Immunoprécipitation ADN méthylé

Cette vidéo présente un protocole d’immunoprécipitation de l’ADN méthylé ou meetup. Méthode utilisée pour isoler spécifiquement l’ADN méthylé de manière impartiale. La méthylation de l’ADN chez les mammifères est caractérisée par l’ajout d’un groupe méthyle à la position C cinq de la cytosine.

Lorsqu’il est présent dans un dinucléotide CPG, il s’agit d’une marque épigénétique réversible qui joue un rôle important dans le développement normal, ainsi que dans plusieurs processus pathologiques. Les fonctions normales de la méthylation de l’ADN comprennent l’inactivation du chromosome X chez les femelles, le silençage répétitif des éléments, l’empreinte génomique et le maintien de la stabilité génomique. Il a également été démontré que la méthylation de l’ADN joue un rôle dans de nombreuses maladies telles que le cancer, le syndrome de Willi, le syndrome d’Engelman et l’immunodéficience, l’instabilité centrale et le syndrome d’anomalie faciale.

Dans les cancers, par exemple, une hyperméthylation anormale et des promoteurs peuvent entraîner le silençage des gènes suppresseurs de tumeurs vitaux. Alors qu’une hypométhylation incorrecte entraîne une instabilité chromosomique et que l’activation de l’oncogène se rencontre, la rencontre est accomplie en faisant d’abord glisser l’ADN en fragments dont la taille varie de 300 à 1000 paires de bases. L’ADN soniqué est ensuite dénaturé à 95 degrés Celsius.

Des anticorps primaires, qui reconnaissent cinq méthazine primaires, sont ajoutés et autorisés à se lier à des fragments d’ADN méthylés. Les anticorps secondaires, conjugués à des billes de dyne magnétiques, sont utilisés pour isoler des fragments d’ADN, qui ont été liés par l’anticorps primaire. Les fragments non méthylés sont éliminés et les anticorps sont digérés par la protéinase.

Le nettoyage du phénylchloroforme KA élimine la protéine digérée et la précipitation purifie l’ADN, qui est maintenant enrichi en fragments méthylés. Meetup, l’ADN peut être utilisé pour des applications telles que la PCR, les microréseaux et le séquençage. Le Meetup est généralement effectué sur deux jours.

Le premier jour implique la préparation de l’ADN, la sonication, l’immunoprécipitation et la digestion des protéines. Le deuxième jour comprend l’extraction du pH au chloroforme et la précipitation de l’éthanol pour purifier et isoler l’ADN enrichi pour la méthylation. Quelques matériaux spéciaux sont nécessaires pour la rencontre, notamment des tubes à centrifuger siliconés, un dispositif de sunation d’ADN, un anticorps primaire, une souris anti-méthazine à cinq primes, un anticorps monoclonal, un anticorps secondaire, des perles de dyna, conjuguées à des moutons, des IgG anti-US et un support de tube magnétique.

La première étape du protocole de rencontre est la préparation de l’ADN. Il est impératif d’évaluer au préalable la nature de l’ADN. Il est nécessaire de connaître l’état de l’ADN de l’échantillon, s’il s’agit principalement d’un double brin ou d’un simple brin, car une quantification précise de l’échantillon est de la plus haute importance et diverses méthodes de détermination de la quantité d’ADN peuvent être affectées négativement par la présence d’espèces d’ADN indésirables.

quantité d’ADN double brin peut être facilement évaluée par photométrie spectrale à l’aide d’un NanoDrop 3, 300 nd charge 1,5 microlitre et règle le type de mesure sur acide nucléique, sélectionne l’ADN 50 comme calcul et initialise l’instrument avec 1,5 microlitre d’eau. Nettoyez les socles et blanchissez l’instrument avec 1,5 microlitres de liquide. L’échantillon est dissous dans les socles, charge 1,5 microlitres de l’échantillon et frappe la mesure.

La concentration sera donnée et pourra être utilisée. Pour calculer le nombre de microlitres dont j’ai besoin, un rapport A deux 60 à deux 80 de 1,8 est idéal ici. Un échantillon d’un microgramme est préparé.

Cependant, un échantillon d’aussi peu que 200 nanogrammes est suffisant pour obtenir des résultats positifs. Pour la rencontre, chargez l’échantillon d’ADN dans un tube siliconé propre. Ajoutez suffisamment d’eau stérile pour porter le volume final à 50 microlitres.

La sonication et l’immunoprécipitation de l’ADN doivent être effectuées dans des tubes siliconés pour éviter la liaison non spécifique de l’ADN et des protéines aux parois du tube. Une fois l’ADN préparé, l’échantillon doit être sonique pour fragmenter l’ADN car l’immunoprécipitation est plus efficace avec des fragments d’ADN plus petits, chargez l’échantillon dans le sonique, assurez-vous que le réglage de puissance est réglé sur élevé et que la machine est réglée sur 30 secondes. Après 30 secondes d’arrêt, remplissez la base dans la ligne de remplissage avec de l’eau à quatre degrés Celsius.

Soniquez l’échantillon pendant sept minutes. Lorsque Sonication est terminée, retirez le tube et mettez-le sur de la glace. Il est important d’optimiser au préalable les conditions de sonication pour votre échantillon prévu, la taille de l’ADN.

Par exemple, un échantillon d’ADN partiellement dégradé nécessitera un temps de sonication plus court. Les produits de sonication peuvent être visualisés par des techniques électrophorétiques standard. Des fragments d’ADN d’une taille variant de 300 à 1000 paires de bases sont souhaités à ce stade pour une utilisation ultérieure.

Dans les tests de microréseaux et de PCR, vous devez réserver un cinquième de votre ADN pour servir d’ADN d’entrée ou de référence dans ce cas, 800 nanogrammes d’ADN soniqué seront utilisés pour l’immunoprécipitation et le reste sera mis de côté comme ADN de référence. L’étape suivante dans le protocole du milieu est l’immunoprécipitation ou la réaction IP avant l’ajout de l’anticorps primaire, l’ADN doit être dénaturé. La dénaturation est nécessaire car l’anticorps primaire est sensible à l’ADN simple brin.

Placez l’échantillon dans un bain-marie à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Lorsque l’étape de dénaturation est terminée, transférez immédiatement le tube dans la glace pendant au moins cinq minutes. Cela empêchera l’ADN dénaturé de Reen à genoux et permettra une liaison optimale des anticorps lorsque l’échantillon aura refroidi.

Faites tourner brièvement le tube pour tirer le contenu vers le bas. Ensuite, l’anticorps primaire doit être ajouté. La quantité d’anticorps utilisée doit être titrée pour chaque lot et pour chaque fabricant.

Dans ce cas, nous ajoutons cinq microgrammes d’anticorps primaires, puis nous ajoutons un tampon d’immunoprécipitation ou un tampon IP à un volume final de 500 microlitres. Ensuite, l’ADN IP est placé dans un rotateur et laissé incuber à quatre degrés Celsius pendant deux heures. Une rotation est nécessaire pour éviter la conglomération d’anticorps dans le tube pendant l’incubation.

Environ 15 minutes avant la fin de l’incubation de l’anticorps primaire, nettoyez et préparez les billes de dyna magnétiques. Tout d’abord, remettez soigneusement les billes en suspension dans le flacon par vortex. Transférez ensuite 30 microlitres de billes dans un tube siliconé propre et placez ce tube sur une grille magnétique pour de multiples réactions.

Transférez 30 microlitres de billes par réaction, plus assez pour une réaction supplémentaire afin de permettre une erreur de pipetage ou une perte accidentelle de certaines billes. Par exemple, pour huit réactions. Retirez suffisamment de billes pour neuf réactions ou 270 microlitres.

Les billes magnétiques seront attirées vers la paroi du rack magnétique. Attendez deux minutes pour que les billes migrent et s’installent dans une traînée définie sur la paroi du tube. Ensuite, retirez et jetez soigneusement la pipette surnageante en veillant à ne pas déranger les perles sur la paroi arrière avec la pointe de la pipette.

Remplacez le surnageant par un volume excessif de vortex de tampon IP et remettez-le sur le rack magnétique pendant deux minutes. Répétez ce lavage une fois de plus et remettez les billes de lavage en suspension dans leur volume d’origine de tampon IP. Récupérez le tube d’échantillon du rotateur lorsque l’incubation est terminée.

Pour compléter l’immunoprécipitation, ajoutez 30 microlitres de billes propres à la réaction et replacez le tube dans un rotateur pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Au cours de cette incubation, l’anticorps secondaire, qui est anti-IgG de souris, se liera à l’anticorps primaire de souris. Les anticorps anti souris sont conjugués à des billes de dyna magnétiques, ce qui permet de récupérer facilement les produits liés et l’étape de purification à suivre.

Une fois l’incubation avec les deux anticorps terminée, placez le tube IP sur le support magnétique pendant deux minutes. À ce stade, l’ADN méthylé sera lié par l’anticorps primaire, qui sera lui-même lié par l’anticorps secondaire conjugué à la bille de dyna. Retirez et jetez le surnageant et remplacez-le par 500 microlitres de tampon IP.

Mélangez le contenu du tube et remettez-le sur la grille pendant deux minutes. Répétez ce lavage avec le tampon IP une fois de plus. Après avoir retiré le surnageant du dernier lavage Resus, suspendez les perles pour la dernière fois.

Dans 400 microlitres de tampon de digestion, traitez la réaction avec 100 microgrammes de protéinase K et incubez pendant la nuit à 50 degrés Celsius. Le traitement à la protéinase K est nécessaire pour digérer les protéines d’anticorps et toute protéine résiduelle associée à l’ADN, permettant à l’ADN méthylé d’être libéré en solution. La purification de l’ADN est effectuée le deuxième jour de la procédure de rencontre, récupérez le tube de digestion de l’incubateur.

Dans une hotte, ajoutez 500 microlitres de phénochloroforme individuel à pH sept dans le tube et faites tourner le tube pendant 10 minutes à 13 000. G.Retirez soigneusement la phase aqueuse supérieure du tube sans perturber l’interface ni enlever la couche organique. Transférez la phase aqueuse dans un nouveau tube.

Une seconde extraction peut être effectuée si l’interface apparaît trouble. Ensuite, ajoutez un 10e volume d’acétate de sodium à trois molaires dans ce cas, 40 microlitres. Un microlitre de glycogène peut être utilisé comme support pour faciliter le nettoyage des granulés.

Vortex le tube pour mélanger le contenu. Ajoutez ensuite deux volumes d’éthanol à 100 %, vortex et congelez dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant 20 minutes après la congélation. L’ADN précipité est injecté dans une centrifugeuse à 13 000 g et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.

Une pastille d’ADN se formera au fond du tube. Récupérez le tube de la centrifugeuse et retirez l’éthanol. Attention à ne pas déranger la pastille au fond du tube.

Une rotation pulsée peut être nécessaire pour éliminer tout résidu d’éthanol. Pour laver le granulé, ajoutez 500 microlitres de vortex d’éthanol froid, à 70 %, et tournez à nouveau pendant 20 minutes à 13 000 g et quatre degrés Celsius. Lorsque le deuxième essorage est terminé, retirez l’impulsion à 70 % d’éthanol et retirez l’éthanol résiduel à l’aide d’une pipette.

Laissez le tube sur une grille avec le capuchon ouvert pour sécher la pastille et permettre à l’éthanol restant de s’évaporer. Enfin, Reus met en suspension la pastille contenant uniquement de l’ADN enrichi pour la méthylation et 10 microlitres d’eau stérile, ce qui laisse suffisamment de temps à la pastille d’ADN pour se dissoudre avant utilisation. Il est recommandé de valider la compétence de la rencontre par PCR.

Cela peut être fait en exécutant des réactions PCR conçues pour amplifier des produits qui illustrent différemment des fragments d’ADN méthylés et non méthylés pour des amorces d’ADN humain normales amplifiées. La région de contrôle de l’empreinte H 19 peut être utilisée en conjonction avec des amorces conçues pour amplifier une région du génome qui n’est pas méthylée. Par exemple, les séquences d’amorces et les conditions de cycle de PCR peuvent être trouvées dans le protocole d’accompagnement.

À ce stade, il est nécessaire de récupérer l’entrée ou l’ADN de référence qui a été mis de côté au début du protocole de rencontre. Une série de réactions PCR sera configurée à l’aide de l’ADN d’entrée, et l’autre série utilisera l’ADN IP enrichi pour la méthylation. Si la rencontre a été couronnée de succès, l’IP PCR produira un produit utilisant les amorces de méthylation et aucun produit utilisant les amorces de contrôle.

À l’inverse, la PCR d’entrée doit produire des produits en utilisant les deux amorces, car elles contiennent à la fois des amorces méthylées et non méthylées. fragments d’ADN. L’ADN enrichi en fragments méthylés peut être utilisé pour un certain nombre d’applications en aval, telles que le séquençage PCR et l’analyse de microréseaux.

Lorsqu’il est intégré à d’autres techniques de biologie moléculaire, il peut être utilisé pour étudier l’état de méthylation de l’ADN d’une manière spécifique au locus ou à l’échelle du génome pour le profilage de méthylation ou l’étude de l’épigénomique.