Isolement des noyaux neuronaux à partir de tissus post-mortem du cerveau de l'homme

Afin d'étudier les interactions entre l'ADN chromatinien qui régulent l'expression génique spécifique aux neurones dans le cerveau humain, une population purifiée de noyaux neuronaux doit d'abord être obtenue. Le tissu cérébral humain post-mortem est homogénéisé et l'ensemble des noyaux est isolé par centrifugation en gradient de densité. Ensuite, les noyaux sont marqués par des anticorps spécifiques aux neurones, puis isolés par tri cytométrique en flux et, enfin, concentrés par ultracentrifugation.

Bonjour, je suis Anish Matan du laboratoire de la Dre Sharon mc Barian, au sein du département de psychiatrie de l'École de médecine de l'Université du Massachusetts. Aujourd'hui, je vais vous montrer une procédure d'isolement de noyaux neuronaux à partir de tissu cérébral humain post-mortem. Commençons sans plus tarder.

Pour chaque échantillon de noyaux à trier, commencez avec mille milligrammes de tissu cérébral post-mortem congelé. Avec cette quantité, vous pouvez obtenir environ 5 millions de noyaux neuronaux après tri activé par fluorescence. Pour commencer l'extraction des noyaux, placez 250 milligrammes de tissu cérébral dans un homogénéisateur Dounce contenant cinq millilitres de tampon de lyse, puis placez-le sur de la glace.

Une fois que le tissu est décongelé, laissez-le pendant une minute sur de la glace. Après cette étape, transférez le tissu homogénéisé dans un tube transparent de centrifugation ultracentrifuge de 15 ml, puis placez le tube sur de la glace. Répétez cette homogénéisation pour le tissu restant.

Ensuite, pipetez soigneusement neuf millilitres de solution de saccharose au fond des tubes d'ultracentrifugation afin d'établir un gradient de concentration tel que la solution de tissu homogénéisé se trouve au-dessus de la solution de saccharose. Pesez maintenant les tubes d'ultracentrifugation pour vous assurer qu'ils sont équilibrés pendant l'ultracentrifugation. Effectuez les ajustements de poids nécessaires en ajoutant du tampon de lyse à la couche supérieure. Une fois les tubes pesés, placez-les dans l'ultracentrifugeuse en utilisant le rotor SW 28, et centrifugez les échantillons à 107163,6 RCF pendant 2,5 heures à quatre degrés.

Une fois la centrifugation terminée, aspirez le surnageant ainsi que la couche de débris située au niveau du gradient de concentration. Veillez à ne pas perturber le culot au fond du tube, qui contient les noyaux. Ensuite, ajoutez 500 microlitres d'un XPBS à chaque culot et laissez reposer sur de la glace pendant 20 minutes.

Après 20 minutes, resuspendre les culots en aspirant et expulsant plusieurs fois à l’aide d’une pipette. L’incubation sur glace permet aux culots de se dissocier légèrement d’eux-mêmes, ce qui facilite la resuspension des noyaux et réduit ainsi la contrainte subie par ceux-ci. Ensuite, transférer la suspension et les noyaux dans deux tubes de centrifugation de 2 mL.

Combiner la solution d'acides nucléiques provenant de deux des tubes d'ultracentrifugation dans chaque tube de microcentrifugation, puis remettre les échantillons sur glace. Maintenant que l'extraction des acides nucléiques est terminée, je vais passer à l'étape de marquage immunologique afin d'isoler les noyaux neuronaux par tri FACS. L'échantillon contenant les noyaux sera incubé avec un mélange de marquage immunologique composé d'anticorps primaires et secondaires, ainsi que de solutions de blocage. Pour préparer le mélange de marquage immunologique, ajouter 1,2 microlitre d'anticorps spécifique neuronal N (NEUN) à 300 microlitres de PBS 1X. Puis ajouter 100 microlitres de mélange de blocage, contenant 0,5 % de BSA et 10 % de sérum de cheval normal dans du PBS 1X.

Enfin, ajoutez un microlitre d'anticorps secondaire appelé LOR 4 88. Préparez également une coloration immuno pour un échantillon contrôle négatif à l'aide de ce mélange de coloration immuno. Excluez l'anticorps primaire new end et remplacez-le par 1,2 microlitre de 1 XPBS.

Maintenant, vortexer les mélanges d'immunomarquage et les incuber pendant cinq minutes à température ambiante à l'abri de la lumière, pendant que les mélanges de marquage s'incubent. Préparez les échantillons de noyaux témoins pour l'échantillon témoin négatif : ajoutez 20 microlitres des noyaux resuspendus dans un tube de deux millilitres contenant 980 microlitres de PBS 1X. Préparez également un témoin non marqué, contenant uniquement la solution de noyaux et du PBS.

Éloquez maintenant 20 microlitres des noyaux dans un autre tube et ramenez le volume à un millilitre avec du PBS 1X. Replacez ensuite tous les échantillons sur de la glace. À ce stade, les mélanges de coloration immunologique sont terminés.

Incuber, ajouter 401 microlitres du mélange dans l'échantillon approprié. L'échantillon de noyaux a reçu le mélange contenant à la fois le nouveau marqueur et LOR 4 88. L'échantillon témoin négatif a reçu un mélange contenant uniquement l'anticorps secondaire LOR 4 88, tandis qu'aucune coloration immuno n'est ajoutée à l'échantillon témoin non coloré.

Ensuite, transférez les échantillons vers le coldron et faites-les tourner à l’obscurité pendant 45 minutes. Maintenant que l'incubation de 45 minutes est terminée, je vais transporter les échantillons jusqu'au centre de cytométrie en flux de l'École de médecine de l'Université du Massachusetts pour effectuer un tri activé par fluorescence. Pendant le transport vers le centre, les échantillons doivent être conservés sur glace et à l’obscurité. Au centre de cytométrie en flux, les échantillons sont d'abord filtrés à travers un filtre de 40 microns, puis analysés à l’aide de l’appareil pendant quelques minutes, en restant au froid.

Cela est effectué afin d'obtenir des données préliminaires avant le tri. Le témoin non marqué établit le degré de fluorescence négative. Sur la base de ces informations, ajustez la sensibilité de l'appareil à la fluorescence.

Le témoin coloré est utilisé pour contrôler la grippe. Tout bruit de fond dû à la fluorescence hors cible à ce stade permet de définir les portes appropriées nécessaires au tri. Plusieurs portes différentes sont utilisées pour trier les échantillons.

Voici quelques données typiques pour le premier plot. Ce diagramme d'analyse FAX présente un échantillon représentatif après ajustement du plot. Le premier plot reconnaît les motifs de débris et de noyaux viables selon une combinaison de paramètres tels que la fluorescence et l'expérience visuelle générale.

L'axe des x représente la diffusion avant, qui correspond à la taille relative, tandis que l'axe des y tient compte de la diffusion latérale, qui reflète la complexité interne telle que la granularité. La première fenêtre peut également donner une indication sur la taille des différents noyaux présents dans notre échantillon. Cela permet de distinguer les débris des noyaux réels, et voici quelques données typiques provenant de la deuxième fenêtre.

Ce diagramme de tri montre un exemple de deuxième fenêtre, qui permet de trier les noyaux individuellement tout en éliminant les agrégats. Cette fenêtre examine les différences de durée que mettent les noyaux pour traverser le laser. Les agrégats mettent généralement plus de temps à passer.

Ce paramètre particulier est très important, car la présence d'agrégats peut interférer avec la pureté, puisque certains nucléotides fluorescents peuvent être liés à des nucléotides non fluorescents. Enfin, voici des données typiques provenant de la troisième fenêtre. Cette fenêtre est réglée sur une longueur d'onde de fluorescence spécifique correspondant à celle du fluorochrome présent dans notre anticorps secondaire.

Dans ce graphique de cytométrie, vous observez le niveau de fluorescence sur l'axe des x et un détecteur en canal rouge profond, PECY sept, sur l'axe des y. Ces dot plots offrent une visualisation plus claire par rapport à un histogramme à couleur unique. L'utilisation de SCADA permet de trier et de séparer les noyaux neuronaux nouveaux et positifs des noyaux non neuronaux nouveaux et négatifs.

Une fois tous les paramètres choisis, les noyaux sont triés dans un seul XPBS. Après que l'ensemble de l'échantillon ait été trié, vérifiez la pureté du tri en analysant un Eloqua de l'échantillon trié à l’aide de l’appareil. Voici un exemple de résultat optimal.

Ici, comparer l'échantillon présélectionné, qui contient une population mixte de noyaux, au noyau Eloqua trié, qui a éliminé la majorité des noyaux négatifs. Remarquer que les pourcentages de pureté sont basés sur le nombre d'événements qui contaminent l'échantillon selon les fenêtres définies. Garder à l'esprit que lors du premier passage de l'échantillon dans la machine, un certain blanchiment peut survenir, provoquant ainsi un affaiblissement du signal ; pour tenir compte de ce phénomène, certains ajustements peuvent être nécessaires.

Une fois l'échantillon trié, commencez le traitement des noyaux. Pour ce faire, prenez 10 mils de l'échantillon trié et ajoutez deux mils de solution de saccharose, 50 microlitres de chlorure de calcium à un molaire et 30 microlitres d'acétate de magnésium à un molaire. S'il y a moins de 10 mils d'échantillon trié, augmentez le volume jusqu'à 10 mils en ajoutant un XPBS ou ajustez les matériaux supplémentaires en conséquence.

Ensuite, retournez l'échantillon plusieurs fois et placez-le sur de la glace pendant 15 minutes. Après 15 minutes, centrifugez l'échantillon dans un rotor à godets oscillants à 1 786 RCF pendant 15 minutes à quatre degrés. Après la centrifugation, aspirez soigneusement le surnageant sans perturber le culot blanc situé au fond du tube.

Ensuite, dissolvez le culot dans 200 microlitres de la solution appropriée nécessaire aux expériences précédentes. Dans ce cas, nous dissolvons le culot dans du tampon de descente pour une expérience de puces ultérieure. Resuspendez ensuite le culot par aspiration et expulsion répétées à l’aide d’une pipette.

À ce stade, vous pouvez transférer les noyaux dans un tube plus petit et le placer dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius. Jusqu'à une utilisation ultérieure, eh bien, je viens de vous montrer comment isoler des noyaux neuronaux à partir de tissu cérébral post-mortem humain. À l'aide de ces noyaux, vous pouvez effectuer plusieurs analyses différentes, telles que la précipitation immunologique de la chromatine.

Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de toujours garder vos échantillons sur de la glace, car les noyaux sont non fixés et peuvent se dégrader à température ambiante. En outre, il est essentiel de manipuler les tissus humains selon les normes de sécurité biologique de niveau deux ou supérieur. Voilà, c'est tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.