Génération de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées murin pour l'utilisation dans l'imagerie 2-photons

La préparation de cellules dendritiques à partir de moelle osseuse fournit une excellente source de cellules présentatrices d'antigènes pouvant être utilisées pour des expériences in vitro ou in vivo en imagerie intravitale du système immunitaire. L'introduction de cellules présentatrices d'antigènes permet l'étude des interactions spécifiques entre cellules antigéniques dans le contexte du ganglion lymphatique vivant. Ici, nous démontrons l'isolement stérile de la moelle osseuse et les techniques de culture nécessaires à la production de cellules dendritiques matures.

En outre, nous suivons le développement des cellules dendritiques du jour un au jour 11. Ce développement est illustré par des images fixes et des vidéos en incubateur réalisées à l'aide de la technologie Incus de Scent Technologies. Enfin, nous montrons des cellules dendritiques issues de la moelle osseuse présentant l'antigène Cove à des lymphocytes T OT deux dans le ganglion lymphatique miroir.

Bonjour, je suis Melanie Matthew dans le laboratoire de Micah Halen à l'Université de Californie voisine. Vous êtes-vous déjà demandé ce qui se passe à l'intérieur du bioreacteur pendant que vos cellules se développent ? Aujourd'hui ?

Dans le cadre de notre protocole, nous allons vous montrer comment utiliser certains instruments sur place. L'appareil en temps réel vous permet de suivre la croissance des cultures cellulaires dans votre incubateur. Dans ce protocole, nous allons vous montrer comment isoler et préparer des cellules dérivées de la moelle osseuse et des cellules du groupe à partir de souris.

La première chose que je vais vous montrer consiste à retirer les os fémoraux et à isoler la moelle osseuse. Fixez d'abord l'animal. Ensuite, humidifiez l'animal avec de l'éthanol à 70 %. Effectuez la première incision le long de la ligne médiane de l'animal.

Ensuite, faites une incision à l'intérieur de la patte comme je vous le montre ici. Pour exposer le tissu musculaire situé au-dessus du fémur, vous devriez pouvoir écarter le muscle et saisir l'os important du fémur avec vos pinces de dissection. Tout en tenant l'os avec vos pinces de dissection, descendez le long de l'os et effectuez votre première incision juste en dessous de l'articulation.

Ensuite, faites remonter vos ciseaux le long du fémur et effectuez la coupe aussi près que possible du corps. Cela peut entraîner un peu de saignement, en particulier si vous sectionnez l'artère fémorale. Lorsque vous retirez le fémur, il est extrêmement important que l'os reste intact.

Comme vous pouvez le voir ici, les extrémités de l'os n'ont pas été coupées ni endommagées. Une fois le fémur retiré, enlevez tout tissu supplémentaire et placez le fémur dans une petite boîte contenant notre milieu PMI. Lors du retrait des tissus supplémentaires, veillez à ce que l'os du fémur ne s'assèche pas.

À ce stade, les os de fémur doivent être transférés dans une boîte contenant de l'éthanol à 70 % et placés sur de la glace pendant cinq à dix minutes. Aux fins de cette vidéo, nous poursuivrons sur le plan de travail du laboratoire. Toutefois, à ce stade de l'expérience, tout doit être transféré dans une hotte de culture tissulaire.

Une fois les os imbibés d'éthanol, vous pouvez les transférer dans une grande boîte de milieu stérile pour l'élimination de la moelle osseuse. Nous sommes maintenant prêts à prélever et à resuspendre la moelle osseuse. Remplissez une seringue à insuline avec du milieu stérile et mettez-la de côté pour une utilisation ultérieure.

Prenez l'os avec vos pinces stériles. Maintenez-le au-dessus d'une petite plaque destinée aux déchets et coupez l'épiphyse ou les extrémités de l'os de chaque côté. Insérez votre seringue à insuline dans un côté de l'os et rincez la moelle hors de l'os dans 15 mL de milieu.

Lavez l'os une ou deux fois supplémentaires jusqu'à ce que toute la moelle soit éliminée. Une fois que la moelle est complètement évacuée de l'os, celui-ci sera presque entièrement blanc. Placez l'os propre dans la boîte de déchets et répétez le processus avec l'autre fémur.

Une fois cette étape terminée, dissocier délicatement les morceaux de moelle qui n’ont pas été séparés lors du lavage afin d’obtenir une suspension monocellulaire. Cette opération prendra de cinq à dix minutes de pipetage. Placer la suspension monocellulaire dans un tube conique de 50 ml, puis laver la plaque au moins trois fois avec 10 ml de milieu.

À chaque fois, centrifuger les cellules, éliminer le milieu et resuspendre les cellules en tapotant fermement et rapidement le fond du tube avec les doigts. Pour éliminer les globules rouges ou GR, nous effectuons une lyse à l'eau. Une autre méthode d'élimination des globules rouges est la lyse par chlorure d'ammonium.

Les deux méthodes ont été décrites dans des articles vidéo précédents de JoVE. L'isolement des lymphocytes T CD4 positifs à partir des ganglions lymphatiques de souris à l'aide du système de purification Milan max, numéro de JoVE 9, et la préparation du facteur de croissance des lymphocytes T à partir de cellules de rat, numéro de JoVE 10.

Après l'élimination de vos globules rouges, vous êtes désormais prêts à être mis en culture. Avant de vous guider dans la culture des cellules dendritiques, je tiens à vous présenter le site incus. Le site incus permettra de suivre la croissance prévisible des cultures cellulaires à l'intérieur de l'incubateur, afin que nous puissions observer notre comportement, ou nos mauvais comportements.

Une fois la culture mise en place, vous la placez dans le plateau de taille appropriée et fermez le site incus. Ensuite, sur votre ordinateur, vous définissez simplement l'intervalle de temps, choisissez les puits que vous souhaitez imaginer, puis laissez le site inky recueillir les données pour vous. Les films présentés dans ce protocole démontreront les changements de morphologie des cellules dendritiques in vitro.

Ces vidéos ont été exportées directement à partir du programme du site Incus. Au fur et à mesure que les cellules dendritiques se développent du jour un au jour 11, on observe un changement réel de la morphologie, avec un agrandissement et l'acquisition du phénotype de cellule dendritique. Après lyse des globules rouges et leur élimination, les cellules sont lavées dans un milieu spécifique pour cellules dendritiques primaires et mises en culture à raison de 5 millions par millilitre.

Ces cellules doivent d'abord être cultivées dans un milieu de culture de cellules dendritiques primaires, puis nous les cultivons dans un milieu DC secondaire, supplémenté avec 40 nanogrammes par millilitre d'IL-4 et 100 nanogrammes par millilitre de TNF-alpha. Ces cytokines favoriseront le développement de cellules dendritiques matures ressemblant à des cellules dendritiques dérivées de monocytes. Je vais maintenant vous montrer à quoi ressemblent les cultures au fur et à mesure de leur développement et comment les maintenir dans le temps.

Une fois les cellules ensemencées, vous pouvez cultiver les cellules dendritiques pendant 72 heures avant le premier changement de milieu. Voici à quoi ressemblera typiquement votre culture juste après l'ensemencement des cellules au jour un. Et voici un aperçu des cellules.

Le troisième jour, vous pouvez observer que les cellules ont commencé à adhérer à la plaque mais n'ont pas encore acquis le phénotype classique des cellules dendritiques. Le quatrième jour, retirez le milieu et ajoutez 10 mils de milieu frais pour les DC primaires par aspiration du milieu. Le quatrième jour, nous éliminerons les lymphocytes ainsi que toute autre cellule non adhérente.

Vous pouvez maintenant remettre vos cultures dans l'incubateur pour une durée supplémentaire de trois jours, sept jours après la mise en culture initiale. Voici à quoi ressemblera votre culture typique. Vous pouvez constater qu'il est temps de séparer les cellules et de les repiquer.

Le septième jour, les cellules dendritiques sont retirées de la plaque en aspirant le milieu, puis en ajoutant 300 millimolaire de EDTA stérile et en incubant pendant cinq minutes. Ensuite, la plaque est rincée plusieurs fois en la tenant à un angle de 45 degrés et en pipetant la solution de EDTA contre l'arrière de la plaque. Cette étape est répétée pendant plusieurs minutes afin de s'assurer que toutes les cellules dendritiques adhérentes sont bien détachées.

Les cellules sont recueillies dans un tube conique de 50 millilitres et lavées deux fois avec le milieu DC secondaire. Les cellules sont ensuite resuspendues et mises en culture à raison de 5 millions de cellules par plaque. Les cellules dendritiques du jour sept, fraîchement repiquées, se déposent rapidement au fond de la plaque, adhèrent et commencent à s'étaler.

Comme vous pouvez le voir sur la vidéo du site Zichy, cette vidéo a été prise dans l'incubateur sur une période de deux jours afin de vous montrer le développement des cellules dendritiques, depuis la replaturation initiale effectuée au jour sept jusqu'au début du jour neuf. Les cellules dendritiques morphologiques peuvent être activées par un pulse d'antigène en ajoutant deux microgrammes par millilitre de LPS ici, avec cent microgrammes d'ovalbumine, à utiliser avec des lymphocytes T purifiés de souris OT-II, qui possèdent des lymphocytes T CD4 positifs spécifiques de l'ovalbumine. Si vous utilisez un antigène différent, il est important de vous assurer d'utiliser une concentration optimale d'antigène pour pulser vos cellules dendritiques. Ici, l'ovalbumine et le LPS sont ajoutés au milieu primaire de sorte que la concentration finale de LPS soit de deux microgrammes par millilitre dans 20 millilitres, et celle d'ovalbumine de cent microgrammes par millilitre dans 20 millilitres.

Voici une photographie montrant l'aspect d'une culture typique de cellules dendritiques au jour 10. Sur cette image, on observe que la morphologie est très caractéristique d'une cellule présentatrice d'antigène. Vous devez toujours vérifier le pourcentage de cellules dendritiques positives pour CD11c par cytométrie en flux.

Cela permet de s'assurer que vous disposez d'une culture relativement pure de cellules dendritiques destinée à vos expériences. Ici, nous utilisons le site inky de SEN Instruments pour surveiller l'activation des cellules dendritiques traitées par LPS et chargées en antigène le jour 10. Cette vidéo couvre une période de 24 heures juste après l'ajout de LPS ainsi que du val et du peptide, durant laquelle les cellules dendritiques deviennent plus actives et présentent certains changements morphologiques évidents.

Une fois que vos cellules dendritiques ont été activées lors de l'impulsion par l'antigène, vous pouvez à nouveau les récupérer par une incubation avec du EDTA à 300 millimolaire et en lavant la plaque. Ensuite, centrifugez vos cellules, puis lavez-les deux fois avec 50 mL de milieu RPMI afin d'éliminer tout antigène résiduel, et marquez-les avec le colorant traceur cellulaire approprié. Dans cette expérience, j'observerai les cellules dans le ganglion lymphatique inguinal.

Nous devrons injecter de deux à 5 millions de cellules dendritiques par voie dermique dans la région du flanc de la souris illustrée ici. Nous laissons ensuite 24 heures aux cellules dendritiques pour migrer vers le ganglion lymphatique cible. Dans cette vidéo, les cellules dendritiques sont marquées avec CMF deux hc, un colorant traceur cellulaire bleu.

Vous pouvez observer les cellules dendritiques interagissant avec des cellules T marquées spécifiques à l'antigène volin. Ces cellules T sont marquées avec du ccf SE. Vous pouvez également utiliser le C-M-T-M-R ou l'un des autres colorants traceurs cellulaires comme sondes moléculaires. Il s'agit du stade précoce d'activation des cellules T interagissant avec les DCs.

Étant donné qu'ils sont spécifiques aux antigènes, vous pouvez observer que les lymphocytes T adhèrent aux prolongements des DC marquées en bleu. Cela conclut notre protocole démontrant la préparation et l'utilisation de cellules dendritiques dérivées de moelle osseuse de souris dans une expérience d'imagerie à deux photons. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos propres expériences.