À Ovo Xénogreffe de cellules de leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) dérivées de patients (PDX-LAL)

Le champ d’application de cette recherche est la biologie du cancer, en mettant l’accent sur l’identification de stratégies thérapeutiques pour traiter le cancer. Le modèle de leucémie lymphoblastique aiguë dérivée d’un patient in ovo est limité par une fenêtre expérimentale relativement courte d’environ 10 jours, ce qui limite les études à long terme sur la progression de la leucémie lymphoblastique aiguë ou la réponse médicamenteuse au-delà de cette période. Ce protocole établit une méthode rapide et rentable pour la xénogreffe in ovo de cellules de leucémie lymphoblastique aiguë dérivées de patients, y compris les lignées de cellules B et de cellules T.

Ce protocole représente un outil prometteur pour le criblage préclinique de médicaments, les études mécanistes et les approches de médecine potentiellement personnalisée dans la recherche sur la leucémie. La faisabilité de l’utilisation du modèle de xénogreffe in ovo établi pour des applications précliniques sera explorée. Pour commencer, transférez les œufs obtenus dans un incubateur roulant humidifié réglé à environ 50 à 60 % d’humidité et à une température de 39 degrés Celsius.

Incuber les œufs dans cet incubateur pendant 10 jours après la fécondation. Transférez les échantillons de sang dans un tube à centrifuger stérile de 50 millilitres et diluez chaque échantillon trois fois à l’aide de deux volumes de PBS. Après avoir centrifugé l’échantillon avec un milieu à gradient de densité, collectez la couche de couche leucocytaire des cellules mononucléées de l’interface et transférez-la dans un nouveau tube stérile de 15 millilitres.

Ajoutez 10 millilitres de PBS dans le tube et centrifugez les tubes à 300 G pendant cinq minutes pour éliminer les composants sériques restants. Remettre en suspension les cellules granulées dans un milieu RPMI 1640 complété par 10 % de FBS. Utilisez un hémocytomètre pour compter le nombre de cellules.

Remettre les cellules en suspension dans un milieu de congélation composé de 10 % de DMSO dans le FBS. Évaluez la viabilité cellulaire à l’aide du test d’exclusion au bleu trypan, congelez les cellules à moins 80 degrés Celsius et stockez-les dans de l’azote liquide. Ensuite, co-transfectez 1,5 million de cellules T HEK 293 avec le vecteur plasmidique souhaité à l’aide de Lipofectamine 3000 et incubez les cellules transfectées pendant deux jours.

Récoltez le surnageant contenant du lentivirus dans les puits et filtrez-le à travers un filtre de 0,45 micromètre pour éliminer les débris. Transvaser le surnageant viral filtré dans des tubes à centrifuger et centrifuger à 20 000 g pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Pour le marquage, mettez en plaques 1 million de cellules par millilitre de lignées cellulaires MEB précurseurs de cellules B et de cellules T MOLT3 ainsi que de cellules de leucémie lymphoblastique aiguë B ou T dérivées de patients dans des plaques à six puits contenant du RPMI 1640 avec 10 % FBS.

Visualisez les cellules marquées mCherry à l’aide d’un microscope à fluorescence. Le 10e jour, examinez le système vasculaire des embryons de poussin sous la lumière pour évaluer la viabilité de l’embryon, lavez doucement la surface de chaque œuf avec de l’éthanol à 70 %. À l’aide d’une perceuse à main, percez dans la cellule d’air de chaque œuf pour créer une petite fenêtre d’environ deux centimètres de diamètre.

Scellez la fenêtre créée avec du ruban adhésif transparent et remettez les œufs dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone. Le 11e jour, injectez 10 millions de cellules de leucémie lymphoblastique aiguë marquées mCherry dans les vaisseaux sanguins des embryons en développement à l’aide d’aiguilles de calibre 34. Après avoir scellé la fenêtre, remettez les œufs dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone et surveillez quotidiennement la viabilité de l’embryon.

Le 15e jour, disséquez les vaisseaux sanguins des embryons. Placez-les sur des lames de verre et photographiez les xénogreffes réussies à l’aide d’un microscope de dissection doté de capacités de fluorescence. Prélever du sang dans le système vasculaire d’embryons de poulet à l’aide d’une seringue stérile avec une aiguille de calibre 32.

Transférez le sang dans un tube stérile de 1,5 millilitre contenant de l’héparine et centrifugez à 226 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Étiquetez les cellules de leucémie aiguë lymphoblastique à cellules B avec des anticorps humains FITC CD10 et PE CD19 humains et les cellules de leucémie aiguë lymphoblastique à cellules T avec des anticorps humains FITC CD4 et PE CD8 humains à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pendant 30 minutes. Lavez les cellules marquées deux fois à l’aide de PBS contenant 1 % de BSA et analysez à l’aide de la cytométrie en flux La colonisation vasculaire par les lignées cellulaires SEM et MOLT3 était clairement visible quatre jours après l’injection, confirmant la réussite de la greffe dans le système vasculaire de l’embryon de poulet en développement.

Les cellules B-all et T-all dérivées de patients ont montré de forts signaux fluorescents dans les vaisseaux sanguins quatre jours après l’injection, indiquant une colonisation active et une prolifération dans le système vasculaire. La cytométrie en flux a révélé une augmentation significative des cellules CD10/CD19 positives chez les embryons injectés avec du SEM et des cellules B-all dérivées de patients quatre jours après l’injection par rapport aux témoins collectés six heures après l’injection. De même, les cellules CD4/CD8 positives étaient significativement plus élevées chez les embryons injectés avec MOLT3 et les cellules T-all dérivées de patients quatre jours après l’injection.