Name: Isolement des noyaux neuronaux à partir de tissus post-mortem du cerveau de lhomme (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Apprenez à isoler les noyaux neuronaux à partir de tissus cérébraux post-mortem humains. Cette méthode combine homogénéisation, centrifugation en gradient de densité et tri par cytométrie en flux pour étudier les interactions chromatiniennes et l'expression génique neuronale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Les auteurs apprécient les conseils et l&#39;appui technique fourni par le Dr Richard Konz et personnel de l&#39;établissement de base de cytométrie en flux à l&#39;Université du Massachusetts Medical School. Les ressources de base soutenu par le diabète de recherche en endocrinologie Centre DK032520 Grant ont également été utilisés. Ce travail est soutenu par des subventions de l&#39;Institut national de santé mentale (NIMH), le National Institute of Drug Abuse (NIDA) et l&#39;Institut national de la santé infantile et du développement humain.

Extraction des noyaux <ol><li> Mettez 250 mg de tissus post-mortem du cerveau congelé dans 5 mL 1 Lysis Buffer dans un douncer et le placer sur la glace. Pour recevoir environ 5 millions de noyaux après la FACS tri, nous utilisons habituellement 1000 mg de tissu par exemple. </li><li> Une fois le tissu a été décongelé, le tissu Dounce pendant 1 minute tout sur la glace. </li><li> Prenez le tissu homogénéisé et le placer dans un tube de 15 ml ultracentrifugeuse clair. Placer le tube sur la glace. </li><li> Prenez 9 ml de 2 Solution Sucrée avec une pipette, mettre la pipette au fond du tube d&#39;ultracentrifugation clair, et la libération de la Solution 2 Saccharose de créer un gradient de concentration avec la solution de tissu homogénéisé sur le dessus de la Solution 2 saccharose. </li><li> Peser les tubes d&#39;ultracentrifugation pour s&#39;assurer qu&#39;ils seront tous équilibrée tout en tournant dans le ultracentrifugation. Faites les ajustements à la masse en ajoutant 1 tampon de lyse de la couche supérieure. </li><li> Après les tubes ont été pesés, les placer dans des seaux du rotor. </li><li> Placez tous les godets dans un rotor SW28 et placer soigneusement le rotor dans le ultracentrifugation. </li><li> Ultracentrifuger les échantillons à 107163,6 RCF pendant 2,5 heures à 4 ° C. </li><li> Une fois la centrifugation est terminée, retirez le surnageant, le long de la couche de débris trouvés au gradient de concentration, avec l&#39;utilisation d&#39;un vide, tout en faisant attention à ne pas perturber le culot contenant les noyaux au fond du tube. </li><li> Ajouter 500 ul de PBS 1X à chaque pastille et laisser reposer sur la glace pendant 20 minutes. Cela permet à la pastille à dissoudre un peu sur ses propres, ce qui rend plus facile à plus tard, mécaniquement dissoudre par aspiration et refoulement, ce qui diminue la quantité de stress de l&#39;expérience des noyaux. </li><li> Après les noyaux ont incubé sur la glace pendant 20 minutes, mécaniquement pipette haut et en bas afin de dissoudre complètement les noyaux au sein 1XPBS. </li><li> Retirer la solution noyaux contenant des tubes d&#39;ultracentrifugation et de combiner le contenu de deux tubes en un seul tube de 2 ml microtubes. Encore une fois, placer les échantillons sur la glace. </li></ol> Immunocoloration pour FACS <ol><li> À ce stade, faire un mélange composé immunomarquage de l&#39;anticorps primaire et secondaire, et le blocage Mix. Pour chaque échantillon, mélanger 300 pi de 1XPBS contenant 1,2 uL d&#39;anticorps NeuN, 100 ul de Mix de blocage, qui contient 0,5% de BSA et 10% sérum de chèvre normal dans 1XPBS, et 1 ul de Alexa Fluor 488. Pour les échantillons de contrôle, d&#39;exclure l&#39;NeuN anticorps primaire et, au contraire, il suffit d&#39;ajouter 1XPBS. </li><li> Vortex le mélange immunomarquage et incuber pendant 5 minutes à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Pendant que le mélange de coloration est en incubation, rendre les contrôles pour les échantillons. Pour FACS de tri, un échantillon contenant des noyaux seul, appelé le «contrôle sans tache» est nécessaire, un deuxième échantillon, un contrôle négatif, contenant des noyaux avec l&#39;anticorps secondaire Alexa Fluor 488 sans NeuN anticorps primaire est également nécessaire. </li><li> Aliquote de 20 uL des noyaux contenant une solution dans un tube à centrifuger 2 ml contenant 1XPBS pour le contrôle sans tache, et un autre 20 uL dans un autre tube de 2 ml contenant 980 ul de 1XPBS pour le contrôle négatif. Augmentez le volume de l&#39;échantillon contenant des noyaux de retour jusqu&#39;à 1 mL avec 1XPBS. Tous les échantillons sont placés dos à la glace. </li><li> Maintenant que le mélange immunomarquage a terminé l&#39;incubation, ajouter son contenu de 401 uL dans les échantillons appropriés. L&#39;échantillon noyaux recevront le mélange contenant les deux NeuN et Alexa Fluor 488, tandis que l&#39;échantillon négatif recevront le mélange ne contenant l&#39;anticorps secondaire Alexa Fluor 488. </li><li> Prélever les échantillons dans la chambre froide pour tourner dans l&#39;obscurité pendant 45 minutes. </li><li> Après les échantillons ont incubé dans l&#39;obscurité pendant 45 minutes, les mettre sur la glace et les amener à l&#39;installation de FACS. Pendant le transport à l&#39;installation de FACS, les échantillons doivent être conservés sur la glace et dans l&#39;obscurité. </li></ol> FACS <ol><li> À l&#39;installation FACS, filtrer les échantillons à travers un filtre 40 um. Ensuite, les faire fonctionner grâce à l&#39;instrument pendant quelques minutes, tout en étant conservés au froid, afin d&#39;obtenir certaines données préliminaires avant le tri. </li><li> À ce stade, il est nécessaire de mettre les portes appropriées requises pour le tri. Plusieurs portes sont utilisés pour des échantillons de tri. La première porte donne une idée de la taille des différents noyaux trouvés dans l&#39;échantillon, et permet separatation des débris de noyaux réels. La deuxième porte nous permet de trier les noyaux individuellement. Jeter tout agrégats sont rejetées à ce stade. Enfin, la troisième porte est fixé à une longueur d&#39;onde spécifique de fluorescence, correspondant à celle du fluorochrome trouve dans nos anticorps secondaire. Placer cette porte nous permet de trier et de + NeuN séparées, donc les noyaux des neurones à partir NeuN - noyaux. </li><li> Après toutes les portes sont choisis, les noyaux peuvent être classés en 1XPBS. </li><li> Une fois leensemble de l&#39;échantillon a traversé, vérifier la pureté de la sorte en exécutant une aliquote de l&#39;échantillon trié à travers l&#39;instrument. Assurez-vous que la fluorescence de l&#39;échantillon n&#39;est pas étalé, mais plutôt est contenue dans un seul quadrant. Il est préférable de choisir des échantillons qui sont plus de 90% pur. </li></ol> Après FACS <ol><li> Une fois l&#39;échantillon a été trié, le traitement des noyaux peut commencer. Prélever 10 ml de l&#39;échantillon trié et y ajouter 2 mL de 2 Solution Sucrée, 50 ul de CaCl 2 1M et 30 ul de 1m Mg (Ace) 2. Pour rappel, toujours être sûr de garder l&#39;échantillon sur la glace depuis les noyaux sont non fixées. </li><li> S&#39;il ya moins de 10 mL d&#39;échantillon trié, augmenter le volume jusqu&#39;à 10 ml en ajoutant 1XPBS, ou ajuster le matériel supplémentaire en conséquence. </li><li> Inverser l&#39;échantillon plusieurs fois et placer sur la glace pendant 15 minutes. </li><li> Après les échantillons ont incubé sur la glace pendant 15 minutes, les centrifugeuses dans un rotor à godets balancer à 1786 RCF pendant 15 minutes à 4 ° C. </li><li> Jeter le surnageant à l&#39;utilisation d&#39;un vide, sans perturber le culot blanc trouvé au fond du tube. </li><li> Dissoudre le culot dans 200 pi de toute solution dont vous avez besoin pour les expériences de procédure, et la pipette de haut en bas. </li><li> Transférer la solution dans un petit tube et le placer dans le congélateur à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li></ol>

<ol><li>Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+the+human+cerebral+cortex+is+dynamically+regulated+throughout+the+life+span+and+involves+differentiated+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons.</a> PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).</li>
<li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li>
<li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li>
<li>Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+ChIP-chip+analysis+using+10%2C000+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells.</a> Biotechniques. 43, 791-797 (2007).</li>
</ol>

Le protocole présenté ici devrait être particulièrement utile pour les études ont porté sur les modifications épigénétiques de la chromatine neuronale et, plus généralement, sur le phénotype moléculaire du noyau des neurones, au cours normal de la maladie neurologique ou psychiatrique en développement et le vieillissement, ou dans. La méthode est particulièrement avantageuse lorsque l&#39;hétérogénéité cellulaire des tissus du cerveau, y compris d&#39;éventuelles modifications dans le neurone-glie à la ration au cours du vieillissement ou à...

Réactifs: <table><tr><th colspan="3" align="left"> 1. Lysis Buffer </th></tr><tr><td> 0,32 M </td><td> Saccharose </td><td> 5,47 g </td></tr><tr><td> 5 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 250 pi </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (acétate) 2 </td><td> 150 ul </td></tr><tr><td> 0,1 mM </td><td> EDTA </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> 10mM </td><td> Tris-HCl, pH8 </td><td> 500 pi </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> TNT </td><td> 17 ul </td></tr><tr><td> 0,1% </td><td> Triton X-100 </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Réglez le volume à 50 ml avec de l&#39;eau à l&#39;autoclave </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 2. Solution Sucrée </th></tr><tr><td> 1,8 M </td><td> Saccharose </td><td> 30,78 g </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (acétate) 2 </td><td> 150 ul </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> TNT </td><td> 17 ul </td></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris-HCl, pH8 </td><td> 500 pi </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Réglez le volume à 50 ml avec de l&#39;eau à l&#39;autoclave </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 3. Dounce tampon </th></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris </td><td> 0,242 g </td></tr><tr><td> 4 mM </td><td> MgCl 2 </td><td> 0,163 g </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 0,03 g </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Ajuster le pH à 7,5 et le volume à 200 ml avec de l&#39;eau à l&#39;autoclave </td></tr></table>

isolement des noyaux neuronaux à partir de tissus post-mortem du cerveau de l&#39;homme

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Les neurones dans le cerveau humain devient postmitotiques largement au cours du développement prénatal, et donc de maintenir leurs noyaux à travers la pleine durée de vie. Cependant, on sait peu de changements dans la chromatine neuronale et l&#39;organisation nucléaire au cours du développement et de vieillissement, ou dans la maladie neuropsychiatrique chronique. Toutefois, à ce jour la plupart des dosages d&#39;ADN de la chromatine et basée (autres que les poissons) la résolution de cellules manquent unique. À cette fin, l&#39;hétérogénéité cellulaire du tissu cérébral constitue une limitation importante, parce que les sous-populations différentes de neurones normalement sont mêlés à différents types de cellules gliales et les autres cellules non-neuronales. Une solution possible serait de développer un type de cellule cultures spécifiques, mais la plupart des cellules du SNC, y compris les neurones, sont ex vivo durable, au mieux, pour seulement quelques semaines et ne serait donc fournir un modèle incomplet pour des mécanismes épigénétiques pourraient exploitation à travers la pleine durée de vie . Ici, nous fournissons un protocole pour extraire et purifier les noyaux de surgelés (jamais fixe) du cerveau post-mortem humain. La méthode consiste à l&#39;extraction de noyaux dans un tampon de lyse hypotonique, suivie par ultracentrifugation et immunotagging avec des anti-NeuN anticorps. Étiqueté noyaux des neurones sont ensuite collectés séparément en utilisant la fluorescence-activated tri. Cette méthode devrait être applicable à n&#39;importe quelle région du cerveau dans une large gamme d&#39;espèces et propice aux études d&#39;immunoprécipitation de chromatine avec des sites et la modification spécifique des anticorps anti-histones et la méthylation de l&#39;ADN et autres tests.

L&#39;hétérogénéité cellulaire du tissu cérébral constitue une limitation importante pour l&#39;étude des marqueurs épigénétiques de la chromatine, car la plupart des essais n&#39;ont pas la résolution seule cellule. Les neurones sont généralement mêlés à des cellules gliales et les autres cellules non-neuronales. Nous fournissons un protocole pour extraire et collecter des noyaux des neurones du cerveau humain.

Isolement des noyaux neuronaux à partir de tissus post-mortem du cerveau de l&#39;homme

Les neurones du cerveau humain deviennent largement postmitotiques pendant le développement prénatal, et conservent ainsi leurs noyaux tout au long de la vie. Cependant, ...

Afin d'étudier les interactions entre l'ADN chromatinien qui régulent l'expression génique spécifique aux neurones dans le cerveau humain, une population purifiée de noyaux neuronaux doit d'abord être obtenue. Le tissu cérébral humain post-mortem est homogénéisé et l'ensemble des noyaux est isolé par centrifugation en gradient de densité. Ensuite, les noyaux sont marqués par des anticorps spécifiques aux neurones, puis isolés par tri cytométrique en flux et, enfin, concentrés par ultracentrifugation.Bonjour, je suis Anish Matan du laboratoire de la Dre Sharon mc Barian, au sein du département de psychiatrie de l'École de médecine de l'Université du Massachusetts. Aujourd'hui, je vais vous montrer une procédure d'isolement de noyaux neuronaux à partir de tissu cérébral humain post-mortem. Commençons sans plus tarder.Pour chaque échantillon de noyaux à trier, commencez avec mille milligrammes de tissu cérébral post-mortem congelé. Avec cette quantité, vous pouvez obtenir environ 5 millions de noyaux neuronaux après tri activé par fluorescence. Pour commencer l'extraction des noyaux, placez 250 milligrammes de tissu cérébral dans un homogénéisateur Dounce contenant cinq millilitres de

neuronal-nuclei-isolation-from-human-postmortem-brain-tissue

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Nous décrivons un processus utilisant le laser capture microdissection d'isoler et d'extraire l'ARN à partir d'une population cellulaire homogène, les neurones pyramidaux, dans la couche III du gyrus temporal supérieur dans les cerveaux post-mortem humain. Nous avons ensuite linéairement amplifier (T7-based) ARNm, et s'hybrident l'échantillon à la puce Affymetrix humaines X3P.

Obtention d&#39;ARN de haute qualité provenant des populations cellule unique de tissus post-mortem du cerveau de l&#39;homme

Noyaux cardiaque sont isolés par sédimentation de densité et immunomarquées avec des anticorps contre matériel péricentriolaire 1 (PCM-1) d'identifier et de trier les noyaux des cardiomyocytes par cytométrie de flux.

Isolement des noyaux de cardiomyocytes post-mortem des tissus

Cette vidéo décrit le protocole permettant d’isoler des noyaux uniques à partir de tissus de gliome fraîchement congelés. Les noyaux uniques isolés peuvent être utilisés comme échantillons pour des techniques de séquençage telles que le séquençage de l’ARN à noyaux uniques (snRNA) et le dosage des noyaux uniques pour le séquençage de la chromatine accessible à la transposase (snATAC) afin d’obtenir des informations plus approfondies sur l’hétérogénéité inter- et intra-tumorale observée dans le...

Isolement de noyaux à partir de tissus de gliome frais congelés : une méthode pour obtenir des noyaux intacts à partir d’échantillons de tumeurs de gliome

La vidéo montre une méthode pour isoler des noyaux intacts à partir de cellules gliales et souches dans le gyrus denté de l’hippocampe de souris. Le tissu DG est dissocié mécaniquement dans un tampon d’homogénéisation à froid pour libérer les noyaux. Les débris tissulaires et autres organites libérés sont jetés, et les noyaux sont colorés avec une coloration à l’ADN et un anticorps conjugué à un fluorophore spécifique de l’antigène nucléaire neuronal (NeuN). Le tri des noyaux activés par...

Une technique pour isoler des noyaux de cellules non neuronales dans le gyrus denté de l’hippocampe

Cette vidéo montre la procédure d’isolement et de tri des noyaux de tissus cérébraux humains fraîchement congelés à l’aide du tri des noyaux activés par fluorescence (FANS), ce qui permet d’étudier différentes populations cellulaires pour diverses applications neurologiques.

Isolement de populations cellulaires à partir de tissus cérébraux à l’aide du tri des noyaux activés par fluorescence

L’hétérogénéité intratumorale est une caractéristique inhérente aux tumeurs, y compris les gliomes. Nous avons développé un protocole simple et efficace qui utilise une combinaison de tampons et de centrifugation par gradient pour isoler des noyaux uniques à partir de tissus de gliome frais congelés pour des études de séquençage de l’ARN à noyau unique et de l’ATAC.

Isolement des noyaux à partir de tumeurs cérébrales fraîchement congelées pour l’ARN-seq à noyau unique et ATAC-seq

Nous avons développé une méthode qui enrichit et isole les populations d’astrocytes humains à partir de tissus fraîchement congelés pour une utilisation dans les analyses moléculaires en aval.

Isolement de populations d’astrocytes humains adultes à partir de cortex fraîchement congelés à l’aide du tri des noyaux activés par fluorescence

Présenté ici est une méthode pour séquencer des noyaux uniques isolés du gyrus denté de la souris qui exclut la plupart des neurones par tri des noyaux activés par fluorescence (FAN). Cette approche génère des profils d’expression de haute qualité et facilite l’étude de la plupart des autres types de cellules représentées dans la niche, y compris les populations rares telles que les cellules souches neurales.

Tri négatif des neurones par noyaux activés par fluorescence combiné au séquençage de l’ARN à noyau unique pour étudier la niche neurogène de l’hippocampe

L’étude décrit un protocole simple, rapide et partiellement automatisé pour isoler des noyaux de haute qualité à partir de tissus de mammifères congelés pour le séquençage de l’ARN de noyaux uniques en aval.

Un protocole simple, rapide et partiellement automatisé pour l’isolement de noyaux uniques à partir de tissus de mammifères congelés pour le séquençage d’un seul noyau

Le succès de la transcriptomique unicellulaire/mononoyau et de la multi-omique dépend en grande partie de la qualité des cellules/noyaux. Par conséquent, l’isolement des cellules/noyaux des tissus et leur purification doivent être hautement standardisés. Ce protocole décrit la préparation des noyaux du cerveau et de la moelle osseuse pour l’essai multiome à noyau unique en aval.

Préparation de noyaux de cerveau et de moelle osseuse de haute qualité pour les dosages multiomes à noyau unique

Apprenez à isoler les noyaux neuronaux à partir de tissus cérébraux post-mortem humains. Cette méthode combine homogénéisation, centrifugation en gradient de densité et tri par cytométrie en flux pour étudier les interactions chromatiniennes et l'expression génique neuronale.

Isolement des noyaux neuronaux à partir de tissus post-mortem du cerveau de l'homme

Explorer plus de vidéos