Un dosage de la chromatine pour les tissus du cerveau humain

Jusqu'à récemment, les études d'expression sur le cerveau humain ont été limités à la quantification de l'ARN ou les protéines. Avec les techniques d'immunoprécipitation de chromatine décrites dans ce document, il sera possible de cartographier la méthylation des histones et d'autres régulateurs épigénétiques de l'expression des gènes dans le cerveau post-mortem.

Bonjour, je m’appelle Amish Matan et je viens du laboratoire du Dr Sha Mc Barian ici dans le département de psychiatrie de la faculté de médecine de l’UMass. Aujourd’hui, je vais vous montrer une procédure d’immunoprécipitation de la chromatine dans le tissu cérébral humain post-mortem. Bien que la procédure suivante ne soit pas très compliquée.

Ce qui est le plus excitant, c’est que jusqu’à récemment, les études d’expression dans le cerveau humain se limitaient à une simple quantification de l’ARNm et des protéines. Cette technique particulière nous donnera une meilleure compréhension de la base mécaniste de l’expression des gènes dans le cerveau humain normal et malade. Alors commençons : Pour immunoprécipiter la chromatine.

Nous avons commencé par des tissus cérébraux humains post-mortem congelés préalablement disséqués. Il est important d’utiliser des lunettes de sécurité et de travailler dans une zone désignée pour traiter les tissus humains. Lors du traitement de ces échantillons, le tissu cérébral est abattu avec cinq fois le volume cérébral du tampon de descente.

Une fois que tout le tissu semble être devenu homogène dans la solution, nous pouvons le transférer dans un tube de deux mil après que le tissu ait été homogénéisé. Ajouter cinq unités par mil de nucléase micrococale à l’échantillon et mélanger la solution en pipetant de haut en bas. Ensuite, placez-le sur de la glace.

Il est important de faire le pas rapidement. Étant donné que la micro nucléase cocale a la capacité d’agir même à quatre degrés Celsius. Une fois que tous les échantillons ont été traités avec une nucléase micrococale, nous passons rapidement au bain-marie à 37 degrés Celsius et incubons les échantillons pendant sept minutes.

Après l’incubation de sept minutes, nous ajoutons 0,5 molaire d’EDTA à une concentration de 10 millimoles pour arrêter l’activité des nucléases micro-cocales. Nous sommes maintenant prêts à passer à l’étape de l’isation. Après avoir traité la nucléase micrococale, nos échantillons contenant notre ADN nucléosomal commenceront.

Nava prendra un tube Falcon de 15 mil dans lequel nous ajouterons 4,5 mils d’EDTA de 0,2 millimolaire, 2,5 microlitres de bénadine de 0,2 molaire et 4,5 micros de PMSF de 0,1 molaire dans ce tube. Nous allons transférer notre échantillon. Maintenant, nous incubons notre échantillon pendant une heure sur de la glace tout en le vortex toutes les 10 minutes.

À la fin de l’incubation d’une heure, nous ajouterons 2,5 microlitres de DTT à trois molaires. L’échantillon est à nouveau un vortex, puis il est centrifuger dans un rotor à godets oscillants à 3, 175 RCF pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, le surnageant est distribué, de sorte que 500 microlitres sont utilisés comme contrôle d’entrée, qui ne contiendrait que de l’ADN génomique, et le reste est divisé en deux tubes contenant chacun 1 600 microlitres d’échantillon, qui seront nos échantillons d’immunoprécipitation de la chromatine.

La commande d’entrée est placée à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit jusqu’à une utilisation ultérieure. Ensuite, nous ajoutons 160 microlitres de 10 XFSB un 10e du volume de notre échantillon. Avec lui, nous ajoutons quatre microgrammes d’anticorps.

Maintenant, vortex les échantillons, puis faites-les pivoter à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Après l’incubation d’une nuit, nous laverons les protéines qui seront utilisées pour isoler notre ADN nucléosomal. Comme ces perles agricoles sont très sensibles, il est nécessaire de couper les têtes des pointes de pipette lorsque vous travaillez avec elles.

Il s’agit de s’assurer que les billes ont plus d’espace lors du pipetage. Ajoutez maintenant 1,6 mils d’une perle XFS à 245 microlitres de jaguars protéiques dans un micro tube de centrifugation de deux mils. Cela devrait suffire pour quatre tubes d’échantillon.

Ensuite, séparez la solution de billes en deux tubes de deux mil et remplissez chacun jusqu’à 1,6 mil avec un XFSB. Faites pivoter les tubes à température ambiante pendant 30 secondes sur un rotateur, puis centrifugez-les à 0,1 RCF pendant 30 secondes. Après la centrifugation, retirez l’ATE à l’aide d’un aspirateur.

Ajouter 1,6 mils d’un XFSB. Une fois de plus, faites pivoter les échantillons pendant 30 secondes sur un rotateur, puis centrifugez-les à nouveau à 0,1 RCF FS pendant 30 secondes. Après la centrifugation, nous retirons le surnageant une fois de plus et combinons les deux tubes avec 1,5 mils d’un XFSB.

Ajoutez également 15 microlitres d’ADN de sperme. Tournez maintenant à température ambiante pendant 30 minutes, puis centrifugez à 0,1 RCF pendant 30 secondes. Retirez le surnageant et ajoutez 200 microlitres d’un XFSB.

Ajoutez maintenant 90 microlitres d’agro vitesses dans chaque échantillon de précipitation de chromatine, puis faites-les pivoter à quatre degrés pendant une heure. Pour un contrôle négatif, ajoutez un mils d’un XFSB dans les vitesses d’acro restantes et faites-le pivoter avec l’échantillon d’immunoprécipitation de la chromatine à quatre degrés Celsius pendant une heure. Au cours de l’incubation d’une heure, nous pouvons en profiter pour créer un nouveau tampon de résolution.

Cela sera utilisé plus tard dans l’expérience après l’heure. Le centre d’incubation présente les échantillons et le témoin négatif à 0,1 CFS pendant 30 secondes et jette le surnageant. Ensuite, nous laverons les billes avec quatre types de solutions de lavage différentes, un tampon de lavage à faible teneur en sel, un tampon de lavage à haute teneur en sel, une solution de chlorure de lithium et enfin, un tampon TE à pH huit.

Pour chaque tampon, à l’exception de la solution de chlorure de lithium, nous ferons pivoter les échantillons pendant trois minutes à température ambiante, puis nous les centrifugerons à 0,1 R C pendant 30 secondes. Pour le lavage au chlorure de lithium, faites pivoter les échantillons à température ambiante pendant une minute seulement. Après chaque lavage, jetez le supinate et à l’aide d’un aspirateur.

Nous sommes maintenant prêts à éluer nos échantillons. Pour commencer l’étape d’élution, nous ajoutons 250 microlitres de tampon d’élution fraîchement préparé à chaque échantillon. Faites pivoter les échantillons pendant 15 minutes à température ambiante, puis centum à 0,4 FCR pendant une minute.

Enregistrez maintenant le surnageant dans un tube orang de deux mils. Ajoutez ensuite 250 microlitres de tampon d’évolution à chaque échantillon. Encore une fois, vortexez-les tous à la main pendant quelques secondes.

Ensuite, faites tourbillonner les échantillons pendant 15 minutes après avoir tourbillonné pendant 15 minutes, faites tourner les tubes dans la centrifugeuse. Ajoutez 16 RCF pendant quatre minutes et conservez le snat dans le même tube torique à deux frais. Pour digérer la protéine dans nos échantillons, ajoutez d’abord 10 microlitres de DTA A de 0,5 molaire, 25 microlitres de HCL L à un pH de 6,5 et 2,5 microlitres de 10 milligrammes de protéinase K à chaque échantillon d’immunoprécipitation de la chromatine.

À côté de chaque commande d’entrée, ajoutez 15 microlitres de tampon de lyse et 2,5 microlitres de 10 milligrammes par ml. La protéinase K incube à la fois des échantillons d’entrée et d’immunoprécipitation de la chromatine à 52 degrés Celsius pendant au moins trois heures. Maintenant que l’incubation de trois heures est terminée, nous pouvons continuer et commencer l’extraction du phénylchloro Fromm.

Après l’incubation de trois heures, nous ajoutons 500 microlitres de phénylchloro fromm à chaque échantillon. Cela se fait dans la cagoule en raison du fait que le phényl chloroforme est un produit chimique organique qui est à la fois nocif s’il entre en contact avec la peau et également inhalé. Ensuite, nous vortex tous les échantillons pendant plusieurs secondes et les centrifugons à 13 RCF pendant cinq minutes après la centrifugation.

Il doit y avoir deux phases présentes à l’intérieur des tubes. Comme nous sommes intéressés par le contenu de la phase supérieure, nous allons retirer la phase supérieure et la mettre dans un tube de micro-centage de deux mils. Ensuite, un mélange de deux microlitres de glycogène et de 50 microlitres d’acétate de sodium à trois molaires est ajouté à chaque échantillon avec 1,375 mils d’éthanol à cent pour cent.

Tous les échantillons sont utilisés vigoureusement et placés à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit. Après l’incubation d’une nuit, les échantillons sont placés sur de la glace pour dégeler. Il s’agit d’une centrifugeuse dense à 15 RCF pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Après la centrifugation, retirez délicatement le SUP natin sans déranger la pastille au fond du tube. Ensuite, ajoutez un mil d’éthanol froid à 75 % à chaque échantillon et retournez-les quatre à six fois. Les tubes sont ensuite à nouveau centrifs à 18 RCF pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Le surnageant est à nouveau éliminé et les granulés sont laissés sécher à l’air. Une fois que les granulés sont secs, ils sont dissous dans 50 microlitres de HCL à l’état de traces millimolaires de PH huit et sont stockés à moins 80 degrés Celsius. Jusqu’à ce que vous l’utilisiez davantage, eh bien, je viens de vous montrer comment faire des immunoprécipitations de chromatine sur du tissu cérébral humain post-mortem congelé.

Et rappelez-vous, lors de cette procédure, il est important de prendre toutes les précautions nécessaires lorsqu’il s’agit de tissu cérébral humain, la chromatine, les tests d’immunoprécipitation peuvent être utilisés pour ajouter une couche supplémentaire de compréhension de l’expression des gènes dans le cerveau humain normal et malade. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.