans le sens de la longueur à l’aide de pinces anti-moustiques. Cette approche est efficace pour réduire les dommages aux cellules adjacentes causés par la dissection tranchante conventionnelle avec des ciseaux25. 
L’endothélium de la veine est fragile et difficile à éliminer. Après avoir retiré l’épithélium amniotique de la veine ombilicale, le cordon ombilical est retourné à travers la veine pour exposer l’endothélium. La tension interne créée par le WJ est ensuite utilisée pour décoller l’endothélium de la veine, minimisant ainsi l’interférence des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) pendant les processus de culture cellulaire ultérieurs.
La méthode de culture par explant est adoptée car elle a un rendement plus élevé par rapport aux autres méthodes disponibles18. Les cellules non attachées seront progressivement éliminées par l’échange du milieu de culture humain MSC, entraînant la perte de cellules26. Les explants qui n’adhèrent pas au plastique pourraient entraver la croissance cellulaire dans l’expérience précédente. L’impact de la vapeur d’eau dégagée par les tissus en raison des changements entre les températures intérieure et extérieure de l’incubateur doit être pris en compte. Pour maintenir l’état sec de la boîte de Pétri, une étape innovante consistant à retourner la boîte pendant 30 minutes pendant l’incubation avec le couvercle sur le fond a été mise en œuvre. Cette inversion d’une boîte a permis d’éviter la condensation de la vapeur d’eau au contact entre les tissus et la surface de la boîte de Pétri, ce qui permet une meilleure fixation des exosomes à la surface plastique pour améliorer la croissance cellulaire. 
La méthode actuelle est comparée à la méthode de dissection conventionnelle en mesurant le pourcentage en poids du WJ obtenu et la quantité de CSM cultivées et passées ; un rendement significativement plus élevé de WJ et une quantité supplémentaire de MSC récoltées ont été mis en évidence par la nouvelle méthode. Bien que tout protocole visant à isoler des populations de cellules souches de chacun de ces compartiments comporte un risque de contamination cellulaire à partir des autres compartiments, les résultats ont démontré la pureté des CSM isolées, caractérisées par une expression élevée de marqueurs mésenchymateux (tous supérieurs à 99 %) et une détection minimale des marqueurs hématopoïétiques et endothéliales (données non présentées). Les résultats ont prouvé que les WJ-MSC sont pures et adaptées à diverses applications, conformément aux directivesISCT 21. Les CSM en culture ont présenté des cellules semblables à des fibroblastes sur une courte période, et les cellules se sont de plus en plus formées en cellules en forme de vortex, affichant un grand potentiel prolifératif et des propriétés migratoires. 
Le protocole décrit dans cette étude présente plusieurs lacunes. Tout d’abord, la compétence requise pour l’opérateur est élevée, comme l’indique la séparation de l’épithélium amniotique. Cela peut entraver son adoption généralisée dans la recherche ou les applications cliniques. Deuxièmement, le protocole repose fortement sur la manipulation manuelle pendant la dissection, ce qui peut introduire des incohérences entre les expériences ou les opérateurs. La normalisation du processus de dissection améliorerait la fiabilité et la reproductibilité du protocole25. De plus, l’absence d’autres comparaisons avec la méthode conventionnelle laisse des questions sans réponse.
En conclusion, la méthode actuelle offre un moyen efficace de séparer le WJ intact de l’épithélium et des vaisseaux amniotiques, ce qui permet d’obtenir une récolte qui comprend la gelée de Wharton périvasculaire et sous-amniotique. L’introduction d’une étape d’incubation inversée contribue davantage à une meilleure fixation des CSM. L’analyse comparative avec les méthodes traditionnelles démontre les avantages significatifs du protocole proposé en termes d’obtention d’un rendement plus élevé en WJ et de récolte d’un plus grand nombre de CSM ayant une meilleure capacité de prolifération. Les résultats mettent également en évidence la pureté des CSM isolées, comme l’indique un modèle distinct d’expression des marqueurs de surface cellulaire. Cette méthode pourrait améliorer le rendement et la capacité de prolifération des MSC, offrant une méthode rentable pour augmenter la production de MSC.

Depuis le premier isolement de cellules souches mésenchymateuses (CSM) à partir de gelée de Wharton (WJ) en 1991, ces cellules souches multipotentes ont attiré l’attention des chercheurs en raison de leurs propriétés régénératrices et de leur capacité de différenciation multilignée1. Les CSM peuvent être isolées à partir de diverses sources, notamment la moelle osseuse, le sang périphérique, la pulpe dentaire, le tissu adipeux, le fœtus (avortement humain) et les tissus liés à l’accouchement2. Le cordon ombilical (CU) est apparu comme un réservoir prometteur en raison de sa nature non invasive, de son rendement cellulaire abondant et de sa capacité de différenciation, présentant un taux élevé de prolifération, un potentiel de différenciation et des propriétés de modulation immunitaire3. Les CSM fœtales présentent de fortes propriétés souches et immunitaires, ce qui en fait le principal centre d’intérêt des essais cliniques et de la recherche fondamentale menés au cours des deux dernières décennies 2,4,5. Les CSM dérivées de la CU ont un potentiel thérapeutique supérieur à celui d’autres sources de CSM, telles que la moelle osseuse ou le tissu adipeux 6,7.
La CU est composée d’un épithélium amniotique, de trois vaisseaux (deux artères et une veine) et de la substance gélatineuse connue sous le nom de WJ3. Curieusement, la CU constitue un système vasculaire simple, composé uniquement de l’endothélium et du mésothélium, mais pas de la tunique adventice ; le WJ ne contient ni lymphe ni nerfs8. L’UC présente une structure unique idéale pour la séparation segmentaire. Les UC-MSC sont principalement situés dans le WJ. Les CSM ont pu être isolées à partir de différents compartiments du WJ, y compris l’amnion, le subamnion (l’amnion et le subamnion également désignés comme région de la muqueuse du cordon) et la zone périvasculaire du WJ8. Chaque région du WJ a sa propre structure, ses caractéristiques immunohistochimiques et sa fonction 3,6.
Les CSM isolées du WJ de l’UC sont largement considérées comme ayant une utilité clinique supérieure à celles d’autres régions3. Les WJ-MSCs ont été largement étudiées dans des contextes précliniques et cliniques pour le traitement de diverses maladies en raison de leur potentiel de différenciation multiligne, de leurs propriétés immunomodulatrices, de leurs effets paracrines, de leurs effets anti-inflammatoires et de leurs propriétés immunitairesprivilégiées 2,3. Il a été prouvé que les WJ-MSC sont prometteurs dans le traitement d’une gamme de maladies, notamment la maladie du greffon contre l’hôte (GvHD), le rejet de greffe, la maladie de Crohn, les maladies auto-immunes et les maladies cardiovasculaires 9,10,11,12,13,14. Alors que la demande clinique de CSM-WJ continue d’augmenter, la pénurie de cordons ombilicaux est actuellement un obstacle à leurs applications généralisées.
Le rendement des WJ-MSC dépend de la méthode utilisée pour l’extraction cellulaire15. Alors que les WJ-MSCs peuvent être isolées par culture d’explants ou digestion enzymatique, cette dernière méthode a un temps de propagation plus long qui peut augmenter le risque de dommages cellulaires et diminuer la viabilité cellulaire16. Cependant, de nombreuses études ont montré que la méthode de culture d’explants augmente les rendements cellulaires et la viabilité, et que les facteurs paracrines libérés par les tissus d’explant contribuent également à favoriser la prolifération cellulaire17,18.
Cette étude a appliqué une approche de dissection unique pour obtenir des WJ entiers, produisant des CSM avec une capacité de prolifération, une viabilité et une quantité accrues, tout en minimisant les dommages au WJ. Cette méthode innovante offre une stratégie rationalisée pour isoler les WJ-MSC, répondant ainsi aux besoins critiques des applications MSC.

<table><tbody><tr><td>Anticorps anti-CD44 humain APC&nbsp ;</td><td>Biolegend&nbsp ;</td><td></td><td></td>338806</tr><tr><td>plaques de culture cellulaire à 24 puits</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-humain CD73 (Ecto-5'-nucléotidase) Anticorps&nbsp ;</td><td>Biolegend&nbsp ;</td><td></td><td></td>344006</tr><tr><td>souris APC IgG1, &kappa ; Biologie de l’anticorps de l’isotype Ctrl (FC)</td><td>&nbsp ;</td><td></td><td></td>400122</tr><tr><td>Autoclave</td><td>HIRAYAMA</td><td>HVE-50</td><td></td></tr><tr><td>Compteur de cellules automatique</td><td>Countstar</td><td>FL-CD</td><td></td></tr><tr><td>BAMBANKER Solution de cryoconservation</td><td>Wako</td><td>302-14681</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de coloration cellulaire</td><td>Biolegend&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Machine centrifuge</td> 420201 <td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Banc propre</td><td>Shanghai ZhiCheng</td><td>C1112B</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubateur</td><td>Thermo Scientific</td><td>HERAcell 150i</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Solarbio</td><td>D1040</td><td></td></tr><tr><td>Four de sablage électro-thermostatique</td><td>Shanghai JingHong</td><td>DHG-9423A</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD105 humain FITC&nbsp ;</td><td>Biolegend&nbsp ;</td><td></td><td></td>323204</tr><tr><td>Anticorps anti-CD90 (Thy1) humain FITC&nbsp ;</td><td>Biolegend&nbsp ;</td><td></td><td></td>328108</tr><tr><td>FITC souris IgG1, &kappa ; Biologie de l’anticorps de l’isotype Ctrl (FC)</td><td>&nbsp ;</td><td>400110</td><td></td></tr><tr><td>Cytométrie en flux</td><td>Beckman</td><td>CytoFLEX</td><td></td></tr><tr><td>hémocytomètre</td><td>supérieur Marienfeld</td><td>640410</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lavage de perméabilisation de coloration intracellulaire (10&times ;)&nbsp ;</td><td>Biolegend&nbsp ;</td><td></td><td></td>421002</tr><tr><td>Microscope biologique inversé</td><td>ZEISS</td><td>Axio Vert. A1</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir de stockage d’azote liquide</td><td>Thermo Scientific</td><td>CY50935-70</td><td></td></tr><tr><td>Saline normale (NS)</td><td>Meilunbio</td><td>MA0083</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1032</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-humain CD11b</td><td>Anticorps Biolegend&nbsp ;</td><td></td><td></td>393112</tr><tr><td>Anticorps CD19 humain contre l’EP</td><td>Biolegend&nbsp ;</td><td></td><td></td>392506</tr><tr><td>PE anti-anticorps CD34 humain</td><td>Biolegend&nbsp ;</td><td></td><td></td>343606</tr><tr><td>PE anti-anticorps CD45 humain</td><td>Biolegend&nbsp ;</td><td>368510</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-HLA-DR humain PE&nbsp ;</td><td>Biolegend&nbsp ;</td><td></td><td></td>307606</tr><tr><td>Souris PE IgG1, &kappa ; Biologie de l’anticorps de l’isotype Ctrl (FC)</td><td>&nbsp ;</td><td></td><td></td>400114</tr><tr><td>Souris PE IgG2a, &kappa ; Biologie de l’anticorps de l’isotype Ctrl (FC)</td><td>&nbsp ;</td><td></td><td></td>400214</tr><tr><td>Balance électronique de précision</td><td>Satorius</td><td>PRACTUM313-1C</td><td></td></tr><tr><td>MACHINE À GLACE FLOCON DE NEIGE</td><td>ZIEGRA</td><td>ZBE 30-10</td><td></td></tr><tr><td>stérilisé 50 mL tube en plastique</td><td>Greniner</td><td>227270</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie thermostatique</td><td>Shanghai YiHeng</td><td>HWS12</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 1:250</td><td>Solarbio</td><td>T8150</td><td></td></tr><tr><td>UltraGRO-Advanced</td><td>Helios·</td><td></td><td></td>HPCFDCGL50</tr><tr><td>Système de purification d’eau ultra-pure et pure</td><td>Milli-Q</td><td>Référence</td><td></td>Milli-Q</tr><tr><td>Milieu de culture MSC humain sans xéno</td><td>FUKOKU&nbsp ;</td><td></td><td></td>T2011301</tr></tbody></table>

isolement de cellules souches mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical à haut rendement et à faible dommage

Isolation of Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells with High Yields and Low Damage

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont une population de cellules multipotentes dotées de propriétés régénératives et immunomodulatrices remarquables. La gelée de Wharton (WJ) du cordon ombilical (UC) a suscité un intérêt croissant dans le domaine biomédical en tant que source exceptionnelle de CSM. Cependant, des défis tels que l’approvisionnement limité et le manque de normalisation des méthodes existantes sont apparus. Cet article présente une nouvelle méthode pour améliorer le rendement des CSM en disséquant le WJ intact du cordon ombilical. La méthode utilise la dissection émoussée pour enlever la couche épithéliale, ce qui permet de maintenir l’intégrité de l’ensemble du WJ et d’augmenter la quantité et la viabilité des CSM récoltées. Cette approche réduit considérablement les déchets de WJ par rapport aux méthodes conventionnelles de dissection tranchante. Pour garantir la pureté des WJ-MSC et minimiser l’influence cellulaire externe, une procédure utilisant la tension interne pour décoller l’endothélium après avoir retourné la CU a été effectuée. De plus, la boîte de Pétri a été inversée pendant une courte période pendant la culture d’explants pour améliorer l’attachement et la croissance cellulaire. L’analyse comparative a démontré la supériorité de la méthode proposée, montrant un rendement plus élevé des WJ et des WJ-MSC avec une meilleure viabilité que les méthodes traditionnelles. La morphologie et le modèle d’expression similaires des marqueurs de surface cellulaire dans les deux méthodes confirment leur caractérisation et leur pureté pour diverses applications. Cette méthode fournit une approche à haut rendement et à haute viabilité pour l’isolement des CSM-WJ, démontrant un grand potentiel pour l’application clinique des CSM.

Les procédures de collecte et d’élevage des UC-MSC, ainsi que leur analyse ultérieure, sont résumées à la figure 1. L’UC a été soigneusement disséqué en plusieurs sections à l’aide de la méthode unique ; le schéma de fonctionnement spécifique des procédures principales est illustré à la figure 2. La croissance des cellules des cultures d’explants a été régulièrement surveillée et enregistrée. Des cellules adhérentes en forme de fuseau ont été observées environ 4 jours après la culture des explants et ont rampé de plus en plus dans une forme de vortex. Ces cellules ont également été identifiées comme P0 et ont continué à proliférer pour le passage ultérieur tout en maintenant une taille et une morphologie uniformes pendant la prolifération et le passage. Les méthodes conventionnelles et actuelles ont montré des différences négligeables en termes de taille et de morphologie des cellules (Figure 3).
La méthode de dissection conventionnelle consiste à gratter le WJ des vaisseaux sanguins et de l’épithélium interne de la CU. Le rendement WJ représentait une différence significative entre les deux méthodes en termes d’ajustement du poids. Le rendement du WJ peut être calculé en mesurant le pourcentage de poids du WJ dans le cordon de 2 cm (2,4 g ± 0,2 g). Une comparaison du rapport du rendement du WJ entre les méthodes actuelles et traditionnelles a montré une augmentation significative du rendement du WJ en utilisant la nouvelle approche (Figure 4A). Une analyse plus poussée en comptant la quantité totale de WJ-MSC récoltée par les deux méthodes à partir du poids équivalent de CU a montré un écart prononcé dans la quantité de cellules avec l’augmentation du nombre de passages (Figure 4B). La courbe de croissance a indiqué que le taux de prolifération des CSM dans la nouvelle méthode était significativement plus élevé que dans la méthode conventionnelle avec la même densité d’inoculation après 2 jours (figure 4C). Ces expériences démontrent les avantages de la méthode actuelle, qui permet d’augmenter efficacement l’approvisionnement en même matériau.
Conformément aux critères minimaux de la directive de l’International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) pour la définition des CSM, l’immunophénotype des CSM présente une expression positive de CD105, CD44, CD90, CD73 (plus de 95%), tout en étant absent de CD45, CD19, CD34, CD11b et HLA-DR (moins de 2%)22. Les CSM dérivées de WJ ont été étudiées par cytométrie en flux quantitative (Figure 5) ; les cellules isolées par les deux méthodes étaient très positives pour les antigènes de surface CD105, CD44, CD90 et CD73 (tous au-dessus de 99%), l’expression des molécules de surface CD45, CD19, CD34, CD11b et HLA-DR étant exprimée en dessous des niveaux détectables (données non présentées). D’après les résultats des marqueurs de surface cellulaire, les cellules adhérentes peuvent être considérées avec précision comme des CSM, et leur identification et leur pureté peuvent être assurées.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66835/66835fig01.jpg"> Figure 1 : Représentation schématique de la dissection et de l’isolement des WJ-MSCs du cordon ombilical. Étape 1 : L’échantillon de cordon ombilical humain est prélevé sur le nouveau-né et rincé avec une solution saline, suivi d’une perfusion de la veine. Le cordon est ensuite coupé en morceaux de 2 cm. Étape 2 : La gelée de Wharton pure (WJ) est obtenue en utilisant la méthode actuelle, impliquant la séparation des artères, de l’épithélium amniotique et de l’épithélium veineux. La méthode traditionnelle est également utilisée à des fins de comparaison. Le cordon ombilical est disséqué en conséquence. Étape 3 : Le WJ disséqué est coupé en morceaux de 1 à 3 mm, et le plat est placé à l’envers dans l’incubateur pendant 30 minutes pour renforcer la fixation entre les morceaux et la surface en plastique. Les morceaux de WJ sont ensuite cultivés et passés à une densité d’ensemencement de 1 x 104 cellules/cm2 jusqu’à atteindre 80% de confluence. Étape 4 : La cytométrie en flux est utilisée pour caractériser les cellules P5 en analysant les marqueurs de surface des cellules souches mésenchymateuses (CSM). Étape 5 : La capacité de prolifération des cellules est déterminée en traçant une courbe de croissance cellulaire à l’aide de la méthode de comptage cellulaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66835/66835fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66835/66835fig02.jpg"> Figure 2 : Anatomie du cordon ombilical et démonstration schématique de la dissection. (A) La coupe transversale de la CU, mettant en évidence les artères (A), la veine (V), la gelée de Wharton (WJ), et la dissection ultérieure sépare la CU en différents compartiments. (B) Démonstration schématique de l’ablation de la couche épithéliale amniotique. L’incision est pratiquée le long de la ligne pointillée sur l’épithélium amniotique, séparant l’épithélium en commençant par le coin latéral du cordon. (C) Démonstration schématique de l’ablation de l’épithélium veineux. Le retournement du cordon (la direction de la flèche indique la direction de la force) expose l’épithélium veineux pour l’ablation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66835/66835fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66835/66835fig03.jpg"> Figure 3 : Caractéristiques morphologiques des WJ-MSC primaires cultivées et passées. Une croissance distincte des cellules fibroblastoïdes à partir des explants peut être observée vers le jour 4 (indiquée par les flèches) et présentait de plus en plus un modèle de croissance semblable à un vortex. Les explants ont été retirés et sous-cultivés ; Les cellules isolées étaient homogènes en ce qui concerne la taille et la morphologie visualisées. Une différence insignifiante a été observée dans la taille et la morphologie des cellules entre les deux méthodes. Barre d’échelle : 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66835/66835fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66835/66835fig04.jpg"> Figure 4 : Analyse comparative graphique du rendement des WJ et des caractéristiques de croissance des CSM cultivées. (A) Comparaison du rendement en WJ à l’aide d’un UC de 2 cm avec un poids initial de 2,4 g ± 0,2 g par les deux méthodes. Rendement WJ = (poids de WJ) / (poids initial du cordon non traité. Rapport du rendement WJ (%) = (rendement WJ) / (rendement WJ moyen de la méthode actuelle) × 100. (B) Comparaison du comptage cellulaire après culture et du passage dans les mêmes conditions par les deux méthodes. (C) Courbes de croissance des cellules P5 dans les deux méthodes. Toutes les expériences comprenaient trois répétitions biologiques, et les différences statistiques ont été analysées par la méthode ANOVA à deux facteurs (***p &lt; 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66835/66835fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66835/66835fig05.jpg"> Figure 5 : Expression de surface cellulaire des CSM analysées par cytométrie en flux. Les cellules P5 collectées par les méthodes conventionnelles et actuelles sont soumises à une analyse par cytométrie en flux. Les antigènes de surface CD44, CD105, CD90 et CD73 étaient très positifs (tous au-dessus de 99 %), tandis que les expressions des molécules de surface CD45, CD19, CD34, CD11b et HLA-DR étaient inférieures à la limite de détection. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66835/66835fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Cette étude présente une procédure unique de dissection contondante pour préserver l’intégrité de la gelée de Wharton (WJ), ce qui permet d’obtenir moins de WJ endommagés et une plus grande quantité et viabilité des cellules souches mésenchymateuses (CSM) récoltées. La méthode démontre un rendement et une capacité de prolifération supérieurs par rapport aux méthodes conventionnelles de dissection tranchante.

Isolement de cellules souches mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical à haut rendement et à faible dommage

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells with remarkable regenerative and immunomodulatory properties. Wharton's jelly (WJ) ...

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