Name: Le titrage de coronavirus humains en utilisant un dosage immunoperoxydase (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-28T22:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Découvrez le dosage immunoperoxydase pour titrer les coronavirus humains sans effet cytopathique. Cette méthode alternative aux tests en plaque permet une quantification fiable des souches 229E et OC43.

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Le protocole texte complet de cette approche expérimentale est disponible en <a href="http://www.springerprotocols.com/">protocoles Springer</a> .

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/751/">Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.
Revised Abstract:
Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for prototype strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). Therefore, an alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) was developed for the detection and titration of these viruses and is described herein. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of virus-containing samples in a 96-well plate format. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as 'Tissue Culture Infectious Dose 50 percent' (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain infectious replicating virus. This technique provides a reliable method for the titration of HCoV-229E and HCoV-OC43 in biological samples such as cells, tissues and fluids. This article is based on work first reported in Methods in Molecular Biology (2008) volume 454, pages 93-102.
Original Abstract:
Calculation of infectious viral titers represents a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). An alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) is herein described for the detection and titration of these viruses. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of samples in a 96-well plate. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as "Tissue Culture Infectious Dose" (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain replicating virus. This technique is a reliable method for the titration of HCoV in biological samples (cells, tissues or fluids).

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/751/">Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

le titrage de coronavirus humains en utilisant un dosage immunoperoxydase

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Calcul des titres viraux infectieux représente une approche fondamentale et essentielle expérimental pour virologues. Dosages de plaque classique ne peut pas être utilisé pour des virus qui ne provoquent pas des effets cytopathiques, qui est le cas pour les souches 229E et OC43 de coronavirus humains (HCoV). Un test immuno alternative indirecte (IPA) est décrite ici pour la détection et le titrage de ces virus. Cellules sensibles sont inoculés avec des dilutions de série logarithmique des échantillons dans une plaque de 96 puits. Après une croissance virale, la détection virale par l&#39;IPA obtient le titre de virus infectieux, exprimé par la «dose infectieuse de culture tissulaire» (DICT50). Cela représente la dilution d&#39;un échantillon contenant le virus au cours de laquelle la moitié d&#39;une série de puits de laboratoire contiennent réplication virale. Cette technique est une méthode fiable pour le titrage du HCoV dans des échantillons biologiques (cellules, tissus ou les liquides).

Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode alternative de détection et de titrage de virus en utilisant une technique de détection d&#39;antigènes enzymatique connu sous le nom d&#39;un dosage immuno. Ici, nous allons vous montrer comment collecter vos échantillons viraux, préparer les cellules pour les tests, et enfin le dosage immuno utilisant des dilutions en série pour déterminer le titre viral.

Le titrage de coronavirus humains en utilisant un dosage immunoperoxydase

La détermination des titres viraux infectieux est une approche expérimentale fondamentale et essentielle pour les virologues. Les essais de plages classiques ne peuvent pas être utilisés pour...

Le calcul des titres viraux infectieux constitue une approche expérimentale fondamentale. Toutefois, la méthode classique utilisant les dosages par plaques n'est pas la plus fiable pour les virus ne provoquant pas d'effets cytopathiques, comme c'est le cas pour les coronavirus humains. Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode alternative de détection et de titrage d'un virus, basée sur une technique enzymatique de détection d'antigènes appelée dosage immunoperoxydasique.Ici, nous allons vous montrer comment prélever vos échantillons viraux, préparer les cellules pour les tests, puis réaliser le dosage immuno-peroxydase par dilutions sériées afin de déterminer la titration virale. Bonjour, je suis le Dr. Pierre Albo, directeur du Laboratoire de neuroimmunologie à l'Institut AM RIP à Laval, Québec, Canada. Aujourd'hui, nous allons démontrer comment quantifier les souches virales humaines OT 43 et deux neuf E, qui sont des souches prototypes de ces virus ne produisant pas de plaques en culture.Nous avons donc mis au point un test permettant de contourner ce problème. Ce test s'appelle le dosage immunoperoxydasique. Pour illustrer ce protocole, je vais vous présenter mon étudiante Gabrielle Marol, mon technicien Francis Nader et mon associée de recherche Ellan Jacob.Commençons. Tout d'abord, nous devons préparer nos échantillons de tissus. Nous commençons par peser à vide les tubes stériles que nous utiliserons pour recueillir chaque organe.Une fois que nous avons déterminé la masse de chaque tube vide, nous désissons rapidement les organes d'intérêt dans des conditions stériles, puis les conservons sur de la glace. Il est important de bien se souvenir de rincer les instruments avec de l'éthanol à 70 % entre chaque dissection. Après avoir collecté les organes, nous déterminons la masse de chaque échantillon biologique.Ensuite, nous allons homogénéiser les échantillons de tissu à l'aide de PBS stérile à 10 % à l'aide d'un homogénéisateur Polytron dans une hotte à flux laminaire. Allumez l'homogénéisateur, puis soulevez et abaissez le tube afin de rompre le tissu. Après l'homogénéisation de chaque échantillon, rincez l'appareil une fois avec de l'eau stérile, une fois avec de l'éthanol à 70 %, puis finalement avec du PBS avant de traiter l'échantillon de tissu suivant.Une fois les échantillons homogénéisés, centrifuger les tubes à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. À 1000 G, récupérer les surnageants dans de nouveaux tubes stériles. À ce stade, les échantillons viraux peuvent être traités pour la détection par immunoperoxydase.Dans le cas contraire, vous pouvez les congeler immédiatement à moins 80 degrés Celsius et les conserver jusqu'à ce que vous soyez prêt à effectuer les dosages. Ensuite, nous voulons préparer les échantillons cellulaires. Il existe différentes méthodes pour préparer les cellules adhérentes et non adhérentes, mais les deux impliquent la collecte des titres viraux intracellulaires et extracellulaires.Afin de déterminer la production virale extracellulaire dans des cellules adhérentes, nous prélevons les surnageants dans des tubes stériles à partir des cellules infectées, à des temps appropriés suivant l'infection. Pour l'estimation des titres viraux intracellulaires, nous souhaitons tout d'abord retirer le milieu, laver les cellules dans du PBS stérile et tiède, puis ajouter le même volume, ou un volume connu, de milieu, et effectuer trois cycles de congélation-décongélation à moins 80 degrés Celsius. Ceci lysera les cellules et libérera les particules virales dans le milieu.Pour les cellules non adhérentes, nous centrifugeons d'abord les cellules à mille g pendant cinq minutes. Après avoir formé un culot cellulaire, nous récupérons les surnageants dans des tubes stériles. Ceci représente la fraction extracellulaire du virus infectieux.Ensuite, nous suspendons le culot cellulaire dans un volume identique au surnageant recueilli ou dans un volume connu de milieu de culture. Nous effectuons alors trois cycles de congélation-décongélation à moins 80 degrés Celsius afin de lyser les cellules et de libérer les particules virales dans le milieu. Ceci représente la fraction intracellulaire du virus infectieux.Après la lyse de cellules adhérentes ou non adhérentes, centrifuger pendant cinq minutes à mille g. Le surnageant peut alors être récupéré dans de nouveaux tubes stériles et les titres peuvent être analysés par le test immunoperoxydasique. Là encore, l'échantillon peut également être immédiatement congelé à moins 80 degrés C et conservé jusqu'au moment du test.Afin de tester la productivité de notre infection par le coronavirus humain dans nos échantillons biologiques, nous souhaitons utiliser un dosage immunoperoxydasique sur des cellules sensibles au coronavirus. Une trypsine et un traitement sont utilisés pour créer une suspension de cellules sensibles à partir d'une monocouche confluente. Lorsqu'on travaille avec le coronavirus humain, les cellules 2 29 EL 1 32 sont utilisées comme cellules sensibles et, pour le coronavirus humain OC 43, la lignée cellulaire HRT 18 est utilisée après la génération d'une suspension de cellules sensibles. Elles sont ensuite ensemencées dans une plaque de culture tissulaire de 96 puits.Si l'on utilise une pipette multicanal, distribuer cent microlitres par puits de suspension cellulaire en utilisant la concentration appropriée de cellules. Le nombre de cellules sensibles par puits dépendra du type de cellules utilisé et du moment auquel aura lieu l'inoculation des cellules. Après la mise en culture, veuillez consulter notre protocole Springer pour obtenir des informations plus détaillées.Avant de commencer le dosage immunoperoxydasique, les cellules sensibles doivent être infectées avec les échantillons que nous avons préparés précédemment. Lorsque les cellules sensibles ont atteint une confluence de 70 à 80 %, retirez le milieu de chaque plaque de 96 puits en enveloppant la plaque dans du papier stérile et en la retournant délicatement face contre une autre feuille de papier stérile. Ensuite, ajoutez dans chaque puits cent microlitres d'alpha MEM supplémenté avec 1 % de FBS.Chaque échantillon doit être testé dans quatre colonnes adjacentes. Sur la même plaque, ajouter cent microlitres par puits d'aliqotes à tester dans la première rangée. Généralement, les cellules sensibles sont inoculées avec une dilution logarithmique sériée des échantillons infectés.Pour ce faire, ajoutez à nouveau 11 microlitres par puits du même échantillon dans quatre puits. Placez-les maintenant sur la deuxième rangée de la plaque 96 puits, puis mélangez à l’aide d’une pipette multipuits en aspirant et en rejetant trois fois, et transférez 11 microlitres de chaque puits vers la troisième rangée, et ainsi de suite jusqu’à la dernière rangée de la plaque. Une fois les cellules inoculées, incubez les plaques dans une enceinte humidifiée à 33 degrés Celsius avec 5 %CO2 pour le coronavirus humain.Les cellules infectées par le virus 2290 sont incubées pendant cinq jours, et les cellules infectées par le coronavirus humain OC43 sont incubées pendant quatre jours. Après ce temps, nous pouvons procéder à la détection du virus.Après l'incubation, nous sommes prêts à détecter le virus. Nous commençons d'abord par éliminer complètement le milieu. Pour ce faire, nous secouons délicatement les plaques sur des essuie-tout non stériles dans la hotte à flux laminaire.Nous rinçons ensuite délicatement les cellules en remplissant doucement les puits avec du PBS. À l’aide d’une pipette multipuits. Nous éliminons le PBS des puits d’un geste sec et retirons tout résidu de PBS en enveloppant chaque plaque dans du papier absorbant.Après avoir lavé les cellules, vous devez les fixer avec du méthanol à cent pour cent contenant 0,3 % de peroxyde d'hydrogène. Ajoutez le mélange de méthanol aux cellules et laissez la plaque reposer de 15 à 30 minutes à température ambiante. À l'issue de l'incubation de 30 minutes, retirez le fixateur en secouant les plaques au-dessus de l'évier. Éliminez le fixateur résiduel en tapotant la plaque face contre le bas sur plusieurs serviettes en papier placées sur le plan de travail.Ensuite, laissez-le sécher complètement à l'air, face vers le haut, pendant environ 15 à 30 minutes, le temps que les cellules sèchent. Vous pouvez préparer une solution d'anticorps spécifique au virus, diluée convenablement dans du PBS. Ensuite, ajoutez cent microlitres de l'anticorps viral spécifique dans chaque puits des plaques d'incubation, puis incubez pendant deux heures à 37 degrés Celsius.Après l'incubation, éliminer complètement le milieu en le secouant au-dessus de l'évier. Rincer la plaque en remplissant les puits avec du PBS. Puis secouer la plaque dans l'évier et rincer avec du PBS.Deux fois supplémentaires. Éliminer tout résidu de PBS en tapotant la plaque face contre des essuie-tout non stériles placés sur le plan de travail. Ensuite, ajouter cent microlitres par puits d'anticorps secondaire à une dilution de un sur 1000.Dilution dans le PBS, incuber la plaque pendant deux heures à 37 degrés sans CO2, 30 minutes avant la fin de l'incubation. Préparer le réactif de détection, qui est un mélange de DAB avec du PBS et 0,01 % de peroxyde d'hydrogène. Rincer la plaque trois fois dans le PBS comme précédemment.Après avoir lavé la plaque, ajouter cent microlitres de réactif de développement dans chaque puits. Incuber de 10 à 20 minutes à température ambiante ou jusqu'à ce que le témoin positif soit coloré. Pour arrêter la réaction, laver la plaque une fois avec de l'eau comme précédemment avec le PBS et remplir chaque puits avec cent microlitres d'eau déionisée.Enfin, lire les plaques au microscope optique afin de quantifier tous les puits présentant des cellules colorées. À présent, nous pouvons enfin déterminer le titre de notre virus. Celui-ci peut être calculé à l’aide de la méthode car, dont l’équation est disponible dans le protocole Springer accompagnant cette vidéo.Nous venons de vous montrer comment titrer les coronavirus humains lors de cette procédure. Il est important de se rappeler que vous travaillez avec des échantillons contenant les deux virus et que vous devez travailler dans des conditions stériles. Voilà donc tout.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Biologie

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