Name: Un dosage de la chromatine pour les tissus du cerveau humain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-21T19:19:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Découvrez une technique de chromatin immunoprecipitation pour les tissus cérébraux humains post-mortem. Cette méthode permet d'analyser la méthylation des histones et la régulation épigénétique de l'expression génique dans le cerveau normal et pathologique.

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Ce travail a été soutenu par une subvention du National Institute of Mental Health (5R01MH071476).

Procédure: 1 er jour 1. Homogénéiser 50-500 mg de tissu congelé matières post-mortem gris avec Douncing Tampon. ! ATTENTION - Les tissus humains doivent être manipulés avec soin dans des conditions de sécurité strictes. Il doit être manipulé à des normes de sécurité BSL-2 ou supérieur. <ol><li> Prenez précédemment disséqué, post-mortem du cerveau de -80 ° C, les Dounce de volume du cerveau de tampon 5X Douncing, et les placer dans le tube 2,0 ml microtubes. Matched échantillon et le contrôle des paires sont traitées simultanément. </li></ol> 2. Micrococcal nucléase (MN) Digestion <ol><li> Ajouter 5U/mL des Micrococcal nucléase à l&#39;échantillon et mélanger dans la solution par aspiration et refoulement avant de placer sur la glace. * ÉTAPE CRITIQUE - Il est important de faire cette étape rapidement car MN a la capacité d&#39;agir, même à 4 ° C. </li><li> Incuber les échantillons pendant 7 minutes à 37 ° C. </li><li> Après l&#39;incubation 7 minutes, ajouter 0,5 M EDTA à une concentration de 10 mM d&#39;arrêter l&#39;activité MNase. </li></ol> 3. Hypotonisation <ol><li> Placer les échantillons dans un tube Falcon de 15 ml. Ajouter 10X le volume d&#39;échantillon de 0,2 mm d&#39;EDTA, 1 / 2000 du volume d&#39;échantillon de benzamidine 0,2 M et le volume de l&#39;échantillon 1 / 1000 de 0,1 M phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF). Les deux derniers composés sont utilisés comme inhibiteurs de protéase. * ÉTAPE CRITIQUE - Il est important de conserver les échantillons sur la glace durant toutes ces étapes. </li><li> Incuber l&#39;échantillon pendant 1 heure, tandis qu&#39;il vortex toutes les 10 minutes. </li><li> A la fin de l&#39;incubation d&#39;une heure de temps, ajouter du volume de l&#39;échantillon 1 / 2000 de 3M TNT, encore un autre inhibiteur de protéase. </li><li> Échantillons Vortex fois de plus et centrifuger à 3175 RCF pendant 10 minutes à 4 ° C. * ÉTAPE FACULTATIVE - Precleansing avec la protéine G agarose. <ol><li> Prenez le surnageant et mettre en nouveaux tubes Falcon de 15 ml. </li><li> Ajouter 500 ul de la protéine G agarose. </li><li> Tournez à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Centrifuger à 4000 rpm pendant 10 min à 4 ° C. </li></ol></li><li> Distribuer le surnageant de telle sorte que 500 ul sont utilisés comme contrôle d&#39;entrée (ne contenant que l&#39;ADN génomique), et le reste est divisé en deux tubes contenant 1600 uL d&#39;échantillon chacun - qui sont pour immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) échantillons. </li><li> Le contrôle d&#39;entrée est placé à -80 ° CO / N jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li><li> Pour les échantillons ChIP - ajouter du volume et de 1:10 de 10XFSB 4μg d&#39;anticorps, puis de vortex les échantillons et les faire pivoter à 4 ° C pendant la nuit. ! ATTENTION - Montant et la dilution de l&#39;anticorps peut exiger d&#39;optimisation. </li></ol> 2 e jour ! ATTENTION! - Commencer 2 ème jour par le lavage de la protéine G agarose qui sera utilisée pour isoler l&#39;ADN des nucléosomes. Depuis des billes d&#39;agarose sont très sensibles, il est nécessaire de couper les têtes des conseils à chaque pipetage toute solution contenant des billes d&#39;agarose. 1. Sonder la protéine G billes d&#39;agarose de l&#39;ADN <ol><li> Ajouter 1,6 mL à 245 uL 1XFSB protéine G-agarose (pour 4 tubes) dans un microtube de 2 mL (boucle). </li><li> Séparer la solution en deux tubes de 2 mL et remplir chacune jusqu&#39;à 1,6 mL avec 1X FSB. </li><li> Tournez à température ambiante pendant 30 secondes et centrifuger à 0,1 RCF pendant 30 sec. </li><li> Eliminer le surnageant en utilisant un aspirateur. </li><li> Ajouter 1,6 mL 1X FSB à nouveau. Tournez les échantillons pendant 30 sec puis centrifuger à 0,1 RCF pendant 30 sec. </li><li> Eliminer le surnageant à nouveau, et de combiner les deux tubes avec 1,5 mL 1XFSB. </li><li> Ajouter 15 uL d&#39;ADN de sperme de saumon soniqué (10mg/ml). ! ATTENTION - Cette étape devrait, en principe, de réduire la liaison non spécifique de l&#39;immunoprécipiter aux billes. Cependant, ce pourrait aussi conduire à de faux positifs pour certaines des séquences d&#39;ADN (humain). </li><li> Tournez à température ambiante pendant 30 min, puis centrifuger à 0,1 RCF pendant 30 sec. </li><li> Enlever le surnageant. Ajouter 200 ul de 1XFSB. </li><li> Ajouter 90 uL de billes d&#39;agarose dans chaque échantillon ChIP. Tournez à 4 ° C pendant 1 heure. </li><li> Ajouter 1 ml de billes d&#39;agarose 1XFSB en restant à servir de témoin négatif et tournent à 4 ° C pendant 1 heure. </li><li> Après l&#39;incubation d&#39;une heure de temps, centrifuger les échantillons et le contrôle négatif à 0,1 RCF pendant 30 sec. Jeter le surnageant. </li></ol> 2. Lavage des billes ! ATTENTION! - Tampons de lavage doivent être conservés à 4 ° C jusqu&#39;à leur utilisation, et doivent être utilisés que si sont moins d&#39;un mois. <ol><li> Ajouter 1 mL de chaque solution de lavage pour les perles et faire tourner pendant 3 min à température ambiante. </li><li> Centrifuger à 0,1 RCF pendant 30 sec. </li><li> Rejeter le surnageant à l&#39;aide de vide. </li></ol> * Chaque solution de lavage - Mémoire tampon de lavage à basse sel - Mémoire tampon de lavage haute du sel </p&gt; - Solution de chlorure de lithium - ne tournent à la température ambiante pendant 1 minute! - Tampon TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM pH = 8) 3. Élution * ÉTAPE CRITIQUE - Faire Elution Buffer fraîche pour chaque expérience le jour où il doit être utilisé. <ol><li> Ajouter 250 uL de tampon d&#39;élution fraîchement préparés à chaque échantillon. </li><li> Tournez pendant 15 min à température ambiante, puis centrifuger à 0,4 RCF pendant 1 min. </li><li> Enregistrer le surnageant dans un tube à centrifuger 2,0 ml (Loop). </li><li> Ajouter 250 uL de tampon d&#39;élution à chaque échantillon et de vortex à la main pendant quelques secondes. Ensuite, des échantillons de vortex pendant 15 minutes sur un mulitvortexer. </li><li> Centrifuger à 16 rpm FCR pendant 4 minutes et conserver le surnageant dans le tube même 2,0 mL (Loop). </li></ol> 4. Protéines Digest <ol><li> Ajouter 10 ul EDTA 0,5 M, 25 ul de Tris-HCl 0,8 M, pH 6,5, 10 mg / ml de protéinase K (1 / 200 de l&#39;échantillon) à chaque échantillon ChIP. </li><li> Pour chaque contrôle d&#39;entrée, ajouter le tampon de lyse pour la protéinase K la digestion (1 / 10 de tampon d&#39;échantillon) et 10mg/ml protéinase K (1 / 200 de tampon d&#39;échantillon). </li><li> Incuber échantillons d&#39;entrée et de ChIP 52 ° C pendant au moins 3 heures. </li></ol> 5. Phénol / chloroforme d&#39;extraction ! ATTENTION - Expérience nécessitant phénol / chloroforme doit être effectuée sous le capot. Utilisez des gants en nitrile lors de la manipulation de phénol / chloroforme. <ol><li> Après l&#39;incubation de 3 heures, on ajoute les 500 pl de phénol-chloroforme à chaque échantillon. </li><li> Vortex tous les échantillons pendant plusieurs secondes, puis centrifuger à 13 rpm FCR pendant 5 min. </li><li> À ce stade, deux phases seront présents et nous sommes intéressés par le contenu de la phase supérieure. Sortez la phase supérieure et le mettre dans un microtube de 2 mL. </li><li> Ajouter un mélange de 2μL de glycogène et 50 pl d&#39;acétate de sodium 3M à chaque échantillon avec 1,375 ml d&#39;éthanol à 100%. </li><li> Vortex tous les échantillons vigoureusement. Placez-les dans -80 ° C la nuit. </li></ol> 3 ème jour <ol><li> Retirer les échantillons sous forme de -80 ° C et les placer sur la glace pour les dégeler. </li><li> Centrifuger à 15 RCF pendant 10 minutes à 4 ° C. </li><li> Retirer délicatement le surnageant sans perturber le culot au fond du tube. </li><li> Ajouter 1 ml d&#39;éthanol 75% froid pour chaque échantillon, puis inverser les 4-6 fois. </li><li> Centrifuger à 18 RCF pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Retirer le surnageant fois de plus et permettent les granules d&#39;air sec. </li><li> Dissoudre granulés séchés dans 50 ul de 4mm de Tris-HCl, pH8 et conserver à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li></ol>

<ol><li>Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akbarian+S.+Chromatin+immunoprecipitation+in+postmortem+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain.</a> J Neurosci Methods. 156, 284-292 Forthcoming.</li>
<li>Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+dysfunction+in+schizophrenia+involves+mixed-lineage+leukemia+1-regulated+histone+methylation+at+GABAergic+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal dysfunction in schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters.</a> J Neurosci. 27, 11254-11262 Forthcoming.</li>
<li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprecipitation+of+native+chromatin%3A+NChIP%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31, 76-82 Forthcoming.</li>
<li>Spiteri, E., Konopka, G., Coppola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+transcriptional+targets+of+FOXP2%2C+a+gene+linked+to+speech+and+language%2C+in+developing+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of the transcriptional targets of FOXP2, a gene linked to speech and language, in developing human brain.</a> Am J Hum Genet. 81, 1144-1157 Forthcoming.</li>
<li>Huang, H. uang, Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAD1+mRNA+expression+and+DNA+methylation+in+prefrontal+cortex+of+subjects+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">GAD1 mRNA expression and DNA methylation in prefrontal cortex of subjects with schizophrenia.</a> PLoS ONE. 2, Forthcoming.</li>
<li>Stadler, F., Kolb, G., Rubusch, L., Baker, S. P., Jones, E. G., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation+at+gene+promoters+is+associated+with+developmental+regulation+and+region-specific+expression+of+ionotropic+and+metabotropic+glutamate+receptors+in+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Histone methylation at gene promoters is associated with developmental regulation and region-specific expression of ionotropic and metabotropic glutamate receptors in human brain.</a> J Neurochem. 94, 324-336 Forthcoming.</li>
</ol>

Le protocole décrit ici est particulièrement utile pour les chercheurs intéressés dans les signatures de méthylation des histones et / ou de l&#39;ADN du cerveau humain, parce que ces marques chromatine peuvent être moins enclins à des artéfacts post mortem par rapport à d&#39;autres types de modifications, y compris (histones) acétylation et la phosphorylation 1, 2. Le cerveau post-mortem se prêtent à l&#39;étude de la mono-nucléosomes préparations; l&#39;ADN reste largement attachée à la histones, au moins dans les échantillons...

Solutions: <ul><li> Tampon nChIP Douncing: Tris 10 mM, MgCl 2 4 mM, 1 mM de CaCl2 ajuster le pH à 7,5 </li><li> 10x FSB: EDTA 50 mM, 200 mM de Tris, 500 mM NaCl ajuster le pH à 7,5 </li><li> Tampon salin de lavage à basse: 0,1% SDS, 1% de Triton X-100, EDTA 2 mM, Tris 20 mM (pH 8), 150 mM de NaCl </li><li> Tampon du sel de lavage haute: 0,1% SDS, 1% de Triton X-100, EDTA 2 mM, Tris 20 mM (pH 8), 500 mM de NaCl </li><li> Tampon de chlorure de lithium: 1% IGEPAL CA-630, 1% d&#39;acide désoxycholique, EDTA 1 mM (pH 8), Tris 10 mM (pH 8), 0,25 M de LiCl </li><li> Tampon TE: Tris 10 mM (pH 8), EDTA 1 mM </li><li> Tampon d&#39;élution: 0,1 M de NaHCO 3, 1% de SDS </li><li> Tampon de digestion protéinase K (10X): 1 M de Tris, EDTA 50 mM, SDS 2%, NaCl 2M ajuster le pH à 8,0 </li><li> Acétate de sodium 3 M: 24,61 g d&#39;acétate de sodium anhydre (MW = 82,03) dans 100 ml d&#39;eau distillée en autoclave. Ajuster le pH à 5,2 à l&#39;aide d&#39;acide acétique concentré. </li></ul>

un dosage de la chromatine pour les tissus du cerveau humain

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronique maladies neuropsychiatriques comme la schizophrénie, la maladie bipolaire et l&#39;autisme sont considérés comme le résultat d&#39;une combinaison de facteurs génétiques et environnementaux qui pourraient résulter de modifications épigénétiques de l&#39;expression génique et d&#39;autres pathologie moléculaire. Traditionnellement, cependant, les études d&#39;expression dans le cerveau post-mortem ont été confinés à la quantification de l&#39;ARNm ou de protéines. Les limites rencontrées dans la recherche du cerveau post-mortem tels que des variabilités dans le temps et l&#39;autolyse des tissus intégrités sont également susceptibles d&#39;affecter toutes les études des structures supérieures chromatine ordre. Cependant, l&#39;organisation de l&#39;ADN génomique nucléosomiques y compris l&#39;ADN: core histones contraignant - semble largement préservées dans des échantillons représentatifs fournis par les banques du cerveau différentes. Par conséquent, il est possible d&#39;étudier le modèle de méthylation et d&#39;autres modifications covalentes des histones fondamentales définies au loci génomiques dans le cerveau post-mortem. Ici, nous présentons une version simplifiée natif immunoprécipitation de la chromatine (NChIP Protocol) pour les échantillons congelés du cerveau (jamais fixe) humaine. En commençant par la nucléase micrococcal digestion des homogénats de cerveaux, NChIP suivie par qPCR peut être complété dans les trois jours. La méthodologie présentée ici devrait être utile pour élucider les mécanismes épigénétiques de l&#39;expression des gènes dans le cerveau humain normal et pathologique.

Jusqu&#39;à récemment, les études d&#39;expression sur le cerveau humain ont été limités à la quantification de l&#39;ARN ou les protéines. Avec les techniques d&#39;immunoprécipitation de chromatine décrites dans ce document, il sera possible de cartographier la méthylation des histones et d&#39;autres régulateurs épigénétiques de l&#39;expression des gènes dans le cerveau post-mortem.

Un dosage de la chromatine pour les tissus du cerveau humain

On pense que les maladies neuropsychiatriques chroniques, telles que la schizophrénie, le trouble bipolaire et l'autisme, résultent d'une combinaison de facteurs génétiques et environnementaux...

Bonjour, je m'appelle Amish Matan et je travaille au laboratoire du Dr. Sha Mc Barian, au sein du service de psychiatrie de l'École de médecine de l'UMass. Aujourd'hui, je vais vous présenter une procédure d'immunoprécipitation de la chromatine sur des tissus cérébraux humains post-mortem. Bien que la procédure suivante ne soit pas très compliquée.Ce qui est particulièrement passionnant, c’est que jusqu’à récemment, les études d’expression dans le cerveau humain se limitaient à une simple quantification des ARNm et des protéines. Cette technique particulière nous permettra de mieux comprendre les bases mécanistiques de l’expression génique dans le cerveau humain, tant en condition normale que pathologique. Commençons donc l’immunoprécipitation de la chromatine.Nous avons commencé avec des échantillons préalablement disséqués de tissu cérébral humain post-mortem congelé. Il est important de porter des lunettes de protection et de travailler dans un espace désigné pour manipuler du tissu humain. Lors du traitement de ces échantillons, le tissu cérébral est mis en suspension avec un volume de tampon de lyse égal à cinq fois le volume du cerveau.Une fois que tous les tissus semblent av

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Biologie

L'hétérogénéité cellulaire du tissu cérébral constitue une limitation importante pour l'étude des marqueurs épigénétiques de la chromatine, car la plupart des essais n'ont pas la résolution seule cellule. Les neurones sont généralement mêlés à des cellules gliales et les autres cellules non-neuronales. Nous fournissons un protocole pour extraire et collecter des noyaux des neurones du cerveau humain.

Isolement des noyaux neuronaux à partir de tissus post-mortem du cerveau de l&#39;homme

Ce protocole décrit comment la chromatine immunoprécipitation (ChIP) est utilisée pour étudier les altérations dynamiques du modèle de la chromatine qui régulent la transcription induite par une voie de transduction du signal.

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) pour doser modification des histones dynamique dans l&#39;expression génique dans les cellules humaines Activé

Le EpiMark 5-HMC et le kit d'analyse 5-MC peut être utilisé pour analyser et quantifier 5-méthylcytosine et 5-hydroxyméthylcytosine au sein d'un locus de SPE spécifiques. Le kit distingue 5-MC à partir de 5-HMC par l'ajout de glucose pour le groupe hydroxyle de 5-HMC via une réaction enzymatique utilisant β-glucosyltransférase (T4-TBG). Lorsque 5-HMC survient dans le contexte de la CCBG, cette modification convertit un site clivable Mspl à un site non clivable.

Haute Sensibilité 5-hydroxyméthylcytosine détection dans le tissu cérébral des souris Balb / C

Source : Mendez, F. M. et al., Immunoprécipitation native de la chromatine à l’aide de neurosphères de tumeurs cérébrales murines. J. Vis. Exp. (2018). Cette vidéo démontre l’isolement de complexes protéine-ADN à partir de cellules de la neurosphère dérivées d’une tumeur cérébrale de souris à l’aide de l’immunoprécipitation native de la chromatine. Il détaille les étapes de préparation de la chromatine, d’immunoprécipitation, de lavage et de digestion des protéines afin de libérer l’ADN pour...

Immunoprécipitation de la chromatine native des cellules de la neurosphère

ARN L’hybridation in situ (ISH) permet de visualiser les ARN dans les cellules et les tissus. Nous montrons ici comment la combinaison de l’ARNASCOPE ISH avec l’immunohistochimie ou les colorants histologiques peut être utilisée avec succès pour détecter les ARNm localisés aux axones dans des sections de cerveaux de souris et d’humains.

Détection de axonaux localisée ARNm dans les sections de cerveau en utilisant haute résolution<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation

Nous décrivons ici une méthode immunochimique sensible pour cartographier la distribution spatiale des dérivés d’oxydation 5mC basée sur l’utilisation d’anticorps secondaires conjugués à la peroxydase et l’amplification du signal tyramide.

Détection des formes modifiées de Cytosine Utilisation Sensible immunohistochimie

Nous présentons une méthode efficace et reproductible pour isoler et de la culture des cellules progénitrices neurales de tissus du cerveau embryonnaire et postnatale pour l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) de l’histone 3 lysine 79 MBD (H3K79me2) - une marque d’histone agrave la domaine globulaire de l’histone 3.

Isolement et culture des progéniteurs neurones suivie par immunoprécipitation de la chromatine de marque d’Histone 3 Lysine 79 MBD

Des mécanismes épigénétiques sont fréquemment altérées dans les gliomes. Immunoprécipitation de la chromatine pourrait servir à étudier les conséquences des altérations génétiques dans les gliomes qui résultent de l’évolution des modifications d’histone qui régulent la transcription de gène et de la structure de la chromatine. Ce protocole décrit l’immunoprécipitation de la chromatine native sur neurospheres de tumeur de cerveau murin.

Immunoprécipitation de la chromatine native à l’aide de Neurospheres de tumeur de cerveau murin

Les auteurs décrivent un protocole étape par étape pour la chromatine tandem immunoprécipitation séquençage (tChIP-Seq) qui permet l’analyse de la modification d’histone génome cellule-spécifiques au type.

TChIP-Seq : Type-spécifiques des cellules épigénome profilage

Ici, nous présentons un protocole pour détecter 5-hydroxymethylcytosine dans les cellules et les tissus cérébraux, utilisant la coloration d'immunofluorescence et les méthodes de point-blot d'ADN.

La détection de 5-Hydroxymethylcytosine dans les cellules souches neurales et le cerveau des souris

Ce protocole se concentre sur la préparation de la chromatine à partir de tissus congelés et convient à l’immunoprécipitation de la chromatine par réticulation (X-ChIP) suivie d’une analyse PCR quantitative (X-ChIP-qPCR) ou d’approches de séquençage de nouvelle génération (X-ChIP-seq).

Extraction de chromatine à partir de tissu hépatique chimérique congelé pour l’analyse de l’immunoprécipitation de la chromatine

Découvrez une technique de chromatin immunoprecipitation pour les tissus cérébraux humains post-mortem. Cette méthode permet d'analyser la méthylation des histones et la régulation épigénétique de l'expression génique dans le cerveau normal et pathologique.

Un dosage de la chromatine pour les tissus du cerveau humain

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