Modélisation des maladies mitochondriales à l’aide d’organoïdes cérébraux : un accent sur l’encéphalomyopathie mitochondriale, l’acidose lactique et les épisodes semblables à ceux d’un accident vasculaire cérébral

Le champ de notre recherche est de comprendre les mètres de maladies mitochondriales, et de trouver des médicaments pour les traiter. Le défi est de conserver la capacité pour des tests à haut débit, même si la technique contient la formation d’organoïdes. Pour commencer, retirez le milieu des plaques de culture pluripotente induite lorsqu’elles sont à environ 70 à 80 % de confluent.

Lavez les cellules avec du PBS. Ajoutez 350 microlitres de solution enzymatique aux cellules et incubez. Ajoutez 800 microlitres de substrat d’ajustement à tige pour arrêter la réaction.

Après avoir transféré la suspension de la cellule dans un tube frais, centrifugez-la à 190G pendant cinq minutes à 22 degrés Celsius. Ensuite, resuspendez le pellet dans un millilitre de milieu différencié. Après avoir compté les cellules, semez 3000 cellules dans 100 microlitres dans chaque puits d’une plaque d’attache basse en forme de U à 96 puits.

Incubez pendant six jours à 37 degrés Celsius, avec 5 % de dioxyde de carbone. Après l’incubation, utilisez une pipette à large calibre pour transférer les organoïdes de la plaque de 96 puits vers un plat de 10 centimètres. Pipeter 50 microlitres de milieu DMEM/F12 complété dans chaque puits d’une nouvelle plaque à 96 puits.

Collectez les organoïdes dans des tubes de deux millilitres. Retirez le milieu avec précaution sans aspirer les organoïdes, et ajoutez 1,5 millilitre de milieu DMEM/F12 complété. Après avoir pipeté le dernier lavage, ajoutez 500 microlitres de substrat frais.

Ensuite, transférez les organoïdes dans un plat de 10 centimètres. Ajoutez cinq millilitres de médium pour faciliter le choix de chaque organoïde. Transférez tous les organoïdes dans chaque puits d’une plaque de 96 puits à l’aide d’une micropipette réglée à 50 microlitres, puis incubez pendant trois jours.

Au neuvième jour, collectez les organoïdes dans des tubes de deux millilitres et lavez-les trois fois avec du DMEM/F12. Ensuite, resuspendez les organoïdes dans un milieu de différenciation. Transférez environ 10 organoïdes par puits dans une plaque de six puits et ajustez le volume final de milieu dans chaque puits à deux millilitres.

Cultivez la plaque statiquement pendant six jours à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Le 15e jour, recueillez les organoïdes dans des tubes de 15 millilitres. Après avoir laissé les tubes se stabiliser, ajoutez un nouveau milieu de différenciation complété en B27 et en vitamine A après avoir pipeté le surnageant.

Transférez environ 10 organoïdes par puits dans une plaque à six puits. Cultivez l’organoïde statiquement pendant 15 jours à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Enduit les plaques de culture avec la solution diluée de poly-L-Ornithine.

Incubez les plaques toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, lavez les puits trois fois pendant cinq minutes chacun avec PBS. Ajoutez maintenant une solution de laminine diluée aux puits.

Faites couver les plaques pendant trois heures à 37 degrés Celsius, ou toute la nuit. Centrifugez la suspension organoïde à 200G pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et ajoutez un millilitre de solution enzymatique.

Mélangez bien et incubez à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes avant de centrifuger. Après avoir retiré le surnageant et ajouté un millilitre de solution de dispersion, superposez soigneusement la solution d’isolation sous la suspension. Ensuite, centrifugez la suspension à 200G pendant cinq minutes.

Maintenant, pipettez un millilitre de milieu neuronal dans le tube. Mélangez la solution et faites passer la suspension à travers une tamoire de 70 micromètres dans un tube de 50 millilitres. Après avoir compté les cellules, semez la suspension cellulaire à une densité de 100 000 cellules par centimètre carré sur des plaques recouvertes de poly-L-Ornithine et de laminine.

Remplacez le médium tous les quatre à sept jours jusqu’au jour 60. Pour fixer les organoïdes pour l’immunofluorescence, il faut d’abord prélever les organoïdes dans des micro-tubes. Rincez les organoïdes avec du PBS, puis fixez les organoïdes dans du paraformoldéhyde à 4 % pendant 30 minutes à température ambiante.

Après fixation, lavez les organoïdes fixes trois fois avec du PBS. Conservez les organoïdes à quatre degrés Celsius jusqu’à utilisation. 30 jours après la sémination pour la culture neuronale 2D, retirez le milieu de culture des plaques.

Ensuite, lavez les cellules avec du PBS. Fixez les cellules avec du paraformodéhyde à 4 % pendant 15 minutes à température ambiante. Faites une pipette pour retirer le paraformeldéhyde, puis lavez les cellules avec du PBS trois fois.

Conservez les cellules fixes à quatre degrés Celsius jusqu’à utilisation. Pour collecter les organoïdes pour le RTQPCR, transférez-les dans des microtubes. Pipettez le PBS dans les tubes pour laver les organoïdes.

Ajoutez maintenant 350 microlitres de tampon de lyse aux organoïdes, puis congelez-les instantanément dans de l’azote liquide. Conservez les tubes à moins 80 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Des organoïdes cérébraux contenant des neurones positifs à FOXG1 ont été induits avec succès à partir de la ligne IPSC contrôle saine 414C2 au 30e jour, et des réseaux neuronaux cultivés en 2D ont été obtenus au 60e jour.

Les niveaux d’hétéroplasmie du variant M.3243A à G ont été confirmés par QPCR. Les lignes deux à huit présentaient une hétéroplasmie faible, et les lignes deux à six une hétéroplasmie élevée. Les organoïdes cérébraux issus de la lignée d’hétéroplasmie faible deux à huit présentaient des tailles et des morphologies similaires à celles des témoins sains.

Les organoïdes générés à partir de la raie d’hétéroplasmie élevée deux à six présentaient une taille réduite de 0,3 millimètre carré et une morphologie irrégulière avec une valeur de circularité de 0,82. La plupart des neurones induits à partir de la ligne 414C2 et des deux à huit lignes étaient positifs à FOXG1 aux jours 30 et 60. Les neurones positifs à FOXG1 étaient rarement détectés chez les organoïdes ou les neurones cultivés en 2D dérivés de la ligne deux à six.

Nos résultats suggèrent que les modèles organoïdes basés sur l’IPSC dérivés par le patient représentent une plateforme utile pour étudier les miroirs, les mécanismes et pour le dépistage de drogues. Nos méthodes conventionnelles, avec un temps de culture court et un rapport coût-efficacité, offrent des outils pratiques pour étudier la physiopathologie du MELIS. Nous souhaitons rechercher des médicaments potentiels pour le MELIS en utilisant des composés avec des patients administrés organisés à l’avenir.