Name: De FAE au Matrigel 3: Le repiquage du Matrigel CSEh sur Matrigel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-10T15:33:00.000+00:00
Duration: 3 min 50 s
Description: Apprenez le repiquage des cellules souches embryonnaires humaines sur Matrigel sans couches nourricières. Cette méthode utilise la dispase et confirme la pluripotence par immunofluorescence pour des cultures optimales.

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Embryonnaires humaines études de cellules souches dans le laboratoire Teitell sont soutenus par un California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Subvention de démarrage RS1-00313. Nous remercions les membres du grand centre de médecine régénérative et de recherche sur les cellules souches à l&#39;UCLA, en particulier le Dr Clark Amander, le Dr Jerome Zack, et des membres de l&#39;UCLA large souches Facilité Institut noyau cellulaire pour leur soutien de nos études.

Fractionnement du Matrigel CSEh au Matrigel Habituellement, un confluentes 6-même assiette de CSEh sur Matrigel peut être divisé 1:03-1:05 à une autre plaque de Matrigel, les puits deviennent confluentes à nouveau 4-5 jours après fractionnement. <ol><li> CM et plaques Matrigel sont préparés comme décrit ci-dessus avant de se séparer. </li><li> Le jour de fractionnement, se laver chaque puits pour le fractionnement avec 1 x PBS, pH 7,4, ajoutez 1 ml de 1mg/ml dispase (une solution diluée d&#39;actions 5mg/ml avec DMEM/F12 médias) dans chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 3 min. </li><li> Laver chaque puits trois fois avec 1 x PBS, pH 7,4, ajoutez 1 ml d&#39;ES médias sans bFGF, utiliser un grattoir à cellules de gratter les colonies du fond du puits, de recueillir les CSEh en suspension dans un tube de 50ml Falcon, et par centrifugation à 200g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Pour ré-plaque de l&#39;CSEh sur des plaques de Matrigel, d&#39;abord laver les assiettes avec Matrigel DMEM/F12 et ajouter 2,5 ml de CM complétée par 10ng/ml bFGF par puits. Reprendre le culot de CSEh dans un volume approprié de CM complété avec 10ng/ml bFGF, une pipette la suspension cellulaire de haut en bas trois fois. (REMARQUE: Lorsque les CSEh au fractionnement proviennent de plaques de Matrigel, les massifs sont très faciles à casser, donc trois séries de pipetage est assez et plus de pipetage peut perturber le cours-colonies et de faire des cellules individuelles.) Aliquote de 0,5 ml de suspension par des touffes de CSEh puits de la plaque de 6 puits Matrigel pour atteindre 3ml ainsi que par un volume final. Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C. </li></ol> Détection des marqueurs de pluripotence par immunofluorescence Immunofluorescence est utilisée pour examiner l&#39;expression des marqueurs de pluripotence des CSEh Oct-4, SSEA-4 en cours de culture. <ol><li> Aspirer les médias d&#39;un puits et laver avec 1 x PBS, pH 7,4. Ajouter 2 ml de formaldéhyde de 3,7% pour le bien de fixer pendant 10 min. </li><li> Rincer à l&#39;1xPBS, pH 7,4, ajouter 2 ml de méthanol pour le bien et le lieu à -20 ° C pendant 2 min. </li><li> Rincer à l&#39;1xPBS, pH 7,4, et bloquer avec 1ml de serume bovin à 0,2% d&#39;albumine (BSA) pendant 5 min. </li><li> Ajouter 1 ml d&#39;anticorps de Oct-4 ou anti-h/mSSEA-4 (1:200 dilution dans 0,2% de BSA), et incuber à température ambiante pendant 1 heure ou à 4 ° C pendant la nuit. (REMARQUE: pour SSEA-4 taches, passez directement à l&#39;étape 6) </li><li> Rincer trois fois avec 1xPBS, pH 7,4, ajoutez-FITC conjugué IgG de lapin (1:500 dilution dans 0,2% de BSA), et incuber à température ambiante pendant 1 heure. </li><li> Rincer 3 fois avec 1xPBS, pH 7,4, et de mettre une goutte de solution de montage (peut contenir DAPI, si la visualisation nucléaire est souhaitée) au centre du puits. Mettez la lamelle sur le dessus des cellules, sceller avec du vernis à ongles, et d&#39;évaluer par microscopie d&#39;immunofluorescence. </li></ol> Embryonnaires humaines reçus de cellules souches ES médias (cellules souches embryonnaires): DMEM/F12 - 400ml Knockout Sérum Replacer - 100ml Non-acides aminés essentiels - 5ml 200 mM glutamax / BME Solution - 5ml Pénicilline / streptomycine - 5ml Mélangez bien et stocker finale Médias Culture CSEh dans des bouteilles de 500ml à 4 ° C. Bon pour un maximum de deux semaines. Culture MEF médias: DMEM - 1000ml FBS - 100ml Non-acides aminés essentiels - 10ml Glutamine - 10ml Penicllin / Streptomycine - 10ml Mélangez bien et stocker finale Médias Culture MEF à 4 ° C. 200 mM Glutamax / BME Solution: Glutamax - 100ml β-mercaptoéthanol (solution stock à 14,3) - 140 μ1 Mélangez deux solutions bien et puis des portions de 10ml aliquote. Gardez aliquotes à -20 ° C. bFGF solution (concentration finale de stock: 10 microgrammes / ml): bFGF (FGF2) - 50 mg 0,1% de BSA dans les 1xPBS, pH 7,4 - 5 ml Dissoudre 50 microgrammes de bFGF dans 0,1% de BSA 5ml de faire un 10 ug / ml stock. Aliquoter en portions de 500 ul. Conserver à -80 ° C. Collagénase IV Solution (1mg/ml): Collagénase IV - 50mg DMEM/F12 Médias - 50ml Ajouter la poudre de collagénase IV à un tube de 50ml Falcon. Dans la hotte, mélanger dans 50ml de stériles DMEM/F12 médias. Vortex la solution pour &lt;1 min. pour s&#39;assurer que la poudre soit dissoute. Dans la hotte, passer par un filtre de 0,22 um dans un nouveau tube 50ml stérile faucon. Cette solution est bonne pour un maximum de 2 semaines à 4 ° C. Dispase Solution (1mg/ml): Dispase 5mg/ml - 2ml Médias DMEM/F12 - 8ml Aliquoter solution commerciale Dispase 5mg/ml et conserver à -20 ° C. Diluer dispase à 1mg/ml utilisant DMEM/F12. Cette solution peut être conservée pendant 1 semaine à 4 ° C.

<ol><li>Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts+%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts .</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells+Nature+Biotechnology+19%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)"> Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li>
</ol>

Cette série de 3 vidéos démontre comment faire pousser des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sur fibroblastes de souris embryonnaires des cellules nourricières (MEF) (vidéo 1), comment les passage à Matrigel sans cellule d&#39;alimentation des plaques (vidéo 2), et comment maintenir CSEh par passage dans le chargeur Matrigel sans cellules conditions (vidéo 3). De nombreuses études antérieures ont montré que l&#39;entretien de viable, CSEh indifférenciées nécessite la culture sur cellules nourricières inactivées MEF. Cependant, ...

<table><tbody><tr><td>Substitut de sérum pour cession (KSR)</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax </td><td>Réactif</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Réactif</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631107</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Réactif</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase IV</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Réactif</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline / Streptomycine </td><td>Réactif</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine</td><td>Réactif</td><td>Chemicon International</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Réactif</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Oct-4</td><td>Réactif</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-h/mSSEA-4 Phyc&amp;#8211;rythrine conjugué à la souris IgG3</td><td>Réactif</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps IgG de lapin conjugué à la FITC</td><td>Réactif</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-152</td><td></td></tr></tbody></table>

de fae au matrigel 3: le repiquage du matrigel cseh sur matrigel

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

Cette vidéo montre comment maintenir la croissance de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) dans le chargeur sans cellules conditions et la manière de CSEh passage en continu dans le chargeur sans cellules conditions. Confirmation de CSEh pluripotence grandi dans le chargeur sans cellules par microscopie d&#39;immunofluorescence conditions est également démontrée.

De FAE au Matrigel 3: Le repiquage du Matrigel CSEh sur Matrigel

Cette vidéo démontre comment maintenir la croissance de cellules souches embryonnaires humaines (hESC) dans des conditions sans cellules nourricières et comment réaliser des passages continus...

Pour diviser des cellules souches embryonnaires humaines cultivées sur Matrigel deux Matrigel. Nous partons d'une plaque de six puits confluentes de cellules souches embryonnaires sur Matrigel, qui peuvent être divisées de un à trois, de un à cinq vers une autre plaque de Matrigel. Cela permet aux puits de devenir à nouveau confluentes, quatre à cinq jours après le fractionnement, le jour du fractionnement.Lavez chaque puits devant être divisé avec un XPBS pH 7,4. Ajoutez ensuite un millilitre de solution de dispaste à un milligramme par millilitre dans chaque puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Lavez chaque puits trois fois avec un XPBS pH 7,4.Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu pour cellules souches embryonnaires sans BF GF et utilisez un grattoir à cellules pour détacher les colonies du fond de la cavité. Récupérez les cellules souches embryonnaires en suspension dans un tube Falcon de 15 millilitres et faites-les précipiter par centrifugation à 200 × g pendant cinq minutes à température ambiante. Pour repiquer les cellules souches embryonnaires humaines sur des plaques de Matrigel, commencez par laver les plaques de Matrigel avec du D-M-E-M-F 12 et ajoutez 2,5 millilitres de milieu de conditionnement méthylique supplémenté en 10 nanogrammes par millilitre.Après avoir centrifugé les cellules, ajouter du BFGF par puits, puis resuspendre le culot de cellules souches auriculaires humaines dans un volume approprié de milieu contenant du BFGF à 10 nanogrammes par millilitre. Prélever la suspension cellulaire à la pipette et passer celle-ci trois fois de haut en bas.Gardez à l'esprit que les agrégats de cellules souches provenant du matrigel se fragmentent facilement. Ainsi, un pipetage trois fois suffit à rompre les agrégats, sans rendre les colonies trop petites. Enfin, aliquoter 0,5 millilitre de suspension de cellules souches humaines par puits afin d'obtenir trois mils par puits.En guise de volume final, assurez-vous que les agrégats cellulaires sont uniformément dispersés, puis placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés. Selon la lignée particulière de cellules souches amry, les cellules souches amry deviendront de nouveau confluentes quatre à cinq jours après le fractionnement. Lorsque les colonies commenceront à se toucher, il est important de savoir si vos cellules souches amry humaines conservent leur pluripotence ou leur caractère de cellules souches en culture.Pour vérifier la pluripotence des cellules au cours de la culture de cellules souches amry, nous utilisons la microscopie par immunofluorescence afin d'examiner l'expression des marqueurs de pluripotence, OCT4 et SSEA4, dans un des puits. Notre plaque à six puits est fixée et colorée pour OCT4 et SSEA4. Si nous observons que les cellules sont marquées de manière fluorescente pour ces deux marqueurs, nous savons alors que nos cellules souches embryonnaires humaines ont conservé leur pluripotence et peuvent être utilisées pour nos expériences.Nous venons de vous montrer comment cultiver et maintenir des cellules souches embryonnaires humaines pluripotentes, parmi les cellules embryonnaires, les fibroblastes, les cellules nourricières, et dans des conditions sans champ sur metro job. Voilà donc tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Dans cette vidéo, nous montrons comment notre laboratoire passages couramment HUES humaine lignées cellulaires embryonnaires souches à la trypsine.

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Cette vidéo montre comment faire pousser des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sur les cellules de fibroblastes de souris embryonnaires d'alimentation (MEF).

De MEFs à I Matrigel: CSEh repiquage en présence du MEF

Cette vidéo montre comment maintenir la croissance de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) dans le chargeur sans cellules conditions et la manière de CSEh passage en continu dans le chargeur sans cellules conditions. Confirmation de CSEh pluripotence grandi dans le chargeur sans cellules par microscopie d'immunofluorescence conditions est également démontrée.

De FAE au Matrigel 2: Fractionnement des CSEh MEFs sur Matrigel

Différenciation dirigée des CSEh dans des cellules spécifiques a suscité beaucoup d'intérêt en médecine régénérative. Nous fournissons un résumé concis, étape par étape pour déterminer le protocole...

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Malgré les efforts en cours pour les cultures de transition vers d'alimentation sans conditions, la dérivation et la culture de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) restent largement tributaires des co-cultures avec mangeoires embryonnaires de souris (MEF). Ici, nous montrons une nouvelle méthodologie pour éliminer rapidement départs à partir de cultures de CSEh avant l'expérimentation.

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Afin d’éviter les limitations associées au passage enzymatique ou mécanique des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et des cellules souches pluripotentes induites humaines (CSPhi) cultivées sur des cellules nourricières, nous avons mis au point une méthode rapide, efficace, rentable et à haut rendement pour la récolte de colonies de CSEh ou de CSPhi, maintenues sur une couche de cellules nourricières de fibroblastes de prépuce humain en utilisant la désadhésion médiée par l’EDTA.

Passage rapide, rentable et sans enzyme de cellules souches pluripotentes humaines sur des cellules nourricières par désadhérence médiée par l’acide éthylènediaminetétraacétique

Apprenez le repiquage des cellules souches embryonnaires humaines sur Matrigel sans couches nourricières. Cette méthode utilise la dispase et confirme la pluripotence par immunofluorescence pour des cultures optimales.

De FAE au Matrigel 3: Le repiquage du Matrigel CSEh sur Matrigel

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