Système microphysiologique cardiaque pour l’étude de la propagation du Ca²⁺ par stimulation optique non génétique

La recherche vise à faire progresser les modèles microphysiologiques cardiaques in vitro en intégrant des méthodes de photostimulation à base de matériaux. Il se concentre sur le dépassement des limites de longévité et de stimulation invasive, en fournissant des outils fiables pour l’étude de la physiologie cardiaque, l’amélioration des processus de dépistage des médicaments et la promotion des applications dans la modélisation des maladies. Les progrès récents en matière de biostimulation tirent parti de l’effet de levier pour un contrôle cellulaire précis et non invasif.

L’optogénétique permet la modification génétique pour réguler l’activité cellulaire, tandis que les phototransducteurs émergents à base de matériaux offrent des alternatives non génétiques. Cette innovation constitue une percée significative dans l’étude et la modulation des neurones, des cardiomyocytes et des cellules musculaires squelettiques dans diverses applications. Les défis expérimentaux actuels comprennent l’obtention d’une distribution cohérente de la lumière dans les tissus profonds, l’optimisation de la biocompatibilité et de la stabilité des phototransducteurs et l’amélioration de la précision des techniques de stimulation basées sur la lumière.

De plus, l’intégration de ces méthodes à des systèmes biologiques complexes tout en maintenant la viabilité et la fonctionnalité cellulaires reste un obstacle majeur. Ce protocole comble le manque de recherche sur le besoin de techniques de stimulation précises non invasives dans des modèles microphysiologiques cardiaques. En utilisant des phototransducteurs à base de matériaux, comme Ziapin2, cette approche surmonte les limites de la stimulation électrique et de l’optogénétique traditionnelles, offrant un contour temporal et spatial amélioré tout en préservant la viabilité et la fonction des tissus.

Mes résultats feront progresser la recherche en introduisant une technique de stimulation lumineuse non invasive, basée sur des matériaux, qui offre une plus grande précision et un meilleur contrôle de l’activité cellulaire dans les tissus cardiaques. Cette approche élimine le besoin de modifications génétiques, fournissant un outil polyvalent pour modéliser la fonction cardiaque, étudier les mécanismes de la maladie et développer des stratégies thérapeutiques plus efficaces. Pour commencer, collez deux couches de ruban de laboratoire, une blanche et une bleue, sur une feuille acrylique transparente, résistante aux rayures et aux ultraviolets d’un millimètre d’épaisseur.

Découpez le motif de la puce sur le ruban selon le motif prévu, puis, à l’aide d’un graveur laser à dioxyde de carbone, coupez la feuille acrylique en cercles. Retirez les deux couches de ruban adhésif à l’intérieur de la ligne la plus intérieure à l’aide d’une pince à épiler. Faites tremper les copeaux dans de l’eau de Javel pure pendant 30 minutes à une heure pour éliminer les lignes épaisses et les taches sombres de la coupe, en laissant une ligne nette, et rincez les copeaux dans un bécher avec de l’eau déminéralisée courante pendant la nuit ou pendant au moins trois heures.

Sonicez les puces pendant 10 minutes dans le polydiméthylsiloxane, ou tampons PDMS, avec des caractéristiques de rainure de ligne pendant 30 minutes dans de l’éthanol propre à 70 %. Transférez les copeaux et les tampons dans un endroit propre sous une hotte et laissez-les sécher à l’air libre pendant environ une à deux heures. Ensuite, sonisez la gélatine fraîchement préparée pendant 15 minutes, puis remettez-la dans le bain-marie à 65 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi.

Placez la transglutaminase microbienne, ou tube MTG, dans un dessiccateur avec le capuchon légèrement desserré et allumez lentement le vide pour éliminer les bulles. Après le dégazage, remettez le tube MTG dans le bain-marie à 37 degrés Celsius. Ensuite, recouvrez une feuille de grille avec du Parafilm propre et placez les jetons sur la grille.

Gardez le tampon PDMS à proximité pour l’utiliser. Ajoutez cinq millilitres de MTG à cinq millilitres de solution de gélatine, en pipetant soigneusement pour éviter les bulles. Maintenant, aliquote rapidement environ 0,5 millilitre du mélange de gélatine sur chaque chip, en vous assurant que le mélange couvre la zone de la chip.

Placez le tampon PDMS à motifs linéaires sur le dessus et appliquez un poids de 200 grammes pour vous assurer que la gélatine est parallèle à l’axe longitudinal du tissu. Une fois que toutes les puces sont moulées, couvrez-les d’un bocal en verre pour éviter les perturbations environnementales et laissez-les se réticuler pendant la nuit. Transférez la puce et le tampon PDMS pris en sandwich dans une nouvelle boîte P150 remplie de PBS pour hydrater la gélatine pendant 30 minutes à une heure afin de faciliter la séparation du tampon PDMS de la puce.

Après avoir retiré tout excès de gélatine démoulée autour de la puce, transférez la puce propre dans une nouvelle boîte P150 remplie de PBS. Stockez les tampons PDMS dans de l’éthanol à 70 %. Pour stériliser les chips, faites-les tremper dans de l’éthanol pendant 10 minutes sous le capot.

Transférez les chips dans du PBS, faites-les tremper pendant 10 minutes, puis lavez-les trois fois au PBS. Pour les solutions d’enrobage, mélanger 20 microgrammes par millilitre de fibronectine avec une dilution de un à 100 de Geltrex dans un milieu de culture sans supplément. Enduisez les copeaux de cette solution pendant deux heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Décongeler et ensemencer des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans un milieu RPMI contenant 10 micromolaires Y-27632. Remplacez le support par un RPMI dépourvu de Y-27632 après 24 heures. Trois jours après l’ensemencement cellulaire, utilisez une pince à épiler pour retirer soigneusement le ruban blanc des copeaux.

Préparez l’appareil de cartographie optique composé d’un microscope à lentille tandem modifié équipé d’une caméra à grande vitesse et d’une lampe au mercure de 200 milliwatts comme source lumineuse d’excitation. Placez un miroir dichroïque devant la caméra d’imagerie calcique désignée. Pour la stimulation optique, appliquez une stimulation ponctuelle optique à une extrémité du tissu à l’aide d’une source lumineuse LED pour stimuler Ziapin2, le phototransducteur.

Stimulez les tissus à une fréquence de 0,5, soit un hertz, via une fibre optique régulée dans le temps positionnée à un millimètre du tissu. Incuber l’échantillon à l’aide de deux micromolaires X-Rhod-1 ajoutés au milieu de culture pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Après avoir lavé les copeaux avec un milieu de culture frais, transférez-les dans un milieu RPMI 1640 sans rouge de phénol, complété par du B-27 moins de l’insuline et HEPES.

Placez les puces de tissu dans une parabole à température contrôlée réglée sur la température physiologique et démarrez les enregistrements à une fréquence d’images de 2,5 images par seconde. La propagation des ondes calciques a été visualisée avec succès, avec une résolution spatiale et temporelle claire pendant la photostimulation à des fréquences de 0,5 ou d’un hertz, avec des vitesses de conduction calculées à environ 4,5 centimètres par seconde, conformes aux valeurs physiologiques. Les paramètres transitoires calciques, y compris l’amplitude, le temps de montée, la décroissance maximale, la pente et le temps de décroissance, étaient quantitativement similaires entre la stimulation lumineuse et la stimulation électrique, confirmant des réponses fonctionnelles comparables.