Imagerie Les cellules T effectrices de mémoire dans l'oreille après induction de SRD adoptifs

Bonjour, je suis Melanie Matthew. Je suis étudiante diplômante dans le laboratoire de Micah Hollins à l'Université de Californie à Irvine, au sein du département de Physiologie et de Biomécanique. Aujourd'hui, avec le Dr Christine Beaton, nous allons vous montrer comment nous imager la population de lymphocytes T effecteurs ou mémoires en réponse dans l'oreille du rat.

Le Dr Christine Beaton induira d'abord une hypersensibilité de type retardé (DTH) dans l'oreille du rat. Ensuite, nous passerons à l'imagerie in situ de l'oreille du rat par microscopie biphotonique. Il y a deux jours, j'ai injecté des lymphocytes T spécifiques de l'albumine marqués avec la GFP dans un rat Lewis.

Aujourd'hui, je vais réaliser la même expérience sur le rat, mais au niveau de l'oreille. Dans l'oreille droite, je vais injecter de l'albumine. Et dans l'oreille gauche, je vais simplement injecter du PBS.

La dose d'albumine que j'injecte est de 20 microgrammes dans 20 microlitres. Et l'albumine que j'utilise est un mélange un pour un d'albumine marquée par le Texas Red et d'albumine non marquée. Voici donc le dispositif sur lequel je vais vous montrer comment je vais procéder à l'injection.

J'utilise donc ma main gauche, moi qui suis droitier. J'ai retiré le gant de ma main gauche afin de pouvoir placer un doigt sous l'oreille et l'autre au-dessus pour tendre la peau, ce qui me permet de voir précisément où se trouve l'aiguille et de pénétrer entre les deux couches de peau dans l'air, qui est très fine. Pour cela, j'utilise des aiguilles de calibre 27 afin d'avoir un instrument extrêmement fin pour cette manipulation.

Donc, si je le retourne, vous voyez clairement où est allé le Texas red et où est allé le PBS. Nous sommes maintenant à 42 heures après le défi, et je vais utiliser un micromètre à ressort pour mesurer l'épaisseur de l'oreille. Je vais mesurer les deux oreilles, l'oreille droite qui a été soumise au défi avec l'albumine et l'oreille gauche qui n'a pas été soumise au défi, et la différence d'épaisseur vous donnera une idée de l'intensité de l'inflammation.

Oh, 62 0 60 0 61, 0 60 ou 58 ou 57 ou 57. Et l'autre oreille 4 49 4 55 4 48,4 47 4 46, 4 50. Bonjour. Alors, Christine Beaton vient de nous remettre le rat qu'elle a prélevé après la mesure de la réponse DTH.

Nous les avons transportés ici sur de la glace. Il s'agit de l'oreille gauche du rat. Et nous sommes maintenant dans le laboratoire d'Ian Parker pour effectuer une microscopie à deux photons.

Je vais donc préparer ces oreilles pour une imagerie in situ à deux photons. Je vais préparer l'une des oreilles du rat ici à la base de l'oreille. Le tissu est beaucoup plus épais et certains poils dépassent, ce qui rendrait la manipulation un peu difficile si je commençais simplement à découper.

Tout d'abord, je vais couper une partie de ce poil. Je tiens simplement l’oreille délicatement. Mon doigt rend beaucoup plus facile le contrôle effectif du tissu lorsque vous le maintenez entre votre pouce et votre index.

Je préfère utiliser mes doigts plutôt que des pinces, car avec des pinces, je n'arrive pas aussi bien à sentir ce que fait le tissu, et nous craignons toujours d'endommager le tissu. Nous voulons donc pouvoir sentir ce que nous faisons. C'est pourquoi j'aime mieux utiliser mes doigts.

Ceci est la couche dermique qui se détache ici de l'oreille du rat. Lorsque je retirais certains poils, j'ai pu délicatement couper une partie de ce derme qui s'épluche légèrement. Utilisez de très petites ciseaux de dissection, de préférence des ciseaux courbes de bonne qualité.

Vous ne voulez pas piquer le tissu ; vous pouvez progresser doucement depuis la base de l'oreille jusqu'au sommet, en coupant délicatement une partie de la couche dermique. Nous n'avons pas besoin d'une très grande fenêtre pour l'imagerie. Cette zone juste ici sera suffisante pour obtenir de belles images des cellules qui s'infiltrent dans le tissu.

Vous pouvez donc voir que nous avons encore quelques vaisseaux sanguins intacts à la base de l'oreille, et pratiquement tout au long jusqu'à l'extrémité de l'oreille. Toute cette zone sera très appropriée pour l'imagerie du DTH. Je vais donc procéder à la découpe du fragment de tissu que j'ai exposé, afin d'obtenir un petit morceau de tissu que nous pourrons coller sur notre plateau d'imagerie.

Alors, faites simplement une incision ici, retournez-le. Je peux couper ici. Nous avons un petit morceau de tissu que nous pouvons préparer sur notre microscope à deux photons pour l'imagerie.

Il s'agit de lamelles en plastique incassables que nous découpons à la taille de notre tissu. Ensuite, nous montons le tissu sur ces dernières à l'aide de la colle bet. Puis, nous fixons ces lamelles en plastique incassables à l'aide de graisse de silicone sur notre plateau d'imagerie in situ.

Je vais prendre ce petit morceau de tissu aérien, qui présente une légère courbure, donc je devrai l'aplatir en le collant. Ce n'est pas idéal, mais cela fonctionnera. Vous prenez donc l'une de ces lamelles et vous la découpez, en estimant la taille de votre oreille, en la coupant légèrement plus grande que ce que vous pensez nécessaire.

Pour monter notre tissu sur la lame. Nous utilisons une colle super-résistante sans danger pour les tissus appelée bet long. Nous l'obtenons de chez 3M et en déposons simplement quelques gouttes sur notre lame.

Je ne veux pas en avoir trop. Et vous voulez aussi vous assurer que cela soit réparti uniformément. Je vais donc prendre un petit morceau de papier à lentilles et utiliser son coin pour répandre la colle sur toute la surface du couvre-objet ici.

Je vais ajouter un peu de colle supplémentaire, et dès que cette colle entrera en contact avec l'eau, elle polymérisera. Il faut donc manipuler l'échantillon de tissu avec beaucoup de précaution. Je vais donc saisir le coin du tissu ici, une partie que nous n'imagerons probablement pas, car elle se trouve sur la portion courbe.

Je vais l'essuyer un peu. Le fond, simplement sur du papier pour objectif, pour qu'il soit bien sec. Et je vais toucher le coin de celui-ci, ce tissu d'oreille de rat, à la lamelle.

Et cela devrait immédiatement corriger l'endroit que j'ai touché. Le reste, je vais simplement l'aplatir un peu en appuyant doucement dessus, sur ses bords. Ainsi, nous devrions pouvoir obtenir un bon cadre d'imagerie.

Je vais maintenant durcir la colle en l'immergeant dans du milieu. Afin d'éviter que la colle ne se dépose sur le dessus du tissu, nous le retournons et l'immergeons lentement, d'abord par un coin, dans notre réservoir de milieu. Il doit alors bien adhérer, ce qui nous permettra de l'observer dans notre chambre d'imagerie tissulaire. Nous allons maintenant monter sur la platine le fragment de tissu préparé pour l'imagerie in situ, à savoir le morceau de tissu de bière.

Voici donc notre fragment de tissu avec la graisse de silicone sur sa face inférieure, que nous plaçons délicatement dans le flux de milieu. À présent, il adhère au fond de la platine grâce à la graisse de silicone. Augmentez le débit du milieu en maintenant la sonde de température juste à côté.

Et maintenant, nous allons nous concentrer. J'active donc notre mise au point, la nouvelle lumière, notre éclairage intense. Je vais prendre notre objectif 20 x et l'abaisser dans la chambre.

Veillez à ce qu'il ne touche pas le tissu. Regardez à travers l'oculaire et focalisez-vous sur notre tissu auriculaire. Et voilà.

Ici, vous observez des follicules pileux verts autofluorescents dans la couche dermique de l'oreille du rat. Autour de ces follicules pileux se trouve une couche dense de collagène. Il s'agit d'une couche que nous éliminons pour l'imagerie des cellules T effectrices mémoires par photons T.

Les follicules pileux autofluorescents obscurciront l'image tout comme le collagène brillant de la couche dermique supérieure. Ici, vous pouvez voir que nous avons des CPA qui ont capté la voline conjuguée au Texas red, et qui sont nichées le long de ces fibres de collagène bleues. Les fibres de collagène apparaissent bleues en raison de la génération de second harmonique que nous obtenons en imagerie photonique le long des fibres de collagène.

Nous avons des lymphocytes T très mobiles. Ils se déplacent le long des fibres de collagène et interagissent avec les CPA. Dans cette vidéo, vous avez vu le Dr Christine Beaton induire une réaction de type hypersensibilité retardée adoptive chez le rat Lewis.

Ensuite, nous vous avons présenté notre préparation de l’oreille pour l’imagerie, les cellules mémoires T effectrices réactives, et l’oreille de rat ainsi que nos techniques d’imagerie à deux photons pour ce faire.