Démonstration technique de l'hybridation tableau Whole Genome génomique comparative

La courte présentation suivante est une vidéo montrant le protocole d’hybridation pour le réseau de sous-mégabases de 27 K. Cette matrice ou matrice intelligente est composée de 26 946 clones séquencés individuellement et imprimés sur une seule diapositive. Ils sont repérés en double pour un total de 54 000 éléments par diapositive imprimés dans une zone de 18 x 54 millimètres.

Les données résultantes sont comparables à des réseaux d’oligopuces à haute densité sans nécessiter d’interprétation des données par la bio-informatique. L’un des principaux avantages de l’utilisation d’un grand réseau d’inserts tels que les clones arrière est qu’il permet d’utiliser aussi peu que 100 nanogrammes d’ADN d’échantillon sans amplification. Cela permet l’analyse d’une variété d’échantillons, tels que l’ADN du sang, des tissus congelés, des cellules triées et du matériel FFPE.

Le réseau intelligent s’est avéré utile dans le cadre clinique. À la BC Cancer Agency, l’analyse d’échantillons de plusieurs patients est facilement intégrée à la semaine de travail moyenne. Pour la cytogénétique.

La plupart des étapes utilisées dans le CGH en réseau sont similaires à celles du CGH conventionnel ou du poisson. Permettre une introduction rapide du protocole dans les laboratoires établis. La qualité de l’ADN est la plus grande influence sur les résultats des réseaux.

L’hybridation CGH, la mauvaise qualité ou l’ADN contaminé affecteront négativement l’incorporation de PSI dans le produit, ce qui entraînera des images sombres ou du bruit dans les données. Le spectrophotomètre NanoDrop est un excellent outil pour évaluer la qualité de l’ADN avant l’hybridation. Pour quantifier l’ensemble d’ADN, le NanoDrop pour mesurer l’acide nucléique et le mode pour mesurer l’ADN 50 blancs, le NanoDrop avec 1,5 microlitres de la même solution que votre échantillon remis en suspension.

Dans ce cas, il s’agit de l’eau Tris. Il a été démontré que l’EDTA a des effets négatifs potentiels sur l’incorporation du PS D. Retirez la lingette vierge avec une lingette Kim et ajoutez 1,5 microlitre de votre échantillon à mesurer et à enregistrer la concentration de votre échantillon.

La lecture de deux 60 sur deux 80 sur le NanoDrop est un bon indicateur de la qualité de l’ADN où un rapport de 1,8 est optimal. La méthode du double rapport deux 60 sur deux 80 et deux 60 sur deux 30 offre un moyen encore meilleur de déterminer la pureté de vos échantillons. Le NanoDrop affiche une courbe représentant l’absorbance par rapport à la longueur d’onde.

Une courbe lisse sans pics est indicative d’une bonne qualité d’essuyage de l’ADN et de nettoyage du NanoDrop avec de l’eau et une lingette Kim, ou si l’échantillon est limitant, pipetez l’échantillon hors du piédestal. Ce protocole est optimisé pour une taille d’échantillon comprise entre 100 et 400 nanogrammes. 200 nanogrammes est la quantité cible pour un ADN de bonne qualité Pour marquer l’échantillon, les réactifs et équipements suivants sont nécessaires.

Tampon SCI trois SCI cinq RE aléatoires 10 fois DNTP mélange de référence ADN eau stérile 0,2 microlitre tubes PCR stériles bloc de chaleur de glace à 100 degrés Celsius incubateur à 45 degrés Celsius. Installez un tube réactionnel pour l’ADN de référence et un tube réactionnel. Pour les échantillons d’ADN, ils seront marqués avec sci-fi et SCI trois respectivement.

Dans le cadre de la recherche, nous préférons utiliser le CY 3 pour notre échantillon d’ADN car il est plus résistant à la dégradation de l’ozone. Combinez votre tampon d’eau et de canal d’ADN à l’échantillon et répétez l’opération pour l’ADN de référence. Dans notre laboratoire, nous combinons le tampon 10 fois avec l’Optimus aléatoire.

Pour créer une solution en cinq temps, ajoutez de l’eau stérile à un volume total de 17 microlitres. Transférez les tubes dans un bloc chauffant, dénaturez pendant cinq minutes à 100 degrés Celsius. Transférer immédiatement dans la glace.

Ajouter quatre microlitres de 10 fois le mélange DNTP. Ajoutez les yeux latéraux. Ajoutez deux microlitres de SCI dont trois marqués DCTP à l’échantillon d’ADN.

Ajoutez deux microlitres de DCTP marqué de science-fiction à l’ADN de référence. Ajouter 2,5 microlitres de canal et mélanger. La solution peut être mélangée à la main ou à vortex.

Faites tourner brièvement la solution jusqu’au fond du tube avec une impulsion rapide dans une centrifugeuse de paillasse. Transférer dans un four et incuber à 37 degrés pendant la nuit. Le temps d’hybridation pendant la nuit peut être ajusté entre 14 et 24 heures sans nuire au processus d’étiquetage.

Pour s’adapter à un programme de laboratoire, à l’aide d’une colonne MicroCon YM 30, ajoutez 100 microlitres capturés 1D NA dans la colonne. Attention à ne pas toucher la membrane avec une pointe de pipette coincée. On sait que la variance de l’ADN d’un lot à l’autre se produit même lorsqu’il est acheté auprès de grands distributeurs.

Il est recommandé d’acheter et de tester de grands lots avant de les utiliser. Il y aura désormais deux tubes pour chaque hybridation d’échantillon, un de couleur bleue et un de couleur rouge. Combinez les tubes pour chaque échantillon et mélangez par pipetage.

Transférez ensuite toute la solution dans la membrane MicroCon. Placez la colonne dans le tube MicroCon fourni et faites-la tourner à 13 000 G pendant 10 minutes. La colonne MicroCon est une colonne d’exclusion de taille et piège l’ADN avec les colorants latéraux incorporés et permet aux colorants non incorporés de traverser la membrane.

Pour laver tout nucléotide résiduel non incorporé ou côté, ajoutez 200 microlitres d’eau distillée stérile à la membrane. Essorez à nouveau à 13 000 g pendant 10 minutes. Jetez le tube et ajoutez 45 microlitres de solution d’hybridation au sommet de la colonne du concentrateur MicroCon.

La solution d’hybridation que nous utilisons est Dig Easy de Roche Scientific, cinq microlitres de sperme de hareng partagé peuvent également être ajoutés à la solution. Traditionnellement, il était utilisé pour bloquer la liaison non compétitive à la surface de la glissière. L’avènement de nouvelles substances liantes a permis d’éliminer cette étape.

Cependant, il est parfois ajouté pour augmenter la viscosité de la solution d’hybridation. Inversez la colonne MicroCon et placez-la dans un nouveau tube étiqueté. Faites tourner le tube à 3000 G pendant trois minutes.

La solution s’accumulera au fond du nouveau tube. 1,5 microlitre de la solution sera utilisé pour la quantification de l’incorporation de DS. Réglez l’analyse NanoDrop To microarray, vide.

Le NanoDrop avec 1,5 microlitres d’excavation. Tampon d’hybridation facile. Mesurez le flan avec le NanoDrop.

La lecture doit être nulle. Retirez la lingette vierge avec une lingette kim et ajoutez 1,5 microlitre de votre échantillon mesurez et enregistrez l’incorporation de votre échantillon. Le NanoDrop vous donnera une concentration en mole PICA par microlitre des échantillons d’incorporation de colorant S3 et de science-fiction avec les incorporations ci-dessous.

Trois ole par microlitre doivent être considérés comme ayant trop peu de quatre Fluor Pour continuer, le NanoDrop affichera un graphique de l’absorbance en fonction de la longueur d’onde. Deux pics doivent être visibles, un pour chacun des yeux latéraux, essuyez et nettoyez le NanoDrop avec de l’eau et une lingette kim. Placez la housse Glissez-la sur un chauffe-diapositives ou un bloc chauffant préchauffé à 45 degrés Celsius pour maintenir la température d’hybridation.

Placez 42 microlitres de solution de sonde sur la lamelle de 22 millimètres sur 60 millimètres. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la solution. Une astuce rapide pour éliminer une bulle tenace consiste à prendre une nouvelle gaine et à faire éclater la bulle avec un coin pointu.

Alignez la glissière sur la solution de lamelle et de sonde. Abaissez un bord de la glissière, permettant le contact avec la solution d’hybridation. Continuez à abaisser un bord jusqu’à ce que la lamelle se fixe à la glissière avec une tension superficielle.

Inversez la diapositive. Placez la glissière dans une cassette d’hybridation, préchauffez-la à 45 degrés Celsius et ajoutez 10 microlitres d’eau dans la rainure inférieure pour contrôler l’humidité. Cette étape doit être pratiquée car la creuser se cristallise à des températures plus basses et laissera un arrière-plan sur la lame.

Ceci est particulièrement important lorsque la solution se trouve sur la lame, car il s’agit d’une très fine couche de liquide. À ce stade, fermez la cassette et incubez pendant 36 à 40 heures à 45 degrés Celsius. Le retrait de la glissière de la cassette d’hybridation est essentiel.

Creuser, cristallise facilement à température ambiante. La glissière doit être immédiatement immergée et la lamelle retirée dans la solution de lavage. Toutes les solutions de lavage doivent être préfabriquées et avoir un pH de sept, un pH non neutre peut dégrader les yeux latéraux.

Préchauffez la solution de lavage à 45 degrés Celsius. Ajoutez environ 60 millilitres de la solution de lavage dans un bocal Copeland avant d’ouvrir la chambre d’hybridation. Ouvrez la chambre.

Retirez la diapositive à l’aide d’une pince à épiler et ajoutez-la à la solution de lavage. Avec le couvercle toujours attaché, attendez 10 à 20 secondes et récupérez le couvercle avec une pince à épiler. Il aurait dû tomber de la glissière.

Il s’agit d’une étape importante car elle empêche la cristallisation du tampon Dig Easy et réduit toute rayure potentielle de la lame par le retrait mécanique de la lamelle. Lavez la diapositive trois fois dans une solution de lavage. Une minute chacun avec agitation.

Rincez la lame trois fois. Il ne doit pas y avoir de bulles résiduelles de la FDS dans la solution de lavage visibles après le dernier lavage. Laissez la lame dans la solution de lavage jusqu’au moment de la centrifugeuse.

Centrifugeuse Dans un tube Falcon de 50 millilitres à 700 G pendant une minute. Assurez-vous que le tube Falcon est sec avant de l’utiliser. Balayez immédiatement la diapositive car l’intensité du signal diminuera avec le temps.

En fonction des niveaux d’ozone ambiants, chaque scanner est différent, mais il existe des directives communes à suivre. Pour l’imagerie de diapositives. Les niveaux d’ozone ambiant sont critiques pendant le processus de balayage.

Les puces de science-fiction sont sensibles à l’ozone et se dégradent rapidement pendant une longue période de balayage. Il a été démontré que cinq parties par milliard d’ozone affectent le Sinq. Cela équivaut à une pollution légère du trafic par temps clair.

Il est recommandé d’utiliser l’ozonemètre pour enregistrer les niveaux d’ozone ambiant. Une image distincte est créée pour chaque canal S3 et SCI cinq. Les canaux peuvent être équilibrés en modifiant l’exposition, le temps, l’excitation, l’entrée ou la sensibilité de capture du scanner.

Ces images sont maintenant prêtes à être analysées.