Fabrication d’une matrice cérébrale extensible personnalisable à travers les stades de développement

Fabrication d’une matrice cérébrale extensible personnalisable à travers les stades du développement, par Chapman et ses collègues de l’Université du Kentucky à Lexington, Kentucky. Le développement du cerveau des porcelets est très similaire à celui du cerveau humain à plusieurs égards. Comparé aux rats et aux souris, le rapport entre le poids du cerveau des porcelets à la naissance à la maturité est beaucoup plus proche de celui des humains, et les régions fonctionnelles des gyris et cerveaux céphales humains sont très similaires.

Pour ces raisons, l’utilisation des porcs et d’autres grands mammifères dans la recherche en neurosciences est en augmentation. Cependant, les matrices cérébrales commerciales pour les mammifères plus grands sont coûteuses, et les choix sont souvent limités à une seule taille ou plan de sectionnement. Par conséquent, les matrices commerciales peuvent ne pas s’adapter bien à différentes souches, mâles et femelles, et à différents âges.

Cela pose particulièrement problème pour les études en neurosciences du développement, où la taille du cerveau varie de manière marquée avec la croissance postnatale. Par exemple, les cerveaux de porcelets croissent rapidement durant les trois premiers mois, augmentant leur volume de plus de trois ans. La matrice cérébrale commerciale des porcelets est conçue pour s’adapter aux cerveaux des porcelets jusqu’à deux semaines d’âge.

Nous présentons ici une méthode de construction matricielle personnalisable sur plaques d’acrylique comme une solution économique et facile à mettre en œuvre à ce problème. Quatre cochons naïfs de quatre jours ont été obtenus pour cette expérience. L’un a été utilisé pour la prélève cerveau à cinq jours, deux à 32 jours et un à 38 jours.

Après l’extraction du cerveau du crâne, celui-ci était fixé en immersion dans du formol tamponné à 10 % pendant deux jours, puis placé dans une solution à 30 % de saccharose pendant cinq jours pour une cryoconservation. Nous allons ensuite présenter comment réaliser un moulage du cerveau à l’aide de gel d’agarose. La première étape pour créer la matrice est de faire un moule du cerveau.

Nous illustrerons le processus de création d’un moule du cerveau de porcelet postnatal au cinquième jour, qui servira à construire une matrice sagittale. Placez une bande de plastique résistant au fond du récipient en verre, en veillant à laisser les deux extrémités dépasser des bords du récipient. Cette bande facilitera l’extraction du bloc d’agarose.

Immergez le récipient à moitié dans un seau de glace humide. Dans un bécher en verre, chauffez 150 millilitres de PBS à 90 degrés Celsius et ajoutez six grammes d’agarose, en remuant constamment. Verser lentement la solution à 4 % d’agarose pour créer une couche d’un demi-à un centimètre d’épaisseur au fond du récipient et laisser solidifier.

Recouvrir complètement le cerveau d’une fine couche d’huile minérale pour empêcher l’agarose de se lier à la surface du cerveau ou de rester piégée dans le sillard. L’huile rend également le retrait du cerveau du gel d’agarose beaucoup plus facile à gérer. Une fois recouvert, placez le cerveau sur la fine couche d’agarose dans l’orientation souhaitée pour une moisissure coronale ou sagittale, aussi droite et droite que possible.

Laissez la solution d’agarose refroidir à 50 degrés Celsius tout en remuant constamment pour conserver une viscosité versable. Ensuite, versez la solution d’agarose sur le cerveau jusqu’à ce qu’elle soit complètement intégrée. Laissez l’agarose se solidifier à température ambiante.

Coupez la couche d’agarose au-dessus du cerveau avec une sonde chirurgicale en suivant le contour du cerveau. Une fois la coupure terminée autour du cerveau, utilisez une fine spatule pour soulever doucement la couche supérieure de l’agarose. Faites attention à ne pas trancher ou griffer le cerveau pendant ces étapes.

Retirez doucement tout le cerveau du moule. Elle devrait sortir relativement facilement grâce à l’huile minérale appliquée plus tôt sur la surface. Veillez à retirer les petits morceaux de gel d’agarose qui auraient pu tomber dans l’empreinte.

Chauffez 98 millilitres de PBS dans un bécher à 9 degrés Celsius et ajoutez quatre grammes d’agarose et deux millilitres d’encre de Chine. Remuez bien. Verser cette solution d’agarose noire dans l’empreinte créée par le cerveau, en veillant à ne pas déborder l’empreinte.

Laissez le gel noir se solidifier. Tenez les deux extrémités de la bande plastique et soulevez tout le bloc d’agarose du récipient. Nous allons maintenant illustrer comment créer des plaques modèles pour votre matrice.

Pour découper le moule à cerveau, placez une feuille de papier à écailles entre deux plaques acryliques transparentes de 76 millimètres et placez-les près du bord de la table. Ensuite, utilisez des serre-joints pour fixer quatre carrés d’angle et deux plaques d’acrylique afin de construire deux murs pour maintenir les blocs d’agarose bien ajustés dans l’orientation souhaitée. Les bords avant des deux carrés métalliques d’angle et des deux plaques verticales en acrylique doivent être alignés sur un côté du papier à l’échelle.

Placez le bloc gel d’agarose de façon à ce que le bord à découper s’aligne le long du papier à écailles et avec les bords des plaques verticales en acrylique et des carrés d’angle, puis placez un poids du côté opposé du bloc d’agarose pour le maintenir en position. Coupez tout excédent du bloc jusqu’à ce que le moulage cerveau à l’encre de Chine soit sur le point d’être coupé. Avancez le bloc d’agarose aux étapes souhaitées, par exemple de deux ou cinq millimètres à l’aide des marques sur le papier à écailles sous-jacent.

Saisissez fermement la lame à deux mains et guidez-la le long des bords avant des plaques acryliques et des carrés d’angle pour trancher le bloc. Placez chaque tranche sur une seconde feuille de papier à écailles et appuyez fermement pour transférer une empreinte sur le papier. Avec un stylo, dessinez toute la tranche.

Retirez la tranche et contournez le contour du cerveau identifié par l’encre de Chine. Notez l’orientation de la première tranche sur le papier à échelle, par exemple postérieure et antérieure pour les coupes sagittales, et gardez une uniformité lorsque des tranches de gel supplémentaires sont ajoutées au papier tout au long du processus. Numérotez chaque traçage séquentiellement.

Coupez les plaques en acrylique à 10 par 8 1/2 centimètres. Ensuite, empilez-les et fixez-les à l’étape de la perceuse à colonne avec des carrés d’angle et des serre-joints. Perçez trois trous dans la pile avec les coordonnées indiquées dans le manuscrit.

Retirez le film protecteur des plaques en acrylique. Ensuite, placez une plaque acrylique au-dessus d’un gabarit sur le papier à écailles et alignez le haut des lignes de la plaque acrylique sur les bords supérieurs du gabarit. Tracez le contour du cerveau sur la plaque acrylique avec un marqueur permanent.

Étiquetez chaque plaque pour correspondre au numéro du modèle ou au retraçage du cerveau. À l’aide de la scie à ruban, coupez chaque plaque le long des lignes de gabarit copiées. Sinon, un outil rotatif avec une pointe de sculpture sur bois peut être utilisé pour éliminer les zones indésirables.

Polissez le tranchant à l’aide d’un outil rotatif avec une embout ponçable pour lisser les bords, car les bords tranchants pourraient endommager le cerveau lors des tranches. Vérifiez la précision de la découpe en plaçant la plaque acrylique sur le gabarit. Ajustez et polissez si nécessaire.

Ensuite, nous allons illustrer l’assemblage des plaques. Préassemblez la matrice en empilant les plaques dans un ordre séquentiel et vérifiez l’alignement des plaques. L’assemblage matriciel commence par placer trois longs boulons en acier inoxydable à travers la première plaque acrylique, puis par placer une rondelle sur chaque vis.

Place la deuxième plaque et ajoute des rondelles à chaque vis. Sinon, les rondelles peuvent être collées autour des trous d’ancrage avec de la super glue pour éviter d’avoir à ajouter les rondelles individuellement à chaque assemblage. Répétez ce processus jusqu’à ce que toutes les plaques aient été ajoutées séquentiellement aux boulons.

Serrez tout ensemble avec un écrou sur chaque boulon. Effectuez un polissage final des bords faisant face au cerveau pour faciliter la transition d’une plaque à l’autre. Utilisez des marqueurs de différentes couleurs pour colorer le bord supérieur des plaques d’acrylique avec des couleurs alternées afin de faciliter le découpage.

Ici, nous alternions avec des plaques noires, rouges et non marquées. Enfin, nous allons démontrer le processus de tranche du cerveau dans le plan coronal, soit dans le plan sagittal. Pour trancher le cerveau, placez-le dans la matrice dans la même orientation qu’au moment du moulage et aussi droit que possible.

Il te faudra une lame large et plate pour couper le cerveau. La lame large limite le risque de torsion ou de pliage lors de la tranche. Nous recommandons une lame cryostat à haut profil.

Pour la sécurité, enroulez environ deux centimètres d’une extrémité de la lame avec du ruban adhésif de laboratoire pour créer un espace où l’extrémité enveloppée lors de la tranche du cerveau. Petite note de prudence ici. Comme chaque partie du cerveau a des textures différentes après fixation au formol, il faut faire preuve d’une pression uniforme sur la lame.

De plus, le cerveau du porcelet est grand, il est donc préférable d’utiliser un mouvement de tranche pour couper le cerveau plutôt qu’une coupe directe en poussant vers le bas. La lame doit être tirée avec une force constante d’un côté à l’autre, en veillant à descendre suffisamment pour trancher tout le cerveau. Mettez toutes les tranches dans un plateau à six puits ou un plateau en inox rempli de PBS.

Posez soigneusement les tranches dans le plateau, en maintenant l’ordre et l’orientation des tranches, puis conservez ou procédez selon les besoins. Pour ajuster la géométrie ou agrandir la cavité afin de mieux s’adapter au cerveau, certaines plaques d’acrylique peuvent être retirées ou ajoutées pour adapter la matrice à différentes tailles de cerveau. Ici, nous illustrons l’expansion d’une matrice sagittale construite pour un cerveau porcelet P5 en ajoutant plusieurs plaques, ici colorées en bleu et vert, à la partie médiane de la matrice.

La matrice convient désormais à la coupe sagittale d’un porcelet P38. La capacité d’agrandir ou de réduire la taille de la matrice augmente considérablement la flexibilité de la matrice et peut économiser à la fois des matériaux et des efforts. Comme pour la tranche coronale, il faut découper soigneusement le cerveau dans le plan sagittal en utilisant des plaques successives pour guider la lame.

Le système de codage couleur aide à identifier le bon emplacement séquentiel de la lame, ce qui est difficile lorsque les tranches sont fines. Retirez le cerveau de la matrice et détachez doucement les tranches. En conclusion, nous avons développé une méthode simple, économique et flexible pour créer des matrices cérébrales pour les porcelets nouveau-nés.

Ce concept peut s’appliquer aux porcs plus âgés ainsi qu’à d’autres grands modèles animaux.