Isolement des noyaux neuronaux à partir de tissus post-mortem du cerveau de l'homme

Afin d’étudier les interactions entre la chromatine et l’ADN qui régissent l’expression des gènes neuronaux spécifiques dans le cerveau humain, il faut d’abord obtenir une population pure de noyaux neuronaux. Le tissu cérébral humain post-mortem est homogénéisé et les noyaux totaux sont isolés par centrifugation à gradient de densité. Ensuite, les noyaux sont marqués avec des anticorps spécifiques neuronaux isolés par tri métrique en flux, et enfin concentrés par ultracentrifugation.

Bonjour, je suis Anish Matan du laboratoire du Dr Sharon mc Barian ici dans le département de psychiatrie de la faculté de médecine de l’Université du Massachusetts. Aujourd’hui, je vais vous montrer une procédure d’isolement des noyaux neuronaux à partir de tissus cérébraux humains post-mortem. Alors commençons.

Pour chaque échantillon de noyaux à trier, commencez avec un millimilligramme de tissu cérébral postmortel congelé. Avec cette quantité, vous pouvez obtenir environ 5 millions de noyaux neuronaux après tri activé par fluorescence. Pour commencer l’extraction des noyaux, placez 250 milligrammes de tissu cérébral dans un duvet contenant cinq mils de tampon de lyse, et placez-le sur de la glace.

Une fois que le tissu décongèle, il est sur la glace. Après l’abattage, transférez le tissu homogénéisé dans un tube d’ultracentrifugation transparent de 15 mil, puis placez le tube sur de la glace. Répétez cette homogénéisation pour le tissu restant.

Ensuite, pipetez soigneusement neuf mils de solution de saccharose au fond des tubes d’ultracentrifugation pour établir un gradient de concentration tel que la solution tissulaire homogénéisée soit au-dessus de la solution de saccharose. Maintenant, pesez les tubes d’ultracentrifugation pour vous assurer qu’ils sont équilibrés pendant l’ultracentrifugation. Ajustez le poids en ajoutant un tampon de lyse à la couche supérieure Une fois les tubes pesés, placez-les dans l’ultracentrifugeuse à l’aide des échantillons d’ultracentrifugeuse à rotor SW 28 à 107163.6 RCF pendant 2,5 heures à quatre degrés.

Une fois la centrifugation terminée, aspirez le silet ainsi que la couche de débris trouvée au gradient de concentration. Attention à ne pas déranger la pastille au fond du tube, qui contient les noyaux. Ensuite, ajoutez 500 microlitres d’un XPBS à chaque granulé et laissez-le reposer sur de la glace pendant 20 minutes.

Après 20 minutes, mettez les granulés en suspension en les pipetant de haut en bas. L’incubation sur glace permet aux granulés de se dissoudre un peu d’eux-mêmes, ce qui facilite la remise en suspension des noyaux, réduisant ainsi la quantité de stress subie par les noyaux. Transférez ensuite le réustensif et les noyaux dans deux tubes à centrifuger mil.

Combinez la solution nucléique de deux des tubes ultra-centrificateurs dans chaque tube microcentrifi et placez à nouveau les échantillons sur de la glace. Maintenant que l’extraction nucléique est terminée, je vais passer à l’étape de l’immuno marquage afin d’isoler les noyaux neuronaux en fait, le tri de l’échantillon contenant des noyaux sera incubé avec un mélange d’immuno coloration composé d’anticorps primaires et secondaires, ainsi que des liens bloquants pour faire le mélange d’immuno coloration à 1,2 microlitres d’anticorps neuronal spécifique nouveau N à 300 microlitres d’un XPBS. Ajoutez ensuite une centaine de microlitres de mélange de blocage, qui contient 0,5 % de sérum BS, A et 10 % de sérum de code normal dans un XPBS.

Enfin, ajoutez un microlitre de l’anticorps secondaire appelé LOR 4 88. Préparez également une immunocoloration pour un échantillon de contrôle négatif pour ce mélange d’immunocoloration. Excluez la nouvelle extrémité de l’anticorps primaire et remplacez-la par 1,2 microlitre d’un XPBS.

Maintenant, utilisez des mélanges d’immunocoloration vortex et incubez-les pendant cinq minutes à température ambiante dans l’obscurité pendant que les mélanges de coloration sont en incubation. Préparez les échantillons de noyaux de contrôle pour l’échantillon de contrôle négatif Eloqua 20 microlitres de la réanimation s’étendent sur les noyaux dans un tube de deux mil contenant 980 microlitres d’un XPBS. Préparez également un témoin non coloré, qui ne contient que la solution de noyaux et le PBS.

Maintenant, Eloqua 20 microlitres des noyaux dans un autre tube et augmentez le volume à un mil avec un XPBS. Remettez ensuite tous les échantillons sur de la glace. À présent, les mélanges d’immunocoloration sont terminés.

En incubation, ajoutez 401 microlitres du mélange dans l’échantillon approprié. L’échantillon de noyaux a reçu le mélange contenant à la fois des échantillons neufs et LOR 4 88. L’échantillon témoin négatif a reçu un mélange contenant uniquement l’anticorps secondaire LOR 4 88, tandis qu’aucun immunocolorant n’a été ajouté à l’échantillon témoin non coloré.

Ensuite, transférez les échantillons dans le coldron et faites-les pivoter dans l’obscurité pendant 45 minutes. Maintenant que l’incubation de 45 minutes est terminée, je vais amener les échantillons à la plateforme de cytométrie en flux de la faculté de médecine de l’Université du Massachusetts pour effectuer un tri activé par fluorescence Pendant le transport vers la plate-forme, les échantillons doivent être conservés sur de la glace et dans l’obscurité. À la plateforme de cytométrie en flux, les échantillons sont d’abord filtrés à travers un filtre de 40 microns, puis ils sont passés dans l’instrument pendant quelques minutes tout en étant conservés au froid.

Ceci est fait afin d’obtenir des données préliminaires avant le tri. Le contrôle non coloré établit le degré de fluorescence négative. Sur la base de ces informations, ajustez la sensibilité de la machine à la fluorescence.

Le témoin coloré est utilisé pour lutter contre la grippe. Tout bruit de fond dû à une absence de fluorescence à ce stade permet de définir les portes appropriées requises pour le tri. Plusieurs portes différentes sont utilisées pour trier les échantillons.

Voici quelques données typiques pour la première porte. Ce tableau d’analyse de télécopie montre un échantillon représentatif après l’ajustement de la porte. La première porte reconnaît les modèles de débris et les noyaux viables en fonction d’une combinaison de paramètres tels que la fluorescence et l’expérience visuelle générale.

L’axe des x représente la diffusion vers l’avant, qui correspond à la taille relative, tandis que l’axe des y tient compte de la diffusion du site, qui tient compte de la complexité interne telle que la granularité. La première porte peut également donner une idée de la taille des différents noyaux présents dans notre échantillon. Cela permet de séparer les débris des noyaux réels, et voici quelques données typiques de la deuxième porte.

Ce graphique de télécopie montre un exemple de deuxième porte, qui permet de trier les noyaux individuellement tout en éliminant les agrégats. Cette porte examine les différences de durée que les noyaux mettent pour passer à travers le laser. Ceux qui sont des agrégats mettent normalement plus de temps à passer.

Ce paramètre particulier est très important car l’inclusion d’agrégats peut interférer avec la pureté puisque certains noyaux fluorescents peuvent être liés à des nuclées non fluorescentes. Enfin, voici les données typiques de la troisième porte. Cette porte est réglée sur une longueur d’onde de fluorescence spécifique correspondant à celle du fluoron présent dans notre anticorps secondaire.

Sur cette carte de télécopie, vous voyez le niveau de fluorescence le long de l’axe des x et un détecteur de canal rouge foncé, PECY sept le long de l’axe Y. Ces taches de points donnent un meilleur visuel lorsqu’elles sont simplement comparées à un histogramme à couleur unique. La mise en place de SCADA permet de trier et de séparer les noyaux neuronaux nouveaux et positifs des nouveaux noyaux non neuronaux négatifs.

Une fois que toutes les portes ont été choisies, les noyaux sont triés en un seul XPBS. Une fois que l’ensemble de l’échantillon est passé par le tri des faits, vérifiez la pureté du tri en faisant passer un Eloqua de l’échantillon trié dans l’instrument. Voici un exemple de résultat optimal.

Ici, comparez l’échantillon de tri préliminaire, qui contient une population mixte de noyaux, à l’Eloqua trié qui a éliminé la plupart des noyaux négatifs. Notez que les pourcentages de pureté sont basés sur le nombre d’événements qui contaminent l’échantillon en fonction des portes qui ont été définies. Gardez à l’esprit que la première fois que l’échantillon est passé dans la machine, un certain blanchiment peut se produire, provoquant ainsi une certaine gradation pour en tenir compte, certains ajustements peuvent devoir être effectués.

Une fois l’échantillon trié, commencez à traiter les noyaux. Pour ce faire, prélevez 10 mils de l’échantillon trié et ajoutez deux mils de solution de saccharose, 50 microlitres d’une molaire de chlorure de calcium et 30 microlitres d’une molaire d’acétate de magnésium. S’il y a moins de 10 mils d’échantillon trié, augmentez le volume jusqu’à 10 mils en ajoutant un XPBS ou ajustez les matériaux supplémentaires en conséquence.

Ensuite, retournez l’échantillon plusieurs fois et placez-le sur de la glace pendant 15 minutes. Après 15 minutes, l’échantillon de caractéristique centrifuge dans un rotor à godets pivotants 1, 786 RCF pendant 15 minutes à quatre degrés. Après centrifugation, aspirez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille blanche qui se trouve au fond du tube.

Dissoudre ensuite la pastille dans 200 microlitres de la solution appropriée nécessaire aux expériences précédentes. Dans ce cas, nous dissolvons la pastille et la mémoire tampon pour l’expérience ultérieure de la puce. Ensuite, remettez le granulé en suspension par tuyau de haut en bas.

À ce stade, vous pouvez transférer les noyaux dans un tube plus petit et le placer dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius. Jusqu’à ce qu’une utilisation ultérieure, eh bien, je viens de vous montrer comment isoler les noyaux neuronaux du tissu cérébral humain post-mortem. Avec ces noyaux, vous pouvez effectuer un certain nombre d’analyses différentes telles que l’immunoprécipitation de la chromatine.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de toujours garder vos échantillons sur de la glace car les noyaux ne sont pas fixés et peuvent se dégrader à longue température. De plus, il est important de manipuler les tissus humains selon des normes de sécurité de niveau de biosécurité deux ou supérieures. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.