Imagerie High-Plex à l’aide de la microscopie confocale spectrale pour minimiser la fluorescence tissulaire non spécifique

Nous optimisons un flux de travail IBEX qui combine le blocage de l’héparine et la détection spectrale pour supprimer le fond de fond dans les tissus humains riches en éosinophiles. L’autofluorescence et la liaison des granules d’éosinophiles obscurcissent le signal réel. Nous ciblons les deux pour permettre des cartes Plex propres.

Pour commencer, dessinez un cercle sur la lame en verre autour du mouchoir monté à l’aide d’un stylo pap pour créer une barrière hydrophobe. Ajoutez environ 100 microlitres de PBS à chaque tissu pour les réhydrater, puis faites couver la lame pendant environ deux minutes à température ambiante pour éliminer le composé optimal à température de coupe. Aspirez le PBS autour du tissu à l’aide d’une pipette Pasteur à succion.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon de blocage à chaque tissu, et incubez à température ambiante dans une chambre d’humidité pendant une heure. Aspirez maintenant le tampon de blocage à l’aide d’une pipette. Ajoutez 100 microlitres de coloration mélangés à chaque tissu et incubez la lame dans une chambre d’humidité couverte à l’intérieur d’un réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

De même, préparez une coloration en coupe avec un seul fluorophore et un témoin négatif sans coloration afin de définir le spectre des fluorophores et l’autofluorescence tissulaire. Après avoir aspiré le mélange colorant, lavez le tissu trois fois avec du PBS, aspirez le liquide après chaque lavage. Montez l’échantillon sur le microscope pour l’imagerie.

Concentrez-vous sur l’échantillon en utilisant un mode de contraste en champ clair ou par interférence différentielle. Ensuite, passez en mode fluorescence et configurez les paramètres d’acquisition spectrale selon les exigences expérimentales. Attribuez les lasers appropriés aux fluorophores utilisés dans l’expérience.

Sélectionnez un séparateur de faisceau correspondant aux lignes laser choisies. Permettre à tous les détecteurs de capturer l’ensemble du spectre d’émission et ajuster la résolution d’acquisition de l’image à l’une des résolutions prédéfinies. Ou choisissez la résolution maximale.

Ajustez la taille du trou à une seule unité de surface pour une section optique optimale. Optimisez les réglages du laser avant l’acquisition. En utilisant une section colorée avec tous les marqueurs, démarrez le mode de balayage continu à faible puissance laser.

Ajustez le gain maître de chaque détecteur ainsi que les intensités laser jusqu’à ce que tous les marqueurs soient identifiables avec un bon rapport signal sur fond. Ajustez finement les intensités du laser et alternez itérativement entre sections à coloration unique et multi-coloration jusqu’à ce que tous les signaux fluorophores soient visibles sans sursaturation. Activez la fonction tuiles dans le logiciel d’acquisition et définissez la région d’acquisition des tuiles autour du tissu pour assurer une couverture complète de l’image.

Optimisez la focalisation de la région d’acquisition des tuiles au centre du tissu. Identifier une caractéristique structurelle unique, telle qu’un ensemble distinct de cellules dans une disposition reconnaissable, servant de référence pour l’alignement lors des cycles d’imagerie ultérieurs. Activez maintenant la fonction Z-stack et allez à l’onglet Z-stack.

Sous l’onglet central, réglez le nombre de tranches à au moins six avec un intervalle d’au moins un micromètre entre les tranches. Cliquez sur le bouton central pour définir le point de mise au point actuel déterminé à l’étape précédente comme la tranche centrale de la pile. Cliquez sur le bouton démarrer l’expérience pour lancer l’acquisition d’image.

Une fois l’acquisition terminée, faites un clic droit sur la vignette de l’image, sélectionnez Enregistrer sous le nom d’une image. Choisissez un emplacement de fichier et nommez l’image. Sauvegardez les données d’image dans un stockage sécurisé. Démélangez l’image en utilisant les mêmes réglages optimisés appliqués lors de l’acquisition de régions en tuiles.

Capturez un snap de chaque contrôle à coloration unique pour obtenir le véritable spectre du signal et du contrôle non coloré pour capturer le fond ou l’autofluorescence. Utilisez ces images exclusivement pour le démélange spectral. Confirmez que la région sélectionnée représente un signal véritable en vérifiant que l’intensité et la morphologie sont absentes ou équivalentes aux niveaux de fond dans le témoin non coloré et que la localisation des marqueurs correspond à son schéma cellulaire attendu, tel que la membrane, la distribution nucléaire, cytoplasmique ou sécrétée.

Ouvre l’image instantanée dans le logiciel. Cliquez sur l’onglet de démixage et sélectionnez l’un des outils de sélection de région sous l’onglet outils non mixés, dessinez une région d’intérêt ou un ROI autour du signal positif pour générer le spectre de cette région. Comparez chaque spectre généré au spectre théorique des émissions du fluorophore correspondant.

Assurez-vous que la région représente fidèlement le signal réel. Nommez chaque spectre selon l’identité du fluorophore, et enregistrez-le dans la base de données spectrale. Ensuite, chargez l’image en tuiles et ouvrez l’outil de démélange.

Utilisez le bouton plus pour ajouter les spectres de référence de chaque fluorophore à la liste de démélange. Cliquez sur le bouton de démélange linéaire pour séparer les signaux spectraux et sauvegarder l’image non mélangée. Préparez la solution de blanchiment dans une hotte à vapeur.

À l’aide d’une microspatule, peser 10 milligrammes de borohydrure de lithium directement dans un bécher sec. Ajoutez soigneusement 10 millilitres d’eau ultrapure dans le bécher et mélangez jusqu’à ce que le composé soit complètement dissous. Ajoutez environ 100 microlitres de la solution de blanchiment fraîchement préparée à chaque section de tissu à l’aide d’une pipette en verre Pasteur, puis faites couver les lames à température ambiante pendant 15 minutes dans la hotte à vapeur.

Si le violet brillant blanchisseur meurt, transférez soigneusement la lame dans un microscope épifluorescent et sélectionnez le filtre à feuilles. Concentrez l’échantillon et éclairez-le à pleine puissance. Utilisez maintenant un objectif 5X pour obtenir un champ d’éclairage plus large et abaissez complètement l’étage pour éviter tout contact entre la culasse et l’objectif ou le boîtier.

Enfin, décantissez la solution de borohydrure de lithium de chaque puits à l’aide d’une pipette en verre Pasteur et remettez la solution de blanchiment dans le bécher d’origine. Lavez les lames trois fois avec un tampon de dilution et faites incuber pendant environ trois minutes à chaque lavage. Ajoutez le mélange d’anticorps et colorez l’échantillon comme démontré précédemment.

Dans les polypes nasaux non traités, la coloration avec CD3, CD4 et CD20 a montré une fluorescence granulaire non spécifique intense dans les régions riches en éosinophiles. Alors qu’un véritable signal localisé par membrane était présent à une intensité plus faible. Le prétraitement avec du lait écrémé à 5 % n’a pas complètement bloqué la fluorescence non spécifique, et a également réduit l’intensité du signal pour le fluorophore tel que l’AF 532.

Le pré-traitement par dab a réduit la fluorescence non spécifique des CD20, CD3 et CD4, mais a également diminué l’intensité réelle du signal sur plusieurs canaux, dont DAPI et AF 532. Le prétraitement par héparine a efficacement bloqué la liaison non spécifique tout en maintenant une forte intensité de signal pour les CD3, CD4, CD20 et DAPI. L’héparine bloquait les signaux non spécifiques de manière dépendante de la concentration, avec une suppression complète obtenue à 10 unités et aucun effet néfaste observé à des concentrations plus élevées.

Un système d’imagerie à trois pistes a réduit le temps d’acquisition, mais a introduit la diaphonie incluant le passage de l’AF 594 dans le canal PE, et une autofluorescence tissulaire accrue grâce à de multiples excitations laser. L’imagerie spectrale a éliminé presque tout le fond et la diaphonie tout en réduisant le temps d’acquisition et en améliorant le rapport signal sur arrière-plan. L’imagerie spectrale IBEX d’un polype nasal humain a révélé des structures épithéliales marquées par EpCAM.

des cellules immunitaires telles que les lymphocytes positifs au CD3 et au niveau du CD20, ainsi que des vaisseaux exprimant le niveau CD31 et CD34. Le traitement à l’héparine éliminait la liaison des granules sans réduire le signal, maintenant une forte suppression du fond sur les cycles IBEX. Le démélange spectral réduit le débordement, l’autofluorescence augmente l’augmentation du signal au fond et accélère significativement l’acquisition multi-panneaux par rapport à la confocale multi-piste.

Cela permet une protéomique spatiale robuste et des tissus complexes permettant une cartographie précise de l’état cellulaire et une analyse au niveau du voisinage.