Progrès dans le profilage métabolique des sphéroïdes de tumeurs cérébrales tridimensionnelles pour le criblage de médicaments

La recherche vise à optimiser la formation des racines cellulaires en 3D pour étudier le métabolisme énergétique à l’aide de la technologie Seahorse, en se concentrant sur l’activité métabolique comportementale cellulaire et les réponses aux médicaments dans notre modèle cliniquement pertinent. Ces résultats amélioreront les modèles de moulage de médicaments en fournissant une représentation plus précise des tumeurs cérébrales, en améliorant l’évaluation du traitement et l’analyse métabolique pour de meilleures stratégies de traitement. Les résultats ont ouvert la voie à l’étude de la façon dont le métabolisme énergétique se modifie dans les modèles sphéroïdes 3D, de la façon dont les effets de sortie des médicaments sur les voies métaboliques et des mécanismes par lesquels les changements métaboliques contribuent au développement de la résistance tumorale au traitement.

Après avoir remis en suspension les cellules U87 collectées dans du DMEM, préchauffez le milieu inutilisé à 37 degrés Celsius. Maintenez les suspensions cellulaires à température ambiante pendant 30 minutes. Sur la base du nombre initial de cellules, diluez la suspension cellulaire avec du DMEM contenant 10 % FBS jusqu’à un volume final de 20 millilitres, assurant ainsi environ 200 000 cellules.

Mélangez soigneusement la suspension cellulaire finale par inversion répétée. Ajoutez lentement 200 microlitres de suspension le long du bord de chaque puits dans une plaque transparente à fond rond à fixation ultra-basse de 96 puits, puis scellez hermétiquement la plaque avec du Parafilm pour éviter les fuites pendant la centrifugation. Placez la plaque scellée dans la centrifugeuse et faites-la fonctionner à 200 G pendant deux minutes pour granuler les cellules au fond de chaque puits.

Retirez la plaque de la centrifugeuse. Retirez délicatement le Parafilm et placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Pour préparer une solution d’enrobage, dissolvez cinq milligrammes de Poly-D-Lysine dans 50 millilitres d’eau stérile et mélangez soigneusement la solution jusqu’à ce qu’elle soit complètement dissoute.

Ajouter 30 microlitres de la solution d’enrobage dans chaque puits de la plaque de dosage métabolique. Assurez-vous de l’absence de bulles en secouant doucement la plaque ou en aspirant l’excès de solution. Incuber la plaque avec le couvercle pendant 20 minutes à température ambiante, puis aspirer la solution d’enrobage et laver les puits deux fois avec 200 microlitres d’eau stérile.

Faites sécher la plaque à l’air libre pendant au moins 30 minutes, puis chauffez la plaque à 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone pendant 30 minutes pour stabiliser le revêtement. Ensuite, ajoutez 175 microlitres de milieu préchauffé dans chaque puits. Maintenez la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur sans dioxyde de carbone, jusqu’à ce qu’elle soit prête pour le transfert de sphéroïdes cellulaires.

Transférez les plaques sphéroïdes dans un système d’imagerie à haut contenu après cinq jours de culture. Pour configurer les paramètres d’imagerie, réglez la température sur 37 degrés Celsius et le niveau de dioxyde de carbone sur 5 %Ajustez le type de plaque, les canaux et la plage de mise au point sur les paramètres du système. Ensuite, acquérez des images de sphéroïdes à l’aide d’un microscope confocal avec des objectifs 10 fois et du logiciel d’imagerie, puis identifiez les puits contenant des sphéroïdes intacts et enregistrez leurs positions pour le transfert.

Répartissez les sphéroïdes intacts en deux groupes, un groupe témoin avec six puits répétés et un groupe témoin avec six puits répétés pour le traitement au fénofibrate. Préparez la solution de travail du fénofibrate dans un milieu frais préchauffé à la concentration optimale. Retirez avec précaution la plaque à faible fixation contenant le sphéroïde du système d’imagerie et placez-la sur une surface stérile à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité.

Placez la plaque de test recouverte de poly-D-Lysine à côté de celle-ci pour le transfert, puis coupez l’extrémité d’une pipette de 20 microlitres pour permettre une aspiration douce des sphéroïdes cellulaires sans causer de dommages. À l’aide de l’embout de pipette coupé, aspirez doucement chaque sphéroïde intact du fond de son puits. Transférez chaque sphéroïde dans le puits correspondant de la plaque revêtue et laissez-le se déposer pendant 20 secondes.

Transférez les plaques de dosage sphéroïde 3D dans un système d’imagerie à haut contenu. Pour analyser les données morphologiques, appliquez le module de région de texture pour séparer grossièrement les sphéroïdes 3D de l’arrière-plan en divisant le contenu de l’image en trois groupes basés sur les caractéristiques de texture. Appliquez le module de recherche de région d’image pour affiner la séparation des sphéroïdes 3D pré-isolés en utilisant des caractéristiques de taille basées sur le volume, en veillant à ce que les impuretés soient éliminées et que les sphéroïdes intacts soient conservés.

Mesurez les paramètres morphologiques des sphéroïdes 3D à l’aide du module de propriétés morphologiques. Appliquez le module de sélection de population pour filtrer et ne conserver que les sphéroïdes de cellules 3D authentiques, puis exportez les résultats des données morphologiques. Les sphéroïdes étaient visiblement formés au cinquième jour de culture, maintenant une morphologie sphérique uniforme sur tous les échantillons observés.

Un sphéroïde désintégré dont l’intégrité structurelle était visiblement perturbée a également été observé le cinquième jour. L’analyse post-transfert a révélé que les sphéroïdes 3D témoins et traités au fénofibrate sont restés intacts dans la plupart des cas, mais que certains sphéroïdes traités au fénofibrate étaient désintégrés. Le taux de consommation d’oxygène a été significativement réduit chez les sphéroïdes traités au fénofibrate à tous les points temporels par rapport au groupe témoin.