Imagerie Les cellules T effectrices de mémoire dans l'oreille après induction de SRD adoptifs

Bonjour, je m’appelle Melanie Matthew. Je suis étudiant diplômé dans le laboratoire de Micah Hollins à l’Université de Californie à Irvine dans le département de physiologie et de biophysique. Et aujourd’hui, avec la Dre Christine Beaton, nous allons vous montrer comment nous imaginons l’effet de réponse ou la population de lymphocytes T mémoires dans l’oreille du rat.

La Dre Christine Beaton induira d’abord une hypersensibilité retardée DTH dans l’oreille du rat. Ensuite, nous passerons à l’imagerie in situ de l’oreille de rat par deux photomicroscopies. Il y a deux jours, j’ai injecté de la GFP marquée de cellules T spécifiques à l’albumine dans l’hyper à un Lewis.

Et aujourd’hui, je vais défier le même rat dans l’oreille. Donc, dans l’oreille droite, je vais injecter de l’albumine. Et dans l’oreille gauche, je vais juste injecter un peu de PBS.

La dose d’albumine que j’injecte est de 20 microgrammes dans 20 microlitres. Et l’albumine que j’utilise est un mélange un à un de Texas Red étiqueté d’albumine et non étiqueté d’albumine. C’est donc le vers la droite sur lequel je vais vous montrer comment je vais injecter.

Donc j’ai ma main gauche, je suis droitier. Donc, ma main gauche, j’ai enlevé le gant pour pouvoir mettre un doigt sous l’oreille et l’autre au-dessus pour étirer la peau afin que je puisse voir exactement où j’en suis avec l’aiguille et passer entre les deux couches de peau dans l’air, qui est très mince. Donc, pour cela, j’utilise des aiguilles de calibre 27 pour avoir quelque chose d’extrêmement fin à y mettre.

Donc, si je le tourne, vous voyez certainement où est allé le rouge du Texas et où est allé le PBS. Nous sommes donc maintenant 42 heures après le défi ici et je vais utiliser un micromètre à ressort pour mesurer l’épaisseur de l’oreille. Je vais donc mesurer les deux oreilles, l’oreille droite qui a été mise à l’épreuve par l’albumine et l’oreille gauche qui n’a pas été mise à l’épreuve et la différence d’épaisseur de votre épaisseur nous donnera une idée de l’intensité de l’inflammation.

Oh, 62 0 60 0 61, 0 60 ou 58 ou 57 ou 57. Et l’autre oreille 4 49 4 55 4 48,4 47 4 46, 4 50. Hi.So Christine Beaton vient de nous donner le rat qu’elle a retiré après avoir mesuré la réponse DTH.

Nous les avons transportés ici sur de la glace. C’est l’oreille gauche du rat. Et nous sommes ici maintenant dans le laboratoire de Ian Parker en train de faire de la microscopie à deux photons.

Je vais donc préparer ces oreilles pour l’imagerie in situ à deux photons. Je vais donc préparer l’une des oreilles de rat ici à la base de l’oreille. Le tissu est beaucoup plus épais et nous avons des cheveux qui dépassent et qui vont être un peu salissants si je commence à les couper.

Donc, la première chose que je vais faire est de couper une partie de ces cheveux. Je tiens juste doucement l’oreille. Mon doigt facilite grandement le contrôle du tissu lorsque vous le tenez entre votre pouce et votre index.

Je préfère cela à l’utilisation de forceps parce que les forceps, je ne peux tout simplement pas sentir ce que fait le tissu aussi facilement et nous craignons toujours d’endommager le tissu. Nous voulons donc pouvoir ressentir ce que nous en faisons. Alors j’aime juste utiliser mes doigts.

C’est la couche dermique qui se décolle d’ici dans l’oreille de rat. Donc, pendant que je coupais une partie des cheveux, j’ai pu couper doucement une partie de ces dermes, comme si elle se décollait. Il y a de très petits ciseaux de dissection pour le faire, juste de jolis ciseaux incurvés.

Vous ne voulez pas piquer le tissu et vous pouvez remonter de la base de l’oreille vers le haut, en coupant doucement une partie de la couche dermique. Nous n’avons donc pas besoin d’une très grande fenêtre pour l’imagerie. Cette zone juste ici sera suffisante pour obtenir de belles images des cellules infiltrant les tissus.

Vous pouvez donc voir que nous avons encore des vaisseaux sanguins intacts ici à la base de l’oreille et à peu près jusqu’au bout de l’oreille. Toute cette zone sera vraiment bonne pour l’imagerie DTH. Je vais donc couper ce morceau de tissu que j’ai exposé pour en faire un petit morceau de tissu que nous pouvons coller à notre étape d’imagerie.

Alors faites simplement une coupe ici, retournez-la. Je peux couper ici. Nous avons un joli petit morceau de tissu que nous pouvons préparer sur notre télescope à deux photons pour l’imagerie.

Il s’agit de lamelles en plastique incassables que nous coupons à la taille de nos tissus. Ensuite, nous montons le tissu sur ceux-ci à l’aide de la liaison bet. Ensuite, nous fixons ces lamelles en plastique incassables à l’aide de graisse silicone sur notre platine d’imagerie in situ.

Je vais prendre ce petit morceau de tissu aérien, il a une petite courbure, donc je vais devoir l’aplatir pendant que je le colle. Ce n’est pas l’idéal, mais ça va marcher. Il suffit donc de prendre l’une de ces lamelles et de la couper, d’estimer la taille de votre oreille et de la couper un peu plus grande que ce que vous pensez.

Pour monter notre mouchoir sur la lamelle. Nous utilisons une super colle sans danger pour les tissus appelée bet long. Nous l’obtenons de 3M et nous en mettons simplement quelques gouttes sur notre bordereau de couverture.

Je ne veux pas en avoir trop. Et vous voulez également vous assurer qu’il est réparti de manière égale. Je vais donc simplement prendre un petit morceau de papier pour objectif et utiliser le coin de celui-ci pour évacuer la colle sur la lamelle ici.

Je vais tellement monter un peu à la colle supplémentaire et dès que cette colle touche l’eau, elle durcira. Vous devez donc être très prudent avec votre échantillon de tissu. Je vais donc saisir le coin du tissu ici que nous n’allons probablement pas imager car il se trouve sur la partie incurvée.

Je vais le sécher juste un peu. Le bas de celui-ci, juste sur le papier de l’objectif pour que tout soit sec. Et je vais toucher le coin de celui-ci, ce tissu d’oreille de rat à la lamelle.

Et il devrait guérir immédiatement là où je l’ai touché. Le reste, je vais juste aplatir un peu en appuyant doucement dessus, les bords. J’espère donc que nous pourrons avoir un bon cadre d’imagerie.

Alors maintenant, ce que je vais faire, c’est durcir la colle en la trempant dans un support. Donc, pour éviter que la colle ne retombe sur le tissu, nous le retournons et le trempons lentement dans un coin d’abord dans notre réservoir de support et il devrait être bien collé et nous pouvons l’imager dans notre chambre d’imagerie tissulaire. Nous allons maintenant monter le morceau de tissu que nous avons préparé pour l’imagerie in situ, le morceau de tissu de bière sur la scène.

Voici donc notre morceau de tissu avec la graisse silicone au fond, et nous le plaçons doucement dans le flux de support. Maintenant, il est collé au bas de la scène est la graisse silicone. Éclaircissez le flux de fluides avec notre sonde de température juste à côté.

Et maintenant, nous allons nous concentrer. Je vais donc allumer notre concentration, une nouvelle lumière, notre peau lumineuse. Je vais donc prendre notre objectif 20 x et le descendre dans la chambre.

Assurez-vous qu’il ne touche pas le tissu. Regardez à travers l’oculaire et concentrez-vous sur notre tissu auditif. Et voilà.

Ici, vous voyez des follicules pileux verts autofluorescents dans la couche dermique de l’oreille de rat. Autour de ces follicules pileux se trouve une couche dense de collagène. Il s’agit d’une couche que nous enlevons pour l’imagerie des photons T des cellules de mémoire du fector T.

Les follicules pileux autofluorescents obscurcissent l’image, tout comme le collagène brillant de la couche supérieure du derme. D’accord, vous pouvez voir ici que nous avons des APC qui ont adopté le volin conjugué rouge du Texas, et ils sont nichés le long de ces fibres de collagène bleues. Les fibres de collagène sont bleues en raison de la génération de deuxième harmonique que nous obtenons dans l’imagerie de photons le long des fibres de collagène.

Nous avons une cellule très mobile. Ils rampent de haut en bas dans les fibres de collagène et interagissent avec les APC. Donc, dans cette vidéo, vous avez vu le Dr Christine Beaton, induire un DTH adoptif chez le rat Lewis.

Ensuite, nous vous avons montré notre préparation de l’oreille pour l’imagerie, les cellules de mémoire effectrices T réactives, l’oreille de rat et nos deux techniques de photons pour le faire.