Imagerie spectroscopique à super-résolution des molécules d’ADN utilisant le contraste intrinsèque

Nos recherches présentent le premier protocole pour mesurer les spectres fluorescents intrinsèques des molécules d’ADN, permettant d’étudier leurs propriétés optiques natives et les caractéristiques liées à la confirmation de séquences. Ce protocole exploite la fluorescence endogène pour l’imagerie spectroscopique de l’ADN, évitant ainsi la perturbation induite par le marquage, l’erreur de liaison et la densité de marquage incohérente dans les méthodes existantes. Pour commencer, dissolvez l’échantillon d’ADN dans de l’eau déionisée sans nucléase jusqu’à une concentration finale de 100 millimolaires.

Préparez cinq aliquotes de microlitres de la solution ADN pour minimiser les cycles répétés de gel-dégel. Conservez les tubes supplémentaires contenant la solution d’origine à 4 degrés Celsius. Avec une lingette de laboratoire, nettoyez doucement une lame en verre.

Pipeter cinq microlitres de la solution d’ADN de 100 millimolaires sur la lame en verre fraîchement nettoyée et laisser sécher l’échantillon pendant une à trois heures pour former un gel d’ADN. Dans une hotte à fumée, préparez soit le tampon bêta-mercaptoéthanol, soit le tampon d’imagerie DABCO pour permettre le photocommutation stochastique des molécules d’ADN. Pipettez cinq microlitres du tampon d’imagerie sur le gel d’ADN et placez une gaine de couverture sur l’échantillon.

Si des bulles sont présentes à l’intérieur de l’échantillon couvert, utilisez une pince à épiler pour les retirer. Obtenir un réseau de nanotrous fabriqué contenant des trous de 100 nanomètres de diamètre, espacés de quatre micromètres, disposés en huit rangées et cinq colonnes. Allumez le système sSMLM et insérez des filtres à bande passante étroite directement devant la caméra.

Placez l’échantillon d’étalonnage sous un microscope et allumez la lampe du microscope pour éclairer l’échantillon. Réglez le temps d’exposition à 200 millisecondes pour tous les filtres, mais changez-le à 2 000 millisecondes pour le filtre de 750 nanomètres. Va dans Acquisition et Fast Time Lapse pour ajuster le nombre d’images à 10 pour chaque filtre.

Après étalonnage, chargez l’échantillon de gel d’ADN sur la scène du microscope avec le couvercle face à l’objectif et ouvrez le logiciel de la caméra pour l’acquisition des données. Identifiez la position Z appropriée à l’aide du système automatique de suivi de la mise au point et ajustez la mise au point jusqu’à ce que des clignotements stochastiques clairs soient visibles. Veillez à ce que l’objectif ne touche pas le bord de glissement du couvercle afin d’éviter toute fuite de tampon dans l’huile d’immersion et toute interférence avec le suivi.

Acquérir environ 10 000 à 30 000 images avec la puissance d’éclairage désirée et un temps d’exposition de 30 millisecondes. Après l’acquisition des données, autorisez le logiciel à sauvegarder les données au format ND2 par défaut. Jetez la lamelle en verre dans une poubelle agréée destinée aux objets cassés ou tranchants.

Jetez tous les tampons restants dans le contenant désigné pour déchets chimiques liquides conformément aux directives de sécurité institutionnelles. Ouvrez Fiji et utilisez le plugin bio formats pour charger la pile d’images brutes acquises de l’échantillon d’ADN. Sélectionnez l’image suivie de piles, Z Project, et sélectionnez l’intensité minimale comme type de projection pour générer la projection minimale de la pile d’images brutes.

Sélectionnez le calculateur d’image et soustrayez la projection minimale de la pile d’images brutes. Enregistrez le jeu de données soustrait en arrière-plan sous forme de fichier TIF pour l’analyse spectrale. Ensuite, effectuez l’identification de localisation sur la pile d’images brutes d’ordre zéro à l’aide du plugin ThunderSTORM version 1.3.

Fixez le seuil à 1,2 fois l’onde d’écart-type. F1, ajustant le rayon à trois, et sigma à 1,5 pour reconstruire l’image d’ordre zéro et extraire les coordonnées des événements d’émission. Pour la pile d’images brutes d’ordre zéro recadrée, sélectionnez le plugin suivi de ThunderSTORM et lancez l’analyse.

Utilisez Fiji et le logiciel open source RainbowSTORM avec MATLAB version plus récente que 2020b pour traiter les données d’étalonnage et obtenir la relation entre les décalages horizontaux et verticaux ainsi que les longueurs d’onde. Effectuez l’identification de localisation sur les images d’étalonnage des cinq longueurs d’onde à l’aide du plugin ThunderSTORM. Fixez le seuil à cinq fois l’écart-type de l’onde.

F1, rayon d’ajustement à trois, et sigma à 1,5 pour reconstruire les localizations de nanotrous à l’ordre zéro et les localisations spectrales correspondantes au premier ordre. Obtenez une image moyenne de chaque donnée d’étalonnage et ajustez le seuil dans une plage de cinq à dix fois l’onde d’écart-type. F1 jusqu’à 80 localisations sont obtenues pour chaque image d’étalonnage.

Exécutez RainbowSTORM et cliquez sur parcourir dans calibration spectrale pour charger les fichiers CSV pour chaque longueur d’onde d’étalonnage. Ensuite, cliquez sur sauvegarder le fichier de calibration pour stocker le fichier de calibration. Utilisez un script Python personnalisé version 3.11.7 pour extraire les données complètes.

Ensuite, définissez les chemins de fichiers corrects dans le script Python pour la pile d’images soustraites en arrière-plan au format TIF de l’étape précédente de soustraction en arrière-plan. Définir le chemin du fichier pour le fichier CSV de localisation produit à partir de l’étape d’analyse de localisation et le fichier d’étalonnage au format MAT généré à partir de l’étape d’étalonnage. Ensuite, on règle le décalage horizontal à 925 à 984 pixels pour les données de 532 nanomètres acquises avec un DWP 3D correspondant à une fenêtre spectrale de 525 à 750 nanomètres pour assurer une couverture au-delà de la plage de filtre de 590 à 650 nanomètres.

Ajustez le décalage vertical à 23 pixels pour les données de 488 nanomètres et 532 nanomètres acquises avec le DWP 3D en fonction de la courbe d’étalonnage spectrale obtenue avec RainbowSTORM. Enfin, linéariser le spectre non linéaire en utilisant un ajustement polynomial d’ordre troisième pour une analyse ultérieure de comparaison et de classification. L’étalonnage spectrale a été effectué, permettant de mesurer les décalages de pixels horizontaux et verticaux correspondants entre les images du premier ordre et du premier ordre.

Cela permettait de cartographier une courbe d’étalonnage entre la position des pixels et la longueur d’onde. Les spectres d’émission non linéaires et convertis sous excitation de 532 nanomètres ont été obtenus pour l’alter GC, qui désigne un type de molécule d’ADN double brin. La courbe verte représentait le spectre moyen.

Les spectres d’émission linéaires non linéaires et convertis de l’A10C10, un type de molécule d’ADN simple brin, ont été obtenus sous excitation de 488 nanomètres, la courbe bleue représentant le spectre moyen. Ce protocole permet aux chercheurs de mesurer les spectres fluorescents intrinsèques de molécules d’ADN synthétisées à simple et double brin grâce à l’imagerie spectroscopique à super résolution. Localiser précisément la bonne position Z est crucial, car les échantillons de gel d’ADN manquent d’informations structurelles et nécessitent une attention attentive pour observer les clignements stochastiques.

Les travaux futurs pourront s’étendre à la mesure de la fluorescence intrinsèque de l’ARN et de la protéine, en intégrant des modèles informatiques pour la prédiction de séquences et l’imagerie de la chromatine libre de marquement.