Établissement de modèles in vitro de culture de ganglions de la racine dorsale : approches complémentaires pour l’étude de la diaphonie cancéreux-nerf

Notre recherche se concentre sur l’diaphonie cancéreux-nerfs, en utilisant des explants 3D de ganglions de la racine dorsale ou DRG et des cultures dissociées en 2D pour quantifier la migration tumorale neuroguidée et tester des stratégies moléculaires pour limiter leur interaction. Avec ce protocole, nous avons établi des cultures DRG 3D et 2D complémentaires, optimisé la croissance des neurites et démontré une augmentation de l’invasion des cellules cancéreuses le long des extensions des neurites. Nous avons remédié au manque de modèles reproductibles qui capturent à la fois des interactions complexes au niveau cellulaire et une architecture nerveuse intacte en créant des cultures DRG 2D et 3D complémentaires à partir d’une seule souris.

Notre protocole produit des explants 3D appariés et des cultures de neurones 2D à partir d’une seule souris, préservant ainsi la texture angulaire, permettant une imagerie à haut contenu, réduisant l’utilisation d’animaux et nous permettant d’obtenir des données au niveau des tissus et des cellules uniques en une seule expérience. Notre modèle a soulevé des questions sur les facteurs créés par DRG à l’origine de l’invasion, sur la façon dont l’activité neuronale, l’âge et le génotype la façonnent, et sur la question de savoir si le ciblage des récepteurs des facteurs neurotrophiques pouvait réduire la propagation du cancer guidé par les neurites. Pour commencer, posez une souris euthanasiée sur son abdomen.

Rasez la fourrure en vous concentrant sur la zone au-dessus de la colonne vertébrale pour exposer la surface dorsale. Vaporisez de l’éthanol à 70 % sur le dos de l’animal. À l’aide d’essuie-tout, essuyez de la queue au crâne pour enlever toute fourrure lâche et éviter la contamination pendant la dissection.

Avec une paire de ciseaux stérilisés, faites une incision droite le long de la ligne médiane dorsale, de la queue au crâne. À l’aide d’une pince émoussée, rétractez la peau des deux côtés de l’incision pour exposer la colonne vertébrale. Maintenant, utilisez une nouvelle paire de ciseaux et de pinces pour éviter la contamination et faites une incision horizontale à l’extrémité arrière de la colonne vertébrale.

Faites ensuite deux incisions longitudinales parallèles de chaque côté de la colonne vertébrale pour la libérer. À l’aide d’une pince, soulevez doucement la colonne vertébrale et retirez le tissu conjonctif environnant. Pour libérer complètement la colonne vertébrale, faites une incision en haut de la colonne vertébrale près du crâne.

Transférez la colonne vertébrale dans une plaque pré-refroidie de 10 centimètres contenant du HBSS avec de la pénicilline streptomycine conservée sur de la glace. Ensuite, utilisez des ciseaux à ressort pour retirer tout tissu conjonctif restant de la colonne vertébrale et exposer les vertèbres. Transférez la colonne vertébrale coupée sur une platine de microscope.

Divisez soigneusement la colonne le long du plan sagittal à l’aide de ciseaux à ressort. À l’aide d’une pince à pointe fine, retirez la moelle épinière de la colonne pour révéler les ganglions de la racine dorsale le long des racines des nerfs rachidiens. Coupez les nerfs spinaux à l’aide de ciseaux à ressort.

Retirez ensuite tout tissu conjonctif environnant des ganglions de la racine dorsale. À l’aide d’une pince à pointe fine, extrayez délicatement les ganglions de la racine dorsale des racines dorsales. Pour une culture entière, placez les DRG dans une plaque de trois centimètres contenant du HBSS avec de la pénicilline streptomycine conservée sur de la glace.

À l’aide d’embouts de pipette pré-refroidis, versez deux microlitres de Matrigel réfrigéré dans chaque puits d’une lame à fond de verre à huit puits placée à l’intérieur d’une plaque de 10 centimètres sur de la glace. Pour éviter une polymérisation prématurée, pipetez une seule gouttelette à la fois. Ensuite, utilisez une pince à pointe fine pour placer un ganglion de la racine dorsale sur une plaque sèche.

Agitez doucement pour éliminer l’excès de HBSS. Transférez ensuite le ganglion de la racine dorsale propre dans la gouttelette de Matrigel. Après avoir transféré tous les ganglions dans les gouttelettes, incubez la lame à fond de verre dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes pour permettre au Matrigel de polymériser.

Ensuite, ajoutez soigneusement 200 microlitres de milieu de culture chaud complété dans chaque puits. Incuber le toboggan à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Utilisez la microscopie à fond clair pour surveiller quotidiennement les ganglions de la racine dorsale pour la croissance neuronale et la viabilité.

Centrifugez un tube conique de 15 millilitres contenant des ganglions de la racine dorsale à 200 g pendant cinq minutes à température ambiante. Après avoir pipeté le HBSS, rincez les ganglions avec un milieu supplémenté préchauffé et tapotez doucement. Ensuite, centrifugez le tube pendant cinq minutes à 200G pour granuler les DRG.

Remplacez le milieu par un millilitre de solution de papaïne. Mélangez doucement et incubez à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture tissulaire pendant 20 minutes, en agitant doucement toutes les cinq minutes. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de milieu supplémenté pour neutraliser la papaïne et mélangez doucement.

Centrifuger pendant cinq minutes à 400G pour granuler les ganglions de la racine dorsale. Après avoir pipeté le surnageant, ajoutez un millilitre de collagénase de type IV dans la solution Dispase II, et incubez à nouveau. Ajouter 4,5 millilitres de milieu supplémenté pour neutraliser la solution enzymatique, mélanger doucement et centrifuger.

Après avoir pipeté le surnageant, ajoutez cinq millilitres de milieu supplémenté. Ajoutez ensuite la Dnase I pour atteindre une concentration finale de 0,2 milligramme par millilitre. Les ganglions de la racine dorsale devraient maintenant apparaître comme une touffe lâche, indiquant une digestion complète.

Pour la dissociation mécanique, utilisez une pointe de pipette filtrante de 1 000 microlitres pour triturer la solution des ganglions en pipetant de haut en bas quatre à cinq fois. Passez à une pointe de pipette de 200 microlitres et répétez la trituration en pipetant quatre à cinq fois. Filtrez la suspension trouble résultante à travers une crépine à cellules de 70 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres.

Rincez ensuite progressivement la passoire avec 10 millilitres de média pour assurer un transfert complet des cellules. Centrifugez la suspension cellulaire filtrée pendant cinq minutes à 1 000 G pour granuler les cellules. Retirez le support de la pastille et remettez en suspension la pastille de cellule dans 500 microlitres de milieu supplémenté.

Retirez tout PBS résiduel des puits de la lame à fond de verre à huit puits. Répartissez la suspension dissociée des ganglions de la racine dorsale dans les puits recouverts de collagène et incubez. Utilisez la microscopie à fond clair pour surveiller quotidiennement les cellules dérivées des ganglions de la racine dorsale, en évaluant la viabilité cellulaire et la croissance neuronale Pour co-cultiver l’ensemble des ganglions de souris avec des cellules cancéreuses, aspirez d’abord le milieu des cultures DRG à montage entier sur la lame à fond de verre à huit puits.

À l’aide d’une pipette, ajoutez délicatement 200 microlitres de suspension de cellules cancéreuses dans le puits contenant la gouttelette de Matrigel et les ganglions de la racine dorsale. Incuber la lame de co-culture dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Rafraîchissez le média quotidiennement en le lavant une fois avec 200 microlitres de média supplémenté chauffé et ajoutez 300 microlitres de média frais.

Pour la co-culture des ganglions dissociés et des cellules cancéreuses, aspirez le milieu des cultures DRG dissociées sur la lame à fond de verre à huit puits. Ensuite, répartissez doucement 200 microlitres de suspension de cellules cancéreuses dans chaque puits avant l’incubation. L’établissement de DRG était moins efficace en l’absence de suppléments et l’extension des neurites était nettement réduite.

Les DRG entiers d’animaux plus âgés ont produit une extension de neurite moins abondante et plus distincte et des cellules gliales minimales, facilitant la visualisation des interactions entre les cellules cancéreuses nerveuses. La dissociation des neurones DRG à l’aide de deux étapes enzymatiques a entraîné une récupération neuronale plus élevée. Dans les 24 heures suivant la culture, des cellules non neuronales, telles que les cellules de Schwan, les macrophages et les fibroblastes, sont devenues évidentes, tandis que les neurites germant à partir de cellules dérivées de DRG ont été observées et ont encore augmenté après 72 heures.

Les cellules cancéreuses ensemencées dans des inserts transwell recouverts de Matrigel ont envahi les cellules HEC293, mais pas les neurones DRG après 24 heures d’incubation. Des cultures DRG entières immergées dans une gouttelette de Matrigel ont permis l’extension des neurites vers l’extérieur à travers la matrice vers la périphérie. Avec un positionnement minutieux du DRG au centre de la gouttelette, fournissant une extension maximale des neurites sans dépasser les bords.

Les cellules cancéreuses se sont installées après 12 heures de co-culture autour du bord de la gouttelette de Matrigel contenant le DRG. Après 72 heures de co-culture, les cellules cancéreuses avaient envahi le Matrigel et s’étaient déplacées vers le ganglion, avec une interaction directe entre les extensions des cellules ganglionnaires de la racine dorsale et les cellules cancéreuses observées. La co-culture de cellules dérivées de DRG dissociées avec des cellules cancéreuses a permis de visualiser en détail les interactions cellulaires individuelles.