Un test pour mesurer la réactivité comportementale du poisson-zèbre à l'évolution des intensités de lumière

Dans le laboratoire de Dowling, nous étudions la physiologie et le développement de la rétine chez le poisson zèbre afin de déterminer si les mutants du poisson zèbre qui sont incapables de détecter le mouvement peuvent détecter la lumière et ne sont pas aveugles. Pour ce faire, nous testons leur réponse motrice visuelle ou VMR. Nous recueillons des poissons zèbres environ quatre jours après la fécondation.

Placez-les dans 96. Les plaques préparent un système d’imagerie approprié, alignent le logiciel de suivi vidéo avec la plaque, puis suivent la réponse motrice du poisson après les transitions de la lumière à l’obscurité ou de l’obscurité à la lumière, c’est ce que nous appelons le VMR. Bonjour, je m’appelle Farida Imran et je travaille au laboratoire de John Dowling et au Département de biologie moléculaire et cellulaire de l’Université Harvard.

Et je suis Jason Rio. Je travaille dans le laboratoire d’Alexander Shear, également au département de biologie moléculaire et cellulaire de l’Université Harvard. Aujourd’hui, nous allons vous montrer la réponse motrice visuelle chez le poisson-zèbre aux augmentations et aux diminutions de la lumière.

Alors commençons. Pour commencer l’essai de réponse motrice visuelle, cultivez d’abord des larves de poisson-zèbre de type sauvage sous un cycle de lumière sombre à 28 degrés Celsius jusqu’à au moins quatre jours après la fécondation. Notre cycle typique de lumière et d’obscurité est de 14 heures de lumières allumées à partir de 9h00 et de 10 heures de lumières éteintes à partir de 23h00 pour les meilleurs résultats comportementaux.

Évitez de surpeupler les larves. Nous ne gardons généralement pas plus de 50 larves dans une seule boîte de Pétri. Après cinq jours après la fécondation, nous transférons le poisson zèbre dans une plaque de 96 puits avec une taille de puits de 650 microlitres afin de donner aux larves une grande salle de nage.

À l’aide d’une pipette de transfert en plastique, transférez doucement une larve par puits. Après avoir transféré les poissons dans les puits, remplissez chaque puits avec suffisamment d’eau pour poissons de sorte que la surface de l’eau soit presque évacuée vers le haut des puits. Attention à ne pas trop remplir ou sous-remplir les puits pour éviter des problèmes optiques pour la caméra d’enregistrement.

Veillez également à ne pas introduire de bulles dans les puits. Les poissons sont maintenant prêts à être surveillés pour leurs réponses locomotrices à la lumière et à l’obscurité. Passons le poisson-zèbre plaqué à l’appareil d’enregistrement.

Passons donc en revue l’appareil d’enregistrement. La plaque de 96 puits contenant des poissons sera placée à l’intérieur de la chambre d’enregistrement ici dans ce plateau blanc et maintenue en place avec un ressort ou un élastique. La caméra est positionnée à l’arrière de la boîte ici et est focalisée sur la plaque à l’aide de miroirs sur le dessus de la boîte située ici.

L’angle de ces miroirs peut être ajusté en tournant les vis qui maintiennent les miroirs en place. La chambre d’enregistrement est éclairée par le bas par des LED infrarouges. Cela permet à la caméra d’enregistrer le poisson même dans l’obscurité.

Les larves ne peuvent pas détecter la lumière IR, de sorte que cet éclairage IR constant n’affecte pas l’expérience. Des LED blanches éclairent également la chambre d’enregistrement par le bas. Ils sont contrôlés séparément des lumières IR pour des expériences qui durent plus de quelques heures.

La chambre peut être remplie d’eau courante pour aider à maintenir une température constante pendant la durée de l’expérience. L’eau est pompée d’un réservoir par une petite pompe d’aquarium et est chauffée à 28 degrés avec un chauffage d’aquarium sous-marin typique. L’eau s’écoule par un grand trou de drainage et est recirculée dans le réservoir pour minimiser les vibrations parasites de la pièce.

L’ensemble de l’unité d’enregistrement repose sur une lourde table d’équilibre. Lorsque l’appareil d’enregistrement est prêt, un couvercle de boîte est utilisé pour couvrir les animaux et les isoler davantage de la lumière. Passons maintenant à l’alignement du 96.

Plaque de puits avec la grille informatique du logiciel de suivi vidéo pour faire cette première place, la plaque de 96 puits contenant le poisson dans la chambre d’enregistrement. Lorsque vous utilisez un bain-marie pour des expériences à long terme, placez lentement la plaque dans l’eau, en donnant au niveau de l’eau une chance de s’ajuster sans se renverser sur la plaque. Dans le logiciel de suivi vidéo du point de vue, assurez-vous que toutes les larves et l’expérience sont visibles sur l’écran de l’ordinateur.

À l’aide des commandes du logiciel, alignez la grille du logiciel de suivi vidéo avec les puits de la plaque de 96 puits de sorte que chaque poisson se trouve dans un carré de la grille. Cette étape est très importante pour tous vos enregistrements. L’ordinateur de suivi calculera le mouvement séparément pour chacune de ces boîtes.

Donc, si vous désalignez la grille informatique, certains mouvements des poissons peuvent être perdus ou même pire. Deux poissons adjacents occuperont la même zone et seront comptés comme un seul poisson après l’alignement. Le moment où les lumières s’allument et s’éteignent est programmé dans l’ordinateur.

Nous permettons généralement trois heures d’adaptation à l’obscurité plus claire dans la boîte. Cela permet non seulement d’obtenir un niveau d’activité de base, mais aussi de donner aux larves la possibilité de se calmer après le pipetage et la manipulation. Ensuite, nous fermons la porte de notre chambre d’enregistrement et commençons à enregistrer.

En pratique, nous enregistrons l’activité de chaque poisson par seconde, mais le logiciel de point de vue enregistre en fait les données image par image. Ici, sous l’écran, vous pouvez voir une trace en temps réel d’un seul poisson. En termes de mouvement des pixels, la ligne blanche indique que le nombre de modifications de pixels est inférieur à un seuil défini et la verte indique que la modification des pixels est supérieure au paramètre de seuil.

La valeur seuil dépendra quelque peu de votre appareil photo et de la configuration de l’éclairage. Pour notre configuration, nous utilisons généralement un seuil de quatre pixels. C’est-à-dire que si moins de quatre pixels changent, il est considéré comme un arrière-plan.

Si plus de quatre pixels se déplacent, cela indique que le poisson se déplace. Nous avons déterminé empiriquement que cette coupure détecte presque tous les mouvements de nage et de virage des larves. Même si les boîtiers d’enregistrement isolent assez bien les larves, nous éteignons toujours la lumière dans la pièce et veillons à minimiser les interruptions causées par le bruit mécanique, comme la fermeture et l’ouverture des portes de la pièce, la tenue d’une soirée dansante ou la pratique de nos routines d’exercice.

Une fois l’expérience terminée, transférez les données collectées dans une feuille Excel ou dans votre suite d’analyse préférée. Voici à quoi ressemblent les données. Il contient le temps et les secondes depuis le début de l’expérience et l’activité de chaque larve par seconde.

Voici un graphique montrant l’activité d’une seule larve pendant toute la durée de l’expérience, avec plusieurs réponses activées et désactivées indiquées par les flèches sur le graphique. Ce graphique montre l’activité moyenne de 40 poissons pendant toute la durée de l’expérience, avec plusieurs réponses activées et désactivées, comme l’indiquent les flèches. Comme vous pouvez le voir, les réponses activées et désactivées sont proéminentes et cohérentes.

Cette expérience de réponse motrice visuelle peut également être réalisée sur des poissons mutants. Pour ces études, nous plaçons généralement des poissons de type sauvage et des poissons mutants sur la même plaque dans un contour en damier à des fins de contrôle optimal. Lorsque vous utilisez des poissons mutants sur la même assiette que des poissons sauvages, assurez-vous de noter quel type de poisson a été plaqué dans chacun. Puits.

Voici une suggestion sur la façon de garder une trace du poisson plaqué dans chacun. Puits. Voici les résultats de la réponse motrice visuelle, qui comparent les larves de type sauvage et mutantes. Encore une fois, nous voyons les réponses intermittentes et constantes des larves de type sauvage.

Cependant, les larves mutantes de craie, qui n’ont pas de développement oculaire, n’augmentent pas significativement leur activité jusqu’à de légères augmentations ou diminutions et ont un faible niveau d’activité de base. Ces résultats comparent les réponses de type sauvage avec les mutants NO OKR, également appelés mutants NRC. On pensait que le mutant du NRC était complètement aveugle sur la base du test OKR.

À l’aide du test VMR, nous démontrons que le mutant NRC a une réponse normale et une réponse retardée et lente. Ainsi, le mutant du NRC n’est pas complètement aveugle comme on le pensait auparavant. Nous venons de vous montrer la réponse motrice visuelle du labate de poisson-zèbre aux augmentations et aux diminutions de la lumière.

Lors de cette procédure. Il est important de ne pas oublier de faire l’expérience pendant la journée, car les poissons sont plus actifs et réceptifs aux changements d’intensité lumineuse pendant la journée que pendant la nuit. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.