Un dosage de la chromatine pour les tissus du cerveau humain

Bonjour, je m'appelle Amish Matan et je travaille au laboratoire du Dr. Sha Mc Barian, au sein du service de psychiatrie de l'École de médecine de l'UMass. Aujourd'hui, je vais vous présenter une procédure d'immunoprécipitation de la chromatine sur des tissus cérébraux humains post-mortem. Bien que la procédure suivante ne soit pas très compliquée.

Ce qui est particulièrement passionnant, c’est que jusqu’à récemment, les études d’expression dans le cerveau humain se limitaient à une simple quantification des ARNm et des protéines. Cette technique particulière nous permettra de mieux comprendre les bases mécanistiques de l’expression génique dans le cerveau humain, tant en condition normale que pathologique. Commençons donc l’immunoprécipitation de la chromatine.

Nous avons commencé avec des échantillons préalablement disséqués de tissu cérébral humain post-mortem congelé. Il est important de porter des lunettes de protection et de travailler dans un espace désigné pour manipuler du tissu humain. Lors du traitement de ces échantillons, le tissu cérébral est mis en suspension avec un volume de tampon de lyse égal à cinq fois le volume du cerveau.

Une fois que tous les tissus semblent avoir atteint une consistance homogène dans la solution, nous pouvons les transférer dans un tube de deux mil. Après homogénéisation du tissu, ajoutez cinq unités par mil de nucléase micrococcale à l'échantillon et mélangez la solution en aspirant et en expulsant plusieurs fois à l’aide d’une pipette. Ensuite, placez le tube sur de la glace.

Il est important d'effectuer cette étape rapidement, car la micrococcal nuclease conserve une activité même à quatre degrés Celsius. Une fois que tous les échantillons ont été traités avec la micrococcal nuclease, nous passons rapidement au bain-marie à 37 degrés Celsius et incubons les échantillons pendant sept minutes.

Après une incubation de sept minutes, nous ajoutons de l'EDTA 0,5 molaire à une concentration de 10 millimoles afin d'arrêter l'activité de la micrococcal nucléase. Nous pouvons maintenant passer à l'étape d'immunoprécipitation. Après le traitement par la micrococcal nucléase, nos échantillons, qui contiennent l'ADN nucléosomique, commenceront l'immunoprécipitation.

Nava prendra un tube Falcon de 15 ml auquel nous ajouterons 4,5 ml d'EDTA 0,2 millimolaire, 2,5 microlitres de benadine 0,2 molaire et 4,5 micros de PMSF 0,1 molaire dans ce tube. Nous transférerons notre échantillon. Nous incubons maintenant notre échantillon pendant une heure sur de la glace en vortexant toutes les 10 minutes.

À la fin de l'incubation d'une heure, nous ajouterons 2,5 microlitres de DTT à trois molaire. L'échantillon est vortexé une fois de plus, puis centrifugé dans un rotor à godets tournants à 3 175 RCF pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, le surnageant est réparti de manière à utiliser 500 microlitres comme témoin d'entrée, qui ne contiendra que de l'ADN génomique, et le reste est divisé en deux tubes contenant chacun 1 600 microlitres d'échantillon, qui constitueront nos échantillons de immunoprécipitation de chromatine.

Le témoin de contrôle est placé à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit jusqu'à une utilisation ultérieure. Ensuite, nous ajoutons 160 microlitres de 10 XFSB, soit un dixième du volume de notre échantillon. Nous ajoutons également quatre microgrammes d'anticorps.

Maintenant, vortexez les échantillons, puis faites-les tourner à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Après l'incubation nocturne, nous laverons les protéines giros qui seront utilisées pour isoler notre ADN nucléosomique. Étant donné que ces billes agro sont très sensibles, il est nécessaire de couper les embouts des pipettes lorsqu'on travaille avec elles.

Cela permet de s'assurer que les billes disposent de plus d'espace lors de la pipette. Ajoutez maintenant 1,6 mils d'une bille XFS à 245 microlitres de jaguars protéiques dans un tube de centrifugation micro de deux mil. Cela devrait suffire pour quatre tubes d'échantillon.

Ensuite, séparer la solution de billes en deux tubes de deux millilitres et compléter chaque tube jusqu'à 1,6 millilitre avec du XFSB 1X. Faire tourner les tubes à température ambiante pendant 30 secondes sur un agitateur rotatif, puis les centrifuger à 0,1 RCF pendant 30 secondes. Après la centrifugation, éliminer l'ATE à l’aide d’un vide.

Ajouter 1,6 mils d'un XFSB. Faire pivoter à nouveau les échantillons pendant 30 secondes sur un agitateur rotatif, puis les centrifuger de nouveau à 0,1 RCF FS pendant 30 secondes. Après la centrifugation, nous éliminons une fois de plus le surnageant et combinons les deux tubes avec 1,5 mils d'un XFSB.

Ajouter également 15 microlitres d'ADN de spermatozoïdes. Incuber en rotation à température ambiante pendant 30 minutes, puis centrifuger à 0,1 RCF pendant 30 secondes. Éliminer le surnageant et ajouter 200 microlitres de FSX 1X.

Ajoutez maintenant 90 microlitres d'agro speeds dans chaque échantillon de précipitation de la chromatine, puis faites-les tourner à quatre degrés pendant une heure. Pour un témoin négatif, ajoutez un millilitre de FSX 1X dans les agro speeds restants et faites-les tourner, conjointement avec l'échantillon de précipitation immunologique de la chromatine, à quatre degrés Celsius pendant une heure. Pendant l'incubation d'une heure, nous pouvons profiter de ce temps pour préparer un tampon de résolution frais.

Cela sera utilisé ultérieurement dans l'expérience après une heure. Incubez les échantillons et le témoin négatif à 0,1 CFS pendant 30 secondes, puis centrifugez et jetez le surnageant. Ensuite, nous laverons les billes avec quatre types différents de solutions de lavage : un tampon de lavage à faible concentration saline, un tampon de lavage à forte concentration saline, une solution de chlorure de lithium, et enfin, un tampon TE à pH 8.

Pour chaque tampon sauf la solution de chlorure de lithium, nous allons agiter les échantillons pendant trois minutes à température ambiante, puis les centrifuger à 0,1 R Cs pendant 30 secondes. Pour le lavage au chlorure de lithium, agiter les échantillons à température ambiante pendant une minute seulement. Après chaque lavage, éliminer le surnageant à l’aide d’un vide.

Nous sommes maintenant prêts à passer à l'élution de nos échantillons. Pour commencer l'étape d'élution, ajoutez 250 microlitres de tampon d'élution fraîchement préparé à chaque échantillon. Agitez doucement les échantillons pendant 15 minutes à température ambiante, puis centrifugez-les à 0,4 RCF pendant une minute.

Conservez maintenant le surnageant dans un tube orange de 2 ml. Ajoutez ensuite 250 microlitres de tampon d'évolution à chaque échantillon. Mélangez à nouveau tous les échantillons manuellement au vortex pendant quelques secondes.

Ensuite, vortexer les échantillons pendant 15 minutes après avoir vortexé pendant 15 minutes, puis centrifuger les tubes. Ajouter 16 RCF pendant quatre minutes et conserver le surnageant dans le même tube de deux millilitres. Pour digérer les protéines présentes dans nos échantillons, ajouter d'abord 10 microlitres de 0,5 molaire A DTA, 25 microlitres de HCl de 0,8 molaire à un pH de 6,5 et 2,5 microlitres de protéinase K à 10 milligrammes par millilitre à chaque échantillon d'immunoprécipitation de chromatine.

À côté de chaque contrôle d'entrée, ajouter 15 microlitres de tampon de lyse et 2,5 microlitres de protéinase K à 10 milligrammes par ml. Incuber les échantillons d'entrée et de précipitation immunologique de chromatine à 52 degrés Celsius pendant au moins trois heures. Maintenant que l'incubation de trois heures est terminée, nous pouvons passer à l'extraction au phénol-chloroforme.

Après une incubation de trois heures, nous ajoutons 500 microlitres de phényl chloroforme à chaque échantillon. Cette manipulation est effectuée sous hotte, car le phényl chloroforme est un produit chimique organique nocif par contact cutané et par inhalation. Ensuite, nous vortexons tous les échantillons pendant plusieurs secondes, puis les centrifugeons à 13 RCF pendant cinq minutes, après la centrifugation.

Deux phases doivent être présentes dans les tubes. Étant donné que nous nous intéressons au contenu de la phase supérieure, nous prélevons cette phase et la transférons dans un tube microcentrifuge de deux mil. Ensuite, à chaque échantillon, on ajoute un mélange de deux microlitres de glycogène et de 50 microlitres d'acétate de sodium à trois molaire, ainsi que 1,375 mil d'éthanol à cent pour cent.

Tous les échantillons sont vortexés vigoureusement et placés à moins 80 degrés Celsius pendant toute la nuit. Après l'incubation nocturne, les échantillons sont placés sur de la glace pour les décongeler. Ils sont centrifugés à une densité élevée à 15 RCF pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Après la centrifugation, retirez soigneusement le surnageant sans perturber le culot au fond du tube. Ensuite, ajoutez un millilitre d'éthanol froid à 75 % à chaque échantillon et retournez les tubes quatre à six fois. Les tubes sont ensuite re-centrifugés à 18 RCF pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Le surnageant est à nouveau éliminé et les culots sont laissés à sécher à l'air libre. Une fois les culots secs, ils sont dissous dans 50 microlitres d'acide chlorhydrique trace à quatre millimolaire, de pH huit, puis stockés à moins 80 degrés Celsius jusqu'à utilisation ultérieure. Eh bien, je viens de vous montrer comment réaliser des immunoprécipitations de chromatine sur des tissus cérébraux humains post-mortem congelés.

Et n'oubliez pas, lors de la réalisation de cette procédure, il est important de prendre toutes les précautions nécessaires lors de la manipulation de tissu cérébral humain. Les tests d'immunoprécipitation de chromatine peuvent être utilisés pour ajouter une couche supplémentaire de compréhension de l'expression génique dans le cerveau humain, tant normal que pathologique. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.