Isolement par cytométrie en flux et évaluation thérapeutique de lymphocytes infiltrant la tumeur dans un modèle murin de cancer du pancréas

Nous nous concentrons sur le développement d’une méthode d’isolement et de transfert adoptif de lymphocytes infiltrant la tumeur, les TIL, dans un modèle de cancer du pancréas. Nous essayons de répondre à la question de savoir si les sous-ensembles de TIL peuvent cibler et tuer efficacement les tumeurs pancréatiques in vivo et comment les lymphocytes T peuvent être optimisés pour de futurs essais cliniques. Les développements récents dans le domaine de la thérapie cellulaire adoptive, y compris l’amélioration des techniques d’isolement et d’expression de TIL, la modification douce des TIL pour améliorer leur ciblage et la combinaison de la thérapie TIL avec d’autres immunothérapies comme les inhibiteurs de point de contrôle ou les thérapies ciblées pour une efficacité antitumorale accrue.

Nous avons établi une méthode robuste pour isoler et étendre les TIL réactifs à la tumeur à partir d’un modèle murin de cancer du pancréas. Nous avons démontré une efficacité antitumorale accrue des lymphocytes T réactifs aux tumeurs transférés par adoption. Notre protocole offre une approche plus ciblée de la thérapie cellulaire adoptive en permettant l’isolement et la sélection de TIL spécifiques à la tumeur par rapport à d’autres méthodes moins spécifiques.

Il utilise également l’imagerie bioluminescente pour la surveillance non invasive des tumeurs. Nos résultats feront progresser le domaine en fournissant un modèle préclinique standardisé pour évaluer l’efficacité du traitement TIL et optimiser les paramètres de traitement des sous-ensembles de cellules T pour le cancer du pancréas. Pour préparer une suspension de cellules KPC-Luciferase pour induire une tumeur pancréatique orthotopique chez la souris, essayez de tester la lignée cellulaire KPC-Luciférase pendant une minute à 37 degrés Celsius.

Après la trypsinisation, ajoutez du PBS, transférez les cellules, puis centrifugez la suspension cellulaire. Comptez les cellules et mettez-les en suspension à une concentration de 1 fois 10 à la puissance 6 cellules par millilitre dans du PBS contenant 30 % de matrice de membrane basale. Placez la souris anesthésiée sur une plate-forme d’opération.

Après avoir fait une incision abdominale gauche de 0,5 à 1 centimètre, tenez la rate à l’aide d’une pince et exposez le pancréas. Après avoir préparé le mélange de cellules KPC-Luciférase et de matrice de membrane basale, injectez 50 microlitres de la suspension cellulaire contenant 50 000 cellules dans le pancréas à l’aide d’une aiguille de calibre 29. Remettez le pancréas dans la cavité abdominale.

Suturer séquentiellement le péritoine et la peau. Laissez la souris récupérer sur un coussin chaud jusqu’à ce qu’elle soit complètement réveillée. Après sept jours, injectez par voie intrapéritonéale à la souris 60 microlitres de solution de sel de potassium D-Luciférin pour l’imagerie en direct.

Après l’anesthésie, positionnez la souris dans le système d’imagerie in vivo pour la détection de la bioluminescence. Après l’imagerie, retirez la souris du système et laissez-la récupérer naturellement de l’anesthésie. Pour commencer, placez la souris euthanasiée du donneur sur une plate-forme de commande.

Stérilisez tout le corps avec de l’éthanol à 75 %. Dans une cagoule stérile, utilisez des ciseaux et des pinces pour ouvrir la cavité abdominale. Retirez la tumeur et placez-la dans du PBS sur de la glace.

Mesurez la taille de la tumeur avec un calibre Vernier. Ensuite, calculez le volume de la tumeur à l’aide de la formule à l’écran. Après avoir préparé la solution de digestion 1X à l’aide de la collagénase, de la dispase II et de la DNAse I dans RPMI 1640, ajoutez un à deux millilitres de la solution par puits dans une plaque à 12 puits.

Coupez les tumeurs en petits morceaux à l’aide de ciseaux. Transférez les morceaux de tumeur dans chaque puits d’une plaque à 12 puits et digérez-les à 37 degrés Celsius tout en agitant à 70 tr/min pendant 30 minutes. Pour terminer la digestion, ajoutez un à deux millilitres de sérum de veau fœtal à 10 % et transférez la suspension cellulaire dans un tube de prélèvement.

Lavez deux fois les puits d’une plaque de 12 puits avec du PBS pour recueillir les cellules restantes. Filtrez la suspension cellulaire à travers une passoire de cellules de 70 micromètres, émincez et écrasez les fragments de tissu pour libérer les cellules individuelles à l’aide de l’extrémité plate d’un piston de seringue. Centrifuger le filtrat à 400 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et remettre la pastille en suspension dans de l’albumine sérique bovine à 5 % pour la coloration par cytométrie en flux.

Pour commencer, placez les cellules isolées de la souris porteuse de la tumeur avec la rate ou les cellules mononucléées du sang périphérique de la souris non porteuse de tumeur sur une plate-forme de travail. Cellules tachatives avec bloqueurs de FC et anticorps de flux à une dilution de 1 à 100. Incuber les tubes sur de la glace dans l’obscurité pendant 30 minutes.

Après l’incubation, laver les cellules deux fois dans du PBS par centrifugation avant de les remettre en suspension dans 1 % d’albumine sérique bovine dans du PBS. Sur un cytomètre en flux, pour trier les cellules CD45+CD3+, les cellules vivantes de grille sont basées sur FSC-A et SSC-A pour créer la porte P1. Ensuite, créez des cellules uniques de porte à partir de P1 basées sur FSC-A et FSC-H pour créer la porte P2. Triez les cellules CD45+CD3+ de P2 à l’aide des portes CD45 et CD3. Collectez les cellules triées dans des tubes de collecte.

La centrifugeuse a trié les cellules CD45+CD3+ à 400 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Remettez en suspension les cellules dans du sérum de souris à une concentration de 1 fois 10 à la puissance 6 cellules par millilitre, et placez-les sur de la glace. Placez la souris receveuse induite par la tumeur sur une plate-forme d’exploitation.

À l’aide d’une seringue à insuline de calibre 29 de 1/2 pouce, injectez par voie intrapéritonéale les cellules immunitaires triées. Ensuite, administrez l’interleukine-2 par voie intrapéritonéale pendant trois jours consécutifs.