Un test pour mesurer la réactivité comportementale du poisson-zèbre à l'évolution des intensités de lumière

Dans le laboratoire Dowling, nous étudions la physiologie et le développement de la rétine chez le poisson zèbre afin de déterminer si les mutants de poisson zèbre incapables de détecter le mouvement peuvent néanmoins percevoir la lumière et ne pas être aveugles. Pour cela, nous évaluons leur réponse motrice visuelle, ou RMV. Nous recueillons des poissons zèbres environ quatre jours après la fécondation.

Les placer dans des plaques de 96 puits, préparer un dispositif d'imagerie approprié, aligner le logiciel de suivi vidéo avec la plaque, puis suivre la réponse motrice des poissons après des transitions de la lumière à l'obscurité ou de l'obscurité à la lumière, ce que nous appelons la RMV. Bonjour, je suis Farida Imran du laboratoire de John Dowling et du Département de biologie moléculaire et cellulaire de l'Université Harvard.

Et je suis Jason Rio. Je viens du laboratoire d'Alexander Shear, également situé au sein du département de biologie moléculaire et cellulaire de l'Université Harvard. Aujourd'hui, nous allons vous montrer la réponse motrice visuelle du poisson zèbre aux augmentations et diminutions de lumière.

Commençons. Pour initier le test de réponse motrice visuelle, faites d'abord développer des larves de zebrafish de type sauvage dans un cycle lumineux sombre à 28 degrés Celsius jusqu'à au moins quatre jours après la fécondation. Notre cycle lumineux typique comprend 14 heures de lumière allumée à partir de 9h00 et 10 heures de lumière éteinte à partir de 23h00, ce qui donne les meilleurs résultats comportementaux.

Évitez d'entasser les larves. Nous conservons habituellement au maximum 50 larves dans une seule boîte de Pétri. Cinq jours après la fécondation, nous transférons les poissons zèbres dans une plaque de 96 puits d'une taille de 650 microlitres par puits afin de fournir aux larves un espace de nage plus grand.

À l’aide d’une pipette plastique de transfert, transférez délicatement une larve par puits. Après avoir transféré les poissons dans les puits, remplissez chaque puits avec suffisamment d’eau pour poissons afin que la surface de l’eau soit presque au niveau supérieur des puits. Veillez à ne pas trop remplir ni sous-remplir les puits afin d’éviter des problèmes optiques pour la caméra d’enregistrement.

Veiller également à ne pas introduire de bulles dans les puits. Les poissons sont désormais prêts à être surveillés pour leurs réponses locomotrices à la lumière et à l'obscurité. Transportons les zebrafish en plaque vers l'appareil d'enregistrement.

Procédons donc à l'inspection de l'appareil d'enregistrement. La plaque de 96 puits contenant les poissons sera placée à l'intérieur de la chambre d'enregistrement, dans ce bac blanc, et maintenue en place à l'aide d'un ressort ou d'un élastique. La caméra est positionnée à l'arrière de la boîte ici et est focalisée sur la plaque à l'aide de miroirs situés en haut de la boîte, à cet endroit.

L'angle de ces miroirs peut être ajusté en tournant les vis qui maintiennent les miroirs en place. La chambre d'enregistrement est éclairée par le bas par des LED infrarouges. Cela permet à la caméra d'enregistrer les poissons même dans l'obscurité.

Les larves ne peuvent pas détecter la lumière infrarouge, donc cette illumination infrarouge constante n'affecte pas l'expérience. Des DEL blanches illuminent également la chambre d'enregistrement par en dessous. Elles sont contrôlées séparément des lumières infrarouges pour les expériences qui durent plus de quelques heures.

La chambre peut être remplie d'eau en circulation douce afin de maintenir une température constante pendant la durée de l'expérience. L'eau est pompée à partir d'un réservoir par une petite pompe pour aquarium et chauffée à 28 degrés à l'aide d'un chauffage sous-marin typique pour aquarium. L'eau s'écoule par un grand trou de drainage et est recirculée vers le réservoir afin de minimiser les vibrations parasites provenant de la pièce.

L'ensemble de l'appareil d'enregistrement est placé sur une table d'équilibrage lourde. Lorsque le dispositif d'enregistrement est prêt, un couvercle de boîte est utilisé pour couvrir les animaux et les isoler davantage de la lumière. Passons maintenant à l'alignement du 96.

Plaque de microtitration munie de la grille informatique du logiciel de suivi vidéo pour effectuer cette première étape : placer la plaque de 96 puits contenant les poissons dans la chambre d'enregistrement. Lorsque vous utilisez un bain-marie pour des expériences à long terme, insérez lentement la plaque dans l'eau afin de permettre au niveau d'eau de s'ajuster sans déborder sur la plaque. Dans le logiciel de suivi vidéo, vérifiez que tous les larves et l'expérience entière sont bien visibles à l'écran de l'ordinateur.

À l’aide des commandes du logiciel, alignez la grille du logiciel de suivi vidéo avec les puits de la plaque 96 puits de manière que chaque poisson se trouve dans un carré de la grille. Cette étape est très importante pour tous vos enregistrements. L’ordinateur de suivi calculera les mouvements séparément pour chacun de ces carrés.

Ainsi, si vous décalez la grille informatique, certains mouvements des poissons peuvent être perdus, voire pire. Deux poissons adjacents occuperont la même zone et seront comptés comme un seul poisson après l'alignement. L'heure à laquelle les lumières s'allumeront et s'éteindront est programmée dans l'ordinateur.

Nous prévoyons généralement trois heures d'adaptation à la pénombre dans la boîte. Cela permet non seulement d'obtenir un niveau d'activité de base, mais donne également aux larves l'occasion de se calmer après le pipetage et la manipulation. Ensuite, nous fermons la porte de notre chambre d'enregistrement et commençons l'enregistrement.

En pratique, nous enregistrons l'activité de chaque poisson par seconde, mais le logiciel de suivi enregistre en réalité les données image par image. Ci-dessous l'écran, vous pouvez voir un tracé en temps réel d'un poisson unique. En termes de déplacement en pixels, la ligne blanche indique que le nombre de changements de pixels est inférieur à un seuil prédéfini, tandis que la ligne verte indique que le changement de pixels est supérieur au seuil défini.

La valeur du seuil dépendra en partie de votre caméra et de votre configuration lumineuse particulière. Pour notre configuration, nous utilisons généralement un seuil de quatre pixels. C’est-à-dire que si moins de quatre pixels changent, cela est considéré comme un fond.

Si plus de quatre pixels sont en mouvement, cela indique que le poisson bouge. Nous avons déterminé empiriquement que ce seuil détecte presque tous les mouvements de nage et de virage des larves. Même si les cadres d'enregistrement isolent assez bien les larves, nous éteignons tout de même la lumière dans la pièce et prenons soin de minimiser les perturbations dues au bruit mécanique, telles que fermer ou ouvrir des portes, faire une fête dansante ou effectuer nos séances d'exercices.

Une fois l'expérience terminée, transférez les données recueillies dans une feuille Excel ou dans votre suite d'analyse préférée. Voici à quoi ressemblent les données. Elles contiennent le temps en secondes depuis le début de l'expérience et l'activité de chaque larve par seconde.

Voici un graphique montrant l'activité d'une larve unique sur toute la durée de l'expérience, avec plusieurs réponses d'activation et de désactivation indiquées par les flèches sur le graphique. Ce graphique présente l'activité moyenne de 40 poissons sur l'ensemble de la durée de l'expérience, avec plusieurs réponses d'activation et de désactivation, comme indiqué par les flèches. Comme vous pouvez le constater, les réponses d'activation et de désactivation sont marquées et cohérentes.

Cette expérience de réponse motrice visuelle peut également être réalisée sur des poissons mutants. Pour ces études, nous plaquons généralement des poissons de type sauvage et des poissons mutants sur la même plaque selon un motif en damier afin d'obtenir un contrôle optimal. Lorsque vous utilisez des poissons mutants sur la même plaque que des poissons de type sauvage, assurez-vous de noter quel type de poisson a été placé dans chaque puits.

Voici une suggestion sur la manière de suivre les poissons placés dans chaque puits. Voici les résultats de la réponse motrice visuelle, qui comparent des larves de type sauvage et des larves mutantes. Là encore, nous observons des réponses marquées et cohérentes d'activation et de désactivation provenant des larves de type sauvage.

Cependant, les larves mutantes chalk, qui présentent un défaut de développement des yeux, n'augmentent pas significativement leur activité en réponse ni à l'augmentation ni à la diminution de la lumière et affichent un niveau de base d'activité faible. Ces résultats comparent les réponses de type sauvage à celles des mutants NO OKR, également appelés mutants NRC. Le mutant NRC était considéré comme totalement aveugle sur la base du test OKR.

À l'aide du test de réponse visuo-motrice, nous démontrons que le mutant NRC présente une réponse éteinte normale et une réponse allumée retardée et lente. Ainsi, le mutant NRC n'est pas complètement aveugle, contrairement à ce qui avait été précédemment supposé. Nous venons de vous montrer la réponse motrice visuelle du poisson zèbre labate aux augmentations et diminutions de lumière.

Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de se rappeler de réaliser l'expérience pendant la journée, car les poissons sont plus actifs et plus réactifs aux variations d'intensité lumineuse pendant la journée par rapport à la nuit. Voilà tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.