Génération de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées murin pour l'utilisation dans l'imagerie 2-photons

La préparation de cellules dendritiques à partir de la moelle osseuse fournit une excellente source de cellules présentatrices d’antigènes qui peuvent être utilisées pour des expériences in vitro ou in vivo dans l’imagerie à deux niveaux du système immunitaire. L’introduction de cellules présentatrices d’antigène permet d’étudier les interactions cellulaires spécifiques de l’antigène dans le contexte du ganglion lymphatique vivant. Ici, nous démontrons l’isolement stérile de la moelle osseuse et les techniques de culture pour la production de cellules dendritiques matures.

De plus, nous suivons le développement des cellules dendritiques du premier au 11e jour. Ce développement est représenté par des images fixes et dans des vidéos d’incubation réalisées à l’aide de scent technologies incus site. Enfin, nous montrons que des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse présentent l’antigène Cove à deux cellules T de l’OT dans le ganglion lymphatique miroir.

Bonjour, je suis Melanie Matthew dans le laboratoire de Micah Halen à l’Université de Californie à proximité. Vous êtes-vous déjà demandé ce qui se passe à l’intérieur pendant le sondage pendant la croissance de vos cellules ? Aujourd’hui?

Dans le cadre de notre protocole, nous allons vous montrer comment utiliser certains instruments sur site. Le site inky vous permet de suivre la croissance des cultures cellulaires dans votre incubateur. Dans ce protocole, nous allons vous montrer comment isoler et préparer des cellules dérivées de la moelle osseuse et des cellules de groupe à partir de souris.

Donc, la première chose que je vais vous montrer comment faire est d’enlever les os du fémur et d’isoler la moelle osseuse : d’abord, épinglez l’animal. Ensuite, mouillez l’animal avec de l’éthanol à 70 %. Faites votre première incision le long de la ligne médiane de l’animal.

Ensuite, coupez à l’intérieur de la jambe comme je vous le montre ici. Pour exposer le tissu musculaire au-dessus du fémur, vous devez être capable de retirer le muscle et de saisir le gros os du fémur avec votre pince à épiler de dissection. Pendant que vous tenez l’os avec votre pince à épiler de dissection, descendez l’os et faites votre première incision juste en dessous de l’articulation.

Ensuite, faites remonter vos ciseaux sur toute la longueur du fémur et faites-le couper le plus près possible du corps. Cela peut entraîner un peu de sang, surtout si vous coupez l’artère fémorale. Lorsque vous enlevez le fémur, il est extrêmement important que l’os soit conservé intact.

Comme vous pouvez le voir ici, les extrémités de l’os n’ont pas été coupées ou perturbées. Une fois le fémur retiré, coupez tout tissu supplémentaire et placez le fémur dans une petite coupelle de notre média PMI. Lorsque vous enlevez des tissus supplémentaires, assurez-vous que l’os du fémur ne se dessèche pas.

À ce stade, les os du fémur doivent être transférés dans un plat contenant 70 % d’éthanol et placés sur de la glace pendant cinq à 10 minutes. Pour les besoins de cette vidéo, nous allons continuer sur la paillasse du laboratoire. Cependant, à ce stade de l’expérience, tout doit être transféré dans une hotte de culture tissulaire.

Une fois que les os ont été trempés dans de l’éthanol, vous pouvez les déplacer dans une boîte plus grande de milieu stérile pour l’élimination de la moelle osseuse. Nous sommes maintenant prêts à retirer et à remettre en suspension la moelle osseuse. Remplissez une seringue à insuline avec un milieu stérile et placez-la sur le côté pour une utilisation ultérieure.

Saisissez l’os avec votre pince à épiler stérile. Tenez-le au-dessus d’une petite assiette pour les morceaux jetés et coupez l’épiphyse ou les extrémités de l’os de chaque côté. Placez votre seringue à insuline dans un côté de l’os et rincez la moelle de l’os dans 15 mils de support.

Lavez l’os une ou deux fois de plus jusqu’à ce que toute la moelle soit évacuée. Une fois que la moelle est évacuée de l’os, elle sera presque complètement blanche. Placez l’os propre dans le plat à jeter et répétez le processus de l’autre fémur.

Une fois cette opération terminée, perturbez doucement les morceaux de moelle osseuse qui n’ont pas été brisés par le processus de lavage pour créer une suspension à cellule unique. Cela prendra cinq à 10 minutes de pipetage. Placez une suspension à cellule unique dans un tube conique de 50 mils, lavez la plaque au moins trois fois avec 10 mils de support.

À chaque fois, faites tourner les cellules, retirez le support et remettez les cellules en suspension en effleurant fermement et vivement vos doigts contre le fond du tube. Pour éliminer les globules rouges ou GR, nous effectuons une lyse de l’eau. Une autre méthode d’élimination des globules rouges est la lyse au chlorure d’ammonium.

Les deux méthodes ont été décrites dans de précédents articles vidéo JoVE. Isolement de lymphocytes T positifs pour la souche de quatre à partir de ganglions lymphatiques de souris à l’aide de la purification Milan max JoVE numéro neuf et préparation du facteur de croissance des lymphocytes T à partir de cytes de rat JoVE. Numéro 10.

Après avoir retiré vos globules rouges, vous êtes maintenant prêts à vous cultiver. Donc, avant de vous faire découvrir la culture de cellules dendri, j’aimerais vous présenter le site de l’incus. Le site de l’incus permettra de soustraire la croissance de la culture cellulaire dans l’incubateur afin que nous puissions nous observer sur leur comportement ou leur mauvais comportement.

Une fois qu’une culture est installée, vous la placez dans un plateau de taille appropriée et faites glisser le site de l’incus pour le fermer. Ensuite, sur votre ordinateur, il vous suffit de définir l’intervalle de temps, puis de choisir les puits que vous souhaitez imager et de laisser le site d’encre collecter des données pour vous. Les films vous montreront dans ce protocole, démontrer les changements de morphologie des cellules dendritiques in vitro.

Ces vidéos ont été exportées directement depuis le programme du site Incus. Au fur et à mesure que les cellules dendritiques se développent du premier au 11e jour, vous pouvez voir un véritable changement de morphologie à mesure qu’elles s’agrandissent et adoptent le phénotype des cellules dendritiques. Après avoir lysé, les globules rouges et les avoir éliminés, les cellules sont lavées dans un milieu cellulaire dendritique primaire et plaquées à 5 millions par mil.

Ces cellules doivent être initialement cultivées dans des milieux de culture de cellules dendritiques primaires, puis nous les cultivons dans des milieux secondaires à courant continu, auxquels s’ajoute 40 nanogrammes par mil d’IL quatre et cent nanogrammes par mil de TNF alpha. Ces cytokines aideront au développement de cellules dendritiques matures qui ressemblent à des cellules dendritiques dérivées de monocytes. Alors maintenant, je vais vous montrer à quoi ressemblent les cultures au fur et à mesure qu’elles se développent et comment les maintenir au fil du temps.

Une fois que vous avez mis les cellules en placage, vous pouvez cultiver les cellules dendritiques pendant 72 heures avant votre premier changement de milieu. Voici à quoi ressemblera votre culture typique juste après avoir plaqué les cellules le premier jour. Et voici un aperçu des cellules.

Le troisième jour, vous pouvez voir que les cellules ont commencé à adhérer à la plaque mais n’ont pas pris le phénotype classique des cellules dendritiques. Le quatrième jour, retirez le milieu et ajoutez 10 mils de milieu primaire frais par aspiration du milieu. Le quatrième jour, nous éliminerons les lymphocytes de toutes les autres cellules non adhérentes.

Maintenant, vous pouvez vous remettre dans l’incubateur pendant encore trois jours, sept jours après votre placage initial. Voici à quoi ressemblera votre culture typique. Vous pouvez dire qu’il est temps de diviser les cellules et de les reconstituer.

Le septième jour, les cellules dendritiques sont retirées de la plaque en aspirant le milieu, puis en ajoutant 300 millimolaires d’EDTA stérile et en l’incubant pendant cinq minutes. Ensuite, la plaque est rincée à plusieurs reprises en la tenant à un angle de 45 degrés et en pipetant la solution EDTA contre l’arrière de la plaque. Ceci est fait pendant plusieurs minutes pour s’assurer que vous éliminez toutes les cellules dendritiques adhérentes.

Les cellules sont collectées dans un tube conique de 50 millimètres et lavées deux fois avec un support DC secondaire. Les cellules sont ensuite remises en suspension et plaquées à 5 millions de cellules par plaque. Les cellules dendritiques du septième jour fraîchement replaquées se déposent rapidement au fond de la plaque, adhèrent et commencent à s’étaler.

Comme vous pouvez le voir ici dans la vidéo du site Zichy, cette vidéo a été prise dans l’incubateur pendant deux jours pour vous montrer le développement des cellules dendritiques depuis le replacage initial effectué le septième jour jusqu’au neuvième jour. Les cellules dendritiques peuvent être activées dans l’impulsion d’antigène en ajoutant deux microgrammes par LLPS ici avec cent microgrammes pour les ovules à utiliser avec des lymphocytes T purifiés à partir de deux souris OT, qui ont des cellules T CD positives spécifiques aux ovules. Si vous utilisez un antigène différent, il est important de vous assurer que vous utilisez une concentration optimale d’antigène pour pulser vos dcs ici, les OV et LPS sont ajoutés aux milieux primaires de sorte que la concentration finale de LPS sera de deux microgrammes par mil dans 20 mils, et les ovules seront de cent microgrammes par mil dans 20 mils.

Voici une photographie de ce à quoi ressemble une culture typique de cellules dendritiques au jour 10. Vous pouvez voir sur cette photo que la morphologie est très typique d’une cellule présentatrice d’antigène. Vous devez toujours vérifier le pourcentage de cellules dendritiques positives pour le CD 11 C par télécopieur.

Il s’agit de s’assurer que vous disposez d’une culture relativement pure de cellules dendritiques à utiliser dans vos expériences. Ici, nous utilisons le site d’encre des instruments SEN pour surveiller l’activation des cellules dendritiques qui ont été traitées par LPS dans l’antigène pulsé au jour 10. Cette vidéo couvre une période de 24 heures immédiatement après l’ajout du LPS et du val et du peptide, et dans celle-ci, les cellules dendritiques deviennent plus actives et il y a des changements morphologiques évidents.

Une fois que vos cellules dendritiques ont été activées dans l’impulsion d’antigène, vous pouvez à nouveau les collecter par incubation avec 300 millimolaires d’EDTA et lavage de la plaque. Maintenant, faites tourner vos cellules, lavez-les deux fois avec 50 mils de média RPMI pour éliminer tout antigène supplémentaire et étiquetez-les avec le colorant de suivi cellulaire approprié. Dans cette expérience, je vais imager les cellules du ganglion lymphatique inguinal.

Nous devrons injecter de deux à 5 millions de cellules dendritiques dans la région du flanc de la souris montrée ici. Nous laissons ensuite 24 heures aux cellules dendritiques pour se loger vers le ganglion lymphatique d’entraînement. Ici, dans cette vidéo, les cellules dendritiques sont marquées avec CMF two hc, un colorant de traçage de cellules bleues.

Vous pouvez voir les cellules dendritiques interagir avec les lymphocytes T marqués qui sont spécifiques de l’antigène de la voline. Ces lymphocytes T sont marqués avec ccf SE. Vous pouvez également utiliser C-M-T-M-R ou l’un des autres colorants de suivi cellulaire pour les sondes moléculaires. Il s’agit de l’étape d’activation précoce des lymphocytes T qui interagissent avec les dcs.

Parce qu’ils sont spécifiques de l’antigène, vous pouvez voir que les lymphocytes T se collent aux vrilles des dc marqués en bleu. Ceci conclut notre protocole démontrant la préparation et l’utilisation de cellules dendritiques de moelle osseuse dérivées de souris dans une expérience d’imagerie à deux niveaux. Merci d’avoir regardé et bonne chance pour vos propres expériences.