In Vitro Analyse fonctionnelle des lymphocytes T régulateurs : accent sur la prolifération et la différenciation

Notre laboratoire a étudié la différenciation des sous-ensembles des lymphocytes T, son métabolisme et ses interactions. Le Trog affecte la diaphonie des cellules T, maintient l’homéostasie immunitaire, rendant la recherche sur le Trog cruciale pour traiter les maladies auto-immunes et inflammatoires. Les tests traditionnels de suppression Treg in vitro ont négligé les effets médiés par Treg et la différenciation des lymphocytes T effecteurs.

Ce protocole modifié évalue simultanément la prolifération et la polarisation. Pour commencer, préparez les lymphocytes T naïves, les cellules régulatrices enrichies en T ou Treg, et les cellules non CD4 positives enrichies en cellules présentatrices d’antigènes. Centrifugez la suspension naïve CD4-positive en cellules T à 350G pendant sept minutes à quatre degrés Celsius et jetez le surnageant pour obtenir la granule cellulaire.

Diluez le colorant de prolifération cellulaire eFluor 450 dans PBS pour obtenir une concentration de 20 micromolaires à température ambiante. Ajouter 0,5 millilitre de PBS par un fois 10 à la puissance de sept cellules du tube. Gardez le tube incliné à environ 45 degrés et resuspendez doucement les cellules en les pipettant 50 fois.

Ensuite, ajoutez rapidement un volume égal de la solution de colorant de prolifération cellulaire dans la suspension cellulaire pour obtenir une concentration finale de 10 micromolaires. Maintenez le tube à un angle de 45 degrés et pipettez les cellules pour les mélanger soigneusement avec le colorant de prolifération cellulaire. Enroulez immédiatement le tube de centrifugeuse dans du papier aluminium pour éviter toute exposition à la lumière.

Incubez à température ambiante pendant 20 minutes tout en les faisant légèrement vortexer toutes les cinq minutes pour éviter l’agrégation cellulaire. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de milieu de culture cellulaire pré-refroidi au tube centrifugeuse et faites doucement un vortex sur les cellules pour terminer la coloration. Ensuite, centrifugez les cellules et jetez le surnageant.

Pour laver les cellules, ajoutez cinq millilitres de milieu de culture cellulaire pré-refroidi au pellet cellulaire. Répétez la centrifugation et remettez la pellete en suspension dans cinq millilitres de milieu de culture. Après le comptage cellulaire, centrifugez les cellules et resuspendez dans un volume approprié de milieu de culture pour atteindre une concentration cellulaire de deux fois 10 à la puissance de six cellules par millilitre.

Garde le tube sur la glace. Calculez le nombre d’échantillons nécessaires à la culture cellulaire. Préparez une quantité appropriée de milieu de culture cellulaire contenant 2,5 microgrammes par millilitre d’anticorps anti-souris CD3 ou les cytokines d’induction appropriées.

Prenez des lymphocytes T naïfs préparés et des cellules enrichies en Treg et transformez-les en vortex. Ajoutez 100 microlitres de cellules T naïves positives CD45,2, CD4 positives et 100 microlitres de cellules non CD4 positives enrichies par APC positives CD45,1 à la plaque à 48 puits. Transférer 100 microlitres de cellules enrichies en Treg positif CD45.1, positif CD4, CD25 positif dans les puits expérimentaux et 100 microlitres de milieu de culture cellulaire dans les puits témoins.

Ensuite, on pipete 100 microlitres de milieu de culture contenant l’anticorps anti-souris CD3 et 100 microlitres de milieu de culture contenant les cytokines d’induction appropriées dans chaque puits. Ajoutez du PBS dans les puits vides restants pour maintenir l’humidité de la plaque et réduire les effets de bord. Incubez la plaque à 48 puits dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant trois jours.

Pipettez doucement les cellules cultivées pour les resuspendre et transférez la suspension cellulaire dans un tube centrifugeuse de 1,5 millilitre. Centrifugez les cellules et retirez le surnageant. Ajoutez 500 microlitres de milieu de culture cellulaire contenant du phorbol 12-myristate 13-acétate, de l’ionomycine et un inhibiteur du transport protéique GolgiPlug dans chaque tube.

Un vortex délicat pour resuspendre les cellules et les incuber dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Après centrifugation, ajoutez 50 microlitres de PBS contenant un test de colorant jaune zombie et 1:100 dilué d’anticorps anti-souris CD16 ou 32 au pellet. Manipulez les échantillons en vortex et incubez à température ambiante dans le noir pendant 15 minutes pour marquer les cellules mortes et bloquer les récepteurs FC.

Centrifugez les cellules avant de jeter le surnageant. Ajoutez 50 microlitres de cocktail d’anticorps de surface à l’échantillon, faites-le passer en vortex, puis incubez-le à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pendant 20 minutes. Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence ou FACS à chaque tube centrifugeuse.

Après centrifugation et retrait du surnageant, ajoutez 300 microlitres de solution de fixation et de perméabilisation à chaque tube de centrifugeuse et faites un vortex sur les échantillons. Écouver les échantillons à quatre degrés Celsius dans le noir pendant 20 minutes. Transférez un millilitre de perméabilisation et un tampon de lavage vers chaque tube centrifugeuse, suivis de centrifugation et de retrait du surnageant.

Après avoir répété le lavage, ajoutez 50 microlitres de cocktail d’anticorps cytokines à chaque échantillon et faites un vortex sur les échantillons. Écouver les échantillons à quatre degrés Celsius dans le noir pendant 40 minutes. Lavez chaque échantillon avec un millilitre de perméabilisation et de tampon de lavage.

Centrifugez les cellules et retirez le surnageant. Resuspendez la pellete cellulaire dans 300 microlitres de tampon FACS. Mesurer la prolifération et la différenciation des lymphocytes T répondeurs par cytométrie en flux.

Verrouillez la population lymphocytaire parmi les cellules totales pour exclure les débris cellulaires et les impuretés. Sélectionnez la population cellulaire unique parmi les lymphocytes en fonction des signaux de diffusion. Ensuite, identifiez la population de cellules vivantes parmi les cellules individuelles, suivie de la population de cellules T CD4 positives parmi les cellules vivantes.

Ensuite, on peut mettre la population enrichie en cellules T régulatrices CD45.1 positives et la population de lymphocytes T effecteurs CD45.2 positifs parmi les cellules T CD4 positives. Ensuite, sélectionnez les cellules T helper 1 positives à l’interféron 45,2 positif au CD4, les cellules helper T positive au CD45,2 positif au CD44 positif au CD45,2 et les cellules T positives au CD45,2 non proliféré parmi les lymphocytes T positifs au CD45,2 positif au CD45,2. Effectuer l’acquisition des données par cytométrie en flux pour tous les échantillons.

Enfin, analysez les données de cytométrie en flux avec le logiciel FlowJo en utilisant la même stratégie de guidage que pour l’acquisition des données en cytométrie en écoulement. La fréquence des lymphocytes T répondeurs non proliférés a été significativement augmentée sous les conditions d’induction de T helper 1 et T helper 17 après co-culture avec des cellules T enrichies en cellules T régulatrices. La différenciation des cellules interféron gamma positives CD45.2, interféron positif CD4 positive, et cellules T helper 1 positives a été significativement supprimée après co-culture avec des cellules T enrichies en régulateurs.

La fréquence des cellules auxiliaires T positives CD45,2 et interleukine-17A positives CD4 positives à 17 cellules auxiliaires a augmenté lorsque les lymphocytes T répondants ont été cultivés avec des cellules enrichies régulatrices en T. L’analyse fonctionnelle in vitro des cellules Treg permet d’étudier les effets biodirectionnels entre les lymphocytes Treg et les lymphocytes T effecteurs sur la prolifération et la polarisation. Le plus grand défi lors de la mise en œuvre de ce protocole est de maintenir la viabilité des cellules tout en assurant la pureté des cellules Treg et des lymphocytes T naïfs.

À la suite de ce processus, ELISA et d’autres tests biomédicaux peuvent évaluer la production de cytokines et d’effecteurs métaboliques tandis que les cellules triées par FACS permettent l’analyse en aval de l’ARN-seq et de la protéomique.