Caractérisation de la sécrétion de vésicules extracellulaires dérivées des adipocytes à l’aide d’un modèle murin rapporteur CD63-GFP in vivo et in vitro

Nous étudions la vésicule extracellulaire dérivée des adipocytes, les EV, afin de définir leur rôle dans le tissu adipeux, en particulier la manière dont elles régulent la diaphonie entre les adipocytes matures et leurs cellules progénitrices. Il n’existe actuellement aucun système in vivo pour étudier les sécrétions des EV des adipocytes, et les protocoles de purification existants ne sont pas encore totalement optimisés. Pour commencer, utilisez une technique stérile pour exciser le tissu adipeux inguinal des souris euthanasiées.

Placez un gramme de tissu dans un tube de deux millilitres contenant 0,5 millilitre de tampon digestif. À l’aide de ciseaux stériles, hachez le tissu en morceaux d’un millimètre ne dépassant pas. Suspendre le tissu haché dans 10 millilitres de tampon de digestion contenant 0,5 milligramme par millilitre de Libérase et 50 unités par millilitre de DNase I. Incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius sur un shaker orbital.

Pendant l’incubation, inversez doucement le tube plusieurs fois. Lorsque la solution apparaît trouble et qu’aucun fragment de tissu visible ne subsiste, la digestion est terminée. Pour isoler la fraction vasculaire stromale ou SVF, diluez la suspension digérée avec deux volumes de tampon digestif.

Inversez doucement le tube trois à quatre fois pour bien mélanger. Faites passer la suspension à travers un filtre stérile de 100 micromètres pour retirer les tissus non digérés, puis centrifugez le filtrat à 300 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Étiquetez la pastille comme SVF.

Incubez la fraction vasculaire stromale dans un tampon de lyse des globules rouges fraîchement préparé sur glace pendant cinq minutes, protégé de la lumière. Ajoutez deux volumes de tampon de lavage et centrifugez à 400g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Résuspendez la fraction vasculaire stromale dans 80 microlitres de tampon par gramme de tissu et transférez le contenu dans un nouveau tube.

Ajoutez 20 microlitres de cocktail d’appauvrissement des progéniteurs non adipocytaires par gramme de tissu. Faites éclore l’échantillon pendant 15 minutes à deux à huit degrés Celsius dans l’obscurité. Faites passer l’échantillon dans une colonne LS et collectez le flux contenant la fraction cellulaire négative pour la lignée.

Centrifugez le débit à 300 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour obtenir les cellules progénitrices des adipocytes. Incubez 250 microlitres de souris progénitrices isolées des adipocytes de souris sur des lames à huit puits recouvertes de collagène pendant six heures. Fixez les cellules avec du paraformodéhyde à 4 % pendant 10 minutes pour préserver les structures vésiculaires cellulaires et extracellulaires pour l’imagerie.

Ensuite, lavez les lames trois fois avec du PBS, puis montez avec un medium anti-décoloration. Ensuite, après avoir compté les cellules progénitrices des adipocytes, suspendez-les et diluez le colorant de viabilité. Incubez sur la glace pendant 20 minutes, protégés de la lumière.

Lavez les cellules une fois avec un tampon de lavage et une centrifugeuse. Suspendez les cellules dans un tampon de coloration brillante afin que la concentration finale soit de 1 million de cellules pour 100 microlitres. Bloquez la liaison non spécifique en ajoutant un réactif bloqueur des récepteurs Fc à un rapport de 1 pour 100 et incubez.

Faites tourner librement l’anticorps SCA-1 à 6000g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Ajoutez l’anticorps SCA-1 au tube APC à une dilution de un à 100, puis placez le tube sur de la glace, protégé de la lumière. Lavez les cellules deux fois avec un millilitre de tampon de lavage, puis centrifugez à 300 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Suspendez les cellules dans un tampon de lavage pour le tri de cytométrie en flux, puis acquérez les données pour les cellules SCA-1 et GFP positives sur un cytomètre à flux spectral équipé d’un laser violet et bleu. Pour commencer la différenciation, enrobez les plats de gélatine à 0,2 %, pendant 30 minutes à température ambiante. Semez les APC fraîchement isolés dans un milieu DMEM/F12 complété et incubez jusqu’à la confluence.

Remplacez le milieu du premier au huitième jour par un milieu de différenciation adipogénique MesenCult. Au neuvième jour, lavez les adipocytes deux fois avec du PBS, puis remplacez le milieu par un milieu de culture d’adipocytes matures contenant du DMEM à 1 % BSA et 0,2 % de Primocine. Pour isoler les vésicules extracellulaires sécrétées par les adipocytes, il faut d’abord passer 15 millilitres de milieu de culture à travers un filtre de 40 micromètres, suivi d’un filtre de 30 micromètres.

Centrifugez le filtrat à 500g pendant cinq minutes, puis centrifugez le surnageant à 2000g pendant 10 minutes pour éliminer les cellules résiduelles et les débris. Après avoir fait passer le surnageant obtenu à travers un filtre de 0,8 micromètre et transféré le filtrat dans une unité d’ultrafiltration de 15 millilitres, centrifugez à 4000 g pendant 15 minutes pour concentrer le milieu. Chargez l’échantillon concentré sur une colonne de chromatographie d’exclusion de taille reliée à un collecteur automatique de fractions et collectez les fractions F1 à F8.To effectuez une analyse Western blot, concentrez chaque fraction de 400 microlitres à 25 microlitres.

Pipettez 50 microlitres de tampon d’immunoprécipitation radio complétés avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase au concentré. Ajouter 75 microlitres de deux tampons de chargement SDS 2X pour dénaturer l’échantillon et résoudre les protéines sur un gel de tris-glycine de 4 % à 12 %. Pour l’analyse du suivi des nanoparticules, diluez les échantillons de vésicules extracellulaires avec du PBS stérile filtré à 0,1 micromètre et mélangez doucement.

Chargez l’échantillon dilué dans l’instrument NTA équipé d’une caméra semi-conductrice complémentaire scientifique à oxyde métallique à haute sensibilité et d’un laser vert de 532 nanomètres. Régler la détection des particules entre 10 nanomètres et 1 000 nanomètres, et avec une concentration de 10 à six à 10 à neuf particules par millilitre. Les cellules progénitrices adiposes provenant de souris stop-flock/CD63GFP n’ont montré aucun puncta protéique fluorescent vert détectable sous microscopie confocale.

Alors que les cellules des souris AdipCD63 présentaient de nombreux points protéiques fluorescents verts distincts dans tout le cytoplasme. L’analyse de cytométrie en flux a montré que 1,2 % des cellules positives du crâne 1 chez les souris rapporteures exprimaient une protéine fluorescente verte, contre 12,6 % chez les souris AdipCD63-GFP. Le blot Western des fractions chromatographies d’exclusion de taille a montré que les marqueurs vésiculaires extracellulaires CD63 et HSP70 étaient enrichis dans les fractions F1 et F2. Alors que les marqueurs du réticulum endoplasmique et des mitochondries étaient absents, confirmant la pureté vésicale.

L’analyse du suivi des nanoparticules a révélé que les vésicules extracellulaires dérivées des adipocytes variaient en taille de 50 à 500 nanomètres, et la microscopie électronique de transmission a confirmé que les vésicules présentaient des structures à double membrane intactes. Western blot confirmé : knockout de STX4 dans les adipocytes. La microscopie confocale a montré que les vésicules CD63-GFP positives étaient dispersées dans tout le cytosol dans les adipocytes de type sauvage, mais s’accumulaient près de la membrane plasmique dans les adipocytes knockout STX4.

La concentration de vésicules extracellulaires dérivées d’adipocytes sécrétées a été significativement réduite dans les adipocytes knockout STX4 par rapport aux types sauvages. Western blot de quantités égales de protéines de vésicules intracellulaires a montré une expression réduite de CD63 et CD81 dans les adipocytes knockout STX4 par rapport au type sauvage. Le protocole fournit un système robuste et reproductible pour étudier la sécrétion des EV des adipocytes in vivo et in vitro, ainsi qu’une méthode optimisée de purification des EV des adipocytes.

Le protocole décrit et valide pour la première fois l’utilisation de centrifugations sérielles à basse vitesse combinées à la chromatographie d’exclusion de taille pour purifier les EV dérivés d’adipocytes matures. Nos résultats nous permettent de poser de nouvelles questions sur la manière dont les adipocytes utilisent les vésicules extracellulaires pour communiquer avec d’autres types cellulaires dans des conditions physiologiques et pathologiques.