Name: Ingénierie non virale de lymphocytes T humains primaires via l’intégration ciblée de grandes matrices d’ADN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-09T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Découvrez une méthode non virale d'ingénierie des lymphocytes T humains primaires via CRISPR/Cas9 et HMEJ. Cette approche permet l'intégration efficace de grandes matrices d'ADN avec une expression GFP à 23,35% et une fonctionnalité préservée pour les applications en immunothérapie.

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<ol><li>Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">T cells in health and disease.</a> Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).</li>
<li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Journey+through+the+thymus%3A+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nature reviews. Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).</li>
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<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chimeric+switch-receptor+targeting+PD1+augments+the+efficacy+of+second-generation+CAR+T+cells+in+advanced+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A chimeric switch-receptor targeting PD1 augments the efficacy of second-generation CAR T cells in advanced solid tumors.</a> Cancer Res. 76 (6), 1578-1590 (2016).</li>
<li>Yeku, O. O., Purdon, T. J., Koneru, M., Spriggs, D., Brentjens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Armored+CAR+T+cells+enhance+anti-tumor+efficacy+and+overcome+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Armored CAR T cells enhance anti-tumor efficacy and overcome the tumor microenvironment.</a> Sci Rep. 7 (1), 10541(2017).</li>
<li>Schober, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+replacement+of+T-cell+receptor+%CE%B1-+and+%CE%B2-chains+with+preservation+of+near-physiological+T-cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Orthotopic replacement of T-cell receptor α- and β-chains with preservation of near-physiological T-cell function.</a> Nat Biomed Eng. 3 (12), 974-984 (2019).</li>
<li>Roth, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+human+T+cell+function+and+specificity+with+non-viral+genome+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting.</a> Nature. 559 (7714), 405-409 (2018).</li>
<li>Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor-based+cancer+immunotherapy%3A+Emerging+efficacy+and+pathways+of+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance.</a> Immunol Rev. 290 (1), 127-147 (2019).</li>
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<li>Campoli, M., Ferrone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+antigen+and+NK+cell+activating+ligand+expression+in+malignant+cells%3A+a+story+of+loss+or+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">HLA antigen and NK cell activating ligand expression in malignant cells: a story of loss or acquisition.</a> Semin Immunopathol. 33 (4), 321-334 (2011).</li>
<li>Walther, W., Stein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+gene+transfer%3A+a+review+of+their+use+in+the+treatment+of+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for gene transfer: a review of their use in the treatment of human diseases.</a> Drugs. 60 (2), 249-271 (2000).</li>
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<li>Kumar, M., Keller, B., Makalou, N., Sutton, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+determination+of+the+packaging+limit+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Systematic determination of the packaging limit of lentiviral vectors.</a> Hum Gene Ther. 12 (15), 1893-1905 (2001).</li>
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<li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature reviews. Drug Discov. 18 (5), 358-378 (2019).</li>
<li>Pomeroy, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+genetically+engineered+primary+human+natural+killer+cell+platform+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">a genetically engineered primary human natural killer cell platform for cancer immunotherapy.</a> Mol Ther. 28 (1), 52-63 (2020).</li>
<li>Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+primary+human+B+cells+with+CRISPR%2FCas9+targeted+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease.</a> Sci Rep. 8 (1), 12144(2018).</li>
<li>Nguyen, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-stabilized+Cas9+nanoparticles+and+modified+repair+templates+increase+genome+editing+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Polymer-stabilized Cas9 nanoparticles and modified repair templates increase genome editing efficiency.</a> Nat Biotechnol. 38 (1), 44-49 (2020).</li>
<li>Lock, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+scaled%2C+transposon-based+production+of+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Automated, scaled, transposon-based production of CAR T cells.</a> J Immunother Cancer. 10 (9), e005189(2022).</li>
<li>Semenova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cytosolic+DNA+sensors+bind+plasmid+DNA+after+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Multiple cytosolic DNA sensors bind plasmid DNA after transfection.</a> Nucleic Acids Res. 47 (19), 10235-10246 (2019).</li>
<li>Wimberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+inhibition+of+DNA-PK+and+Pol%CF%B4+improves+integration+efficiency+and+precision+of+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Simultaneous inhibition of DNA-PK and Polϴ improves integration efficiency and precision of genome editing.</a> Nat Comm. 14 (1), 4761(2023).</li>
<li>Monjezi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+CAR+T-cell+engineering+using+non-viral+Sleeping+Beauty+transposition+from+minicircle+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Enhanced CAR T-cell engineering using non-viral Sleeping Beauty transposition from minicircle vectors.</a> Leukemia. 31 (1), 186-194 (2017).</li>
<li>Kay, M. A., He, C. -Y., Chen, Z. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+system+for+production+of+minicircle+DNA+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A robust system for production of minicircle DNA vectors.</a> Nat Biotechnol. 28 (12), 1287-1289 (2010).</li>
<li>Webber, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-induced+targeted+integration+of+large+DNA+payloads+in+primary+human+T+cells+via+homology-mediated+end-joining+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Cas9-induced targeted integration of large DNA payloads in primary human T cells via homology-mediated end-joining DNA repair.</a> Nat Biomed Eng. 8, 1553-1570 (2024).</li>
<li>Williams, J. A., Paez, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+cell+and+gene+therapy+safety+and+performance+using+next-generation+Nanoplasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Improving cell and gene therapy safety and performance using next-generation Nanoplasmid vectors.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 32, 494-503 (2023).</li>
<li>Wierson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+integration+directed+by+short+homology+in+zebrafish+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells.</a> eLife. 9, 53968(2020).</li>
<li>Hendel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+modified+guide+RNAs+enhance+CRISPR-Cas+genome+editing+in+human+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (9), 985-989 (2015).</li>
<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+past%2C+present%2C+and+future+of+non-viral+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The past, present, and future of non-viral CAR T cells.</a> Front Immunol. 13, 867013(2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Acide acétique</td><td>Millipore Sigma</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS, sans calcium, sans magnésium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>2,5 % CTS Sérum de remplacement de cellules immunitaires</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A2596101</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofactor X Kit L</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofactor X Kit S</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15561020</td><td></td></tr><tr><td>ARN guides chimiquement modifiés</td> Technologies <td>d’ADN intégrées</td><td>na</td><td>Conception personnalisée</td></tr><tr><td>CleanCap Cas9 ARNm</td><td>Trilink</td><td>L-7206</td><td></td></tr><tr><td>CTS Média d’expansion des lymphocytes T OpTmizer SFM +OpTmizer Supplément d’expansion des lymphocytes T</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1048501</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07900</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Activateur T Humain CD3/CD28&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11141D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Humain IL15</td><td>PeproTech</td><td>200-15</td><td></td></tr><tr><td>Humain IL2</td><td>PeproTech</td><td>200-02&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>IL7 Humain</td><td>PeproTech</td><td>200-07</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>25030081</tr><tr><td>Lonza 4D nucelofector Noyau</td><td>Lonza</td><td>AAF-1003B</td><td></td></tr><tr><td>Lonza 4D nucelofector&nbsp ; X Unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1003X</td><td></td></tr><tr><td>Minicircle</td><td>System Biosciences</td><td>MN910A-1</td><td>Conception sur mesure</td></tr><tr><td>N-Acétyl-L-cystéine</td><td>MiliporeSigma</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Nanoplasmide</td><td>Aldevron</td><td>na</td><td>Conception sur mesure</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr></tbody></table>

ingénierie non virale de lymphocytes t humains primaires via l’intégration ciblée de grandes matrices d’adn

Non-Viral Engineering of Primary Human T Cells via Homology-Mediated End-Joining Targeted Integration of Large DNA Templates

Ici, un grand modèle multicistronique (&gt;6,3 kb) appelé la construction « Giant Minicircle » a été intégré dans le locus TRAC dans les cellules T humaines primaires à l’aide de l’édition CRISPR/Cas9 ; un ARNg spécifique de TRAC (TCTCTCAGCTGGTACACGGC), l’ARNug et le nanoplasmide HMEJ (Figure 2A) avec une condition dépourvue d’ARNg spécifique de TRAC, l’ARNg universel et l’ARNm Cas9 utilisés comme contrôle négatif. Les échantillons qui comprennent la construction du minicercle géant, l’ARNg spécifique de TRAC, l’ARNg universel et l’ARNm Cas9 ont présenté un taux d’entraînement moyen de 23,35 % lors de la mesure de l’expression de la GFP (23,5 % ± 5,247), tandis que le témoin négatif n’a montré aucune expression de la GFP (figure 2B). Il n’y avait pas de différences significatives dans l’expansion du pli (figure 2C) et la viabilité (figure 2D) entre les conditions expérimentales. Ces résultats démontrent une intégration à haut rendement d’un très grand modèle tout en maintenant une excellente viabilité cellulaire et une expansion cellulaire.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68150/68150fig01.jpg"> Figure 1 : Représentation schématique de la conception de construction HMEJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68150/68150fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68150/68150fig02.jpg"> Figure 2 : Caractérisation des lymphocytes T électroporés avec la construction du minicercle géant. (A) Représentation schématique de la construction du minicercle géant, un grand modèle multicistronique (&gt;6,3 kb) codant un CAR anti-mésothéline et un RQR8 sous le promoteur TRAC avec un linker GSG, un CAR anti-CD19 et une mutein DHFR et un eGFP sous le promoteur MND. (B) le pourcentage d’expression de RQR8, (C) l’expansion du pli et (D) la viabilité des lymphocytes T neuf jours après l’électroporation avec la construction du minicercle géant et les réactifs CRISPR-Cas9, par rapport à un contrôle négatif électroporé avec le minicercle géant dépourvu de réactifs CRISPR-Cas9. (***p &lt; 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68150/68150fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Taille de la plaque</td>
			<td>Cuvette Volume</td>
			<td>Cellules/Puits</td>
			<td>Volume des supports de récupération</td>
			<td>Volume de 1x TCM avec NAC</td>
			<td>Total Final Volume</td>
		</tr><tr><td>Plaque à 24 puits</td>
			<td>22/22 μL</td>
			<td>1-3 x 106</td>
			<td>300 μL</td>
			<td>680 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>Plaque à 6 puits</td>
			<td>100/110 μL</td>
			<td>4-20 x 106</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>2,9 ml</td>
			<td>4 ml</td>
		</tr><tr><td>Plaque G-Rex à 24 puits</td>
			<td>20 à 110 μL</td>
			<td>1-20 x 106</td>
			<td>400 μL</td>
			<td>5,6 ml</td>
			<td>6 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Concentrations des cellules pour les cuvettes et les plaques de récupération.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Taille de la cuvette</td>
			<td>Plasmide matriciel</td>
			<td>ARNg du site cible</td>
			<td>Linéarisation plasmidique ARNg</td>
			<td>ARNm Cas9</td>
		</tr><tr><td>20 μL</td>
			<td>1-2 μg (1 μg)</td>
			<td>1 à 3 μg (1 μg)</td>
			<td>1 à 3 μg (1 μg)</td>
			<td>1-3 μg (1,5 μg)</td>
		</tr><tr><td>100 μL</td>
			<td>5 à 10 μg (5 μg)</td>
			<td>5 à 15 μg (5 μg)</td>
			<td>5 à 15 μg (5 μg)</td>
			<td>5 à 15 μg (5 μg)</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Quantité de réactifs CRISPR/Cas9 et de matrice d’ADN nécessaires.

Ingénierie non virale de lymphocytes T humains primaires via l’intégration ciblée de grandes matrices d’ADN

Many current adoptive cellular therapies rely on lenti- or retroviral vectors to engineer T cells for the expression of a chimeric antigen receptor (CAR) ...

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