In vivo L’imagerie révèle le comportement migratoire des leucocytes à l’intérieur des articulations

Comme les leucocytes proviennent des cellules osseuses sanguines de la moelle osseuse, elles doivent donc pénétrer dans les tissus pour provoquer l’inflammation. Le contrôle de ce processus représente un point clé où de nouveaux traitements pourraient être développés pour atténuer l’inflammation. En général, le trafic leucocytaire vers les tissus enflammés se produit dans les vénules post-capillaires et suit la cascade d’adhésion, qui commence par la capture des leucocytes en flux libre par la paroi du vaisseau.

Cela est suivi par un roulement le long de la paroi du récipient en direction pro. Arrêt sur l’endothélium. Ainsi, il y a une adhésion et un avancement dans toutes les directions à la surface du vaisseau pour localiser un emplacement respectif et une migration transendothéliale vers un emplacement spécifique dans le tissu.

Déclencher des inflammations. Ces étapes distinctes sont régulées par une combinaison de signaux moléculaires, y compris les chimioattrants. Le chimioattractif active les leucocytes via ZP Cs et joue un rôle crucial dans la cascade migratoire.

Ainsi, d’autres études finales et expériences in vitro n’ont pas permis d’éclairer comment le signal du chimioattractif et du récepteur chimioattractif régule dynamiquement le comportement migratoire des leucocytes in vivo. Ainsi, les avancées récentes en technologie d’imagerie ont permis de voir sans précédent la migration des cellules immunitaires chez les animaux vivants, enrichissant considérablement notre compréhension de la régulation moléculaire du trafic cellulaire immunitaire in vivo. Ainsi, récemment, nous avons postulé pour étudier le mécanisme moléculaire contrôlant le trafic des neutrophiles vers les sites d’inflammations articulaires.

Donc, notre imagerie articulaire in vivo construit ce nouveau paradigme pour les réactions d’hypersensibilité de type III à l’intérieur de l’articulation. Ainsi, notre composante complémentaire C5a agit comme initiateur de l’inflammation tandis que les cellules résidentes tissulaires jouent un rôle plus important dans l’inflammation dans le paradigme actuel des réactions d’hypersensibilité de type III. Ainsi, l’imagerie in vivo de l’articulation est une technique précieuse pour découvrir le comportement migratoire des leucocytes et la dynamique moléculaire de l’articulation enflammée.

Nous partageons donc ce protocole pour l’imagerie articulaire in vivo afin de soutenir les groupes de recherche étudiant ce processus dans les articulations enflammées. Préparez le collagène bovin de type II dilué dans de l’acide acétique molaire 0,05 en secouant toute la nuit à quatre degrés pour créer l’émulsion, mélangez la dilution du collagène avec l’adjuvant Freund complet dans un ratio 1:2 dans une seringue en verre. Il pouvait aussi être mélangé à la main pendant environ 20 minutes.

Ce procédé génère de la chaleur, donc refroidissez la seringue en verre contenant l’émulsion sur de la glace. Une souris anesthésiée avant les vaccinations. Façonnez les poils le long de la queue à l’aide d’une tondeuse pour préparer la vaccination.

Injectez lentement un volume de 100 microlitres de l’émulsion dans l’espace sous-cutané près de la base de la queue. Le score clinique de l’arthrite et la mesure de l’épaisseur des pattes sont essentiels pour évaluer l’activité de la maladie. En général, les scores cliniques pour l’arthrite et les mesures de l’épaisseur des pattes sont effectués tous les un à trois jours après les premières vaccinations.

Le score clinique de l’arthrite à ce score est la somme des scores des quatre pattes de chaque souris. Les scores sont enregistrés comme suit. Donc, zéro est anormal.

L’un est l’érythème et le gonflement d’un doigt. Le deuxième est l’érythème et le gonflement de deux doigts ou érythème et le gonflement de l’articulation de la cheville. Le troisième est l’érythème et le gonflement de plus de trois doigts ou un gonflement de deux doigts et de l’articulation de la cheville.

Le quatrième est l’érythème et un gonflement sévère de la cheville, du pied et du doigt avec déformation. Ainsi, la mesure de l’épaisseur des pattes est mesurée par l’épaisseur de chaque patte à l’aide d’un étrier à coulisse numérique. La mesure moyenne de l’épaisseur des pattes sur les quatre pattes est utilisée pour chaque souris.

Les souris sont anesthésiées puis façonnent la patte de la souris avec une tondeuse. Utilisez une crème dépilante pour enlever les poils restants. Retirez la crème avec une gaze moelleuse.

Appliquez un lubrifiant cornéen stérile sur les deux yeux pour éviter le dessèchement cornéen et réduire le risque d’oscillation cornéenne. Sous une portée chirurgicale, réalisez une incision d’un centimètre le long de la peau à l’aide de microciseaux. Couvrez l’imagerie plus tôt avec 1,5 % d’agarose avec PBS.

La scène est posée au microscope. Ajustez les réglages du microscope confocal, y compris la puissance du laser, le gain, le décalage et la position. Une fois l’emplacement approprié identifié, commencez l’acquisition de l’image.

Un résultat représentatif de la CIA. En général, l’apparition de l’arthrite est observée au jour 28, avec un score clinique pour l’arthrite et l’épaisseur des pattes atteignant un pic au jour 35. L’incidence de l’ACI chez les souris DBA 1-day est généralement supérieure à 900 à 100 % au 35e jour.

Ici, le film à gauche montre le joint dans les souris contrôlées et celui à droite montre le joint chez les souris de la CIA. Dans ces films, les cellules vertes représentent des neutrophiles positifs à Ly6G. Les globules orange indiquent des lymphocytes T CD4 positifs, et les zones blanches correspondent aux vaisseaux sanguins.

Au 35e jour, on peut clairement voir que plus de neutrophiles Ly6G positifs sont présents en dehors des vaisseaux sanguins comparé aux cellules T CD4+. Ces neutrophiles sont très mobiles, se déplaçant activement dans plusieurs directions au sein de l’articulation enflammée. Ici, je montre l’analyse représentative de l’imagerie in vivo des articulations.

Le graphique de gauche montre le nombre de neutrophiles nouvellement collés, tandis que celui de droite montre le nombre de neutrophiles nouvellement transmigrés lors d’un enregistrement de 30 minutes. Dans les articulations arthritiques, le nombre de neutrophiles nouvellement collés et transmigrés est significativement plus élevé que celui observé dans les articulations témoins. En conclusion, nous présentons notre protocole actuel pour l’imagerie in vivo des articulations, qui permet une visualisation en temps réel et à haute résolution du comportement migratoire des leucocytes chez la souris vivante dans des conditions physiologiques et pathologiques.

Cette technique nous permet d’observer directement comment les cellules immunitaires interagissent dans les tissus enflammés, comment elles adhèrent aux parois des vaisseaux sanguins, transmigrent dans les tissus, et orchestrent la réponse inflammatoire. Grâce à cette approche, nous pouvons capturer des comportements cellulaires dynamiques qui seraient autrement invisibles avec des méthodes histologiques ou in vitro conventionnelles. En combinant ce système d’imagerie avec une analyse quantitative et des marqueurs moléculaires, nous pouvons découvrir des voies clés qui guident l’initiation et la progression de l’arthrite.

Il est important de noter que les connaissances issues de ces observations in vivo approfondissent non seulement notre compréhension de la dynamique des cellules immunitaires, mais fournissent également une base scientifique ou permettent d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. À mesure que cette technologie continue d’évoluer, et que de plus en plus de chercheurs adaptent et affinent la méthodologie, nous pensons que l’imagerie in vivo deviendra une plateforme essentielle pour étudier les maladies complexes à médiation immunitaire et constitue une puissante faille reliant l’immunologie fondamentale à la recherche translationnelle et clinique. En fin de compte, nous espérons que cette approche contribuera à développer des thérapies innovantes pour la polyarthrite rhumatoïde et d’autres maladies inflammatoires chroniques dans un avenir proche.