Name: Immunoprécipitation ADN méthylé (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 24 s
Description: Apprenez l'immunoprécipitation de l'ADN méthylé (MeDIP) pour isoler spécifiquement l'ADN méthylé de manière non biaisée. Cette technique épigénétique permet d'étudier le méthylome dans le développement normal et les maladies comme le cancer.

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Nous tenons à remercier les membres de la Brown et laboratoires Lam pour leur participation à la critique de cette vidéo et de l&#39;article. Ce travail a été soutenu par des fonds des Instituts canadiens de recherche en santé et de la Fondation Michael Smith pour la recherche en santé.

EXTRACTION D&#39;ADN et préparation des échantillons L&#39;ADN d&#39;une variété de différents échantillons (cellules en culture, frais congelé ainsi que des tissus de paraffine fixés au formol intégrés) peut être utilisé pour MeDIP. Il est important d&#39;utiliser l&#39;ADN hautement purifié, sans protéines associées telles que les histones. Il est également important de retirer l&#39;ARN autant que possible de l&#39;échantillon, car il peut interférer avec une quantification ADN et liaison à l&#39;anticorps. La quantité d&#39;ADN utilisée pour MeDIP peut varier de 200 ng à 1 pg en fonction de la quantité d&#39;ADN disponibles. Pour démontrer ce protocole, 1 pg d&#39;ADN sera utilisé. Le protocole suivant permettra de haute qualité d&#39;ADN double brin à partir des cellules cultivées. D&#39;autres protocoles devraient être employées pour l&#39;extraction de l&#39;ADN d&#39;autres types d&#39;échantillons. <ol><li> Ajouter 400 ul de tampon de digestion d&#39;un culot cellulaire dans un tube de 1,7 ml Eppendorf. </li><li> Ajouter 100 ug de la protéinase K dans le tube et incuber une nuit à 50 ° C. </li><li> Ajouter 500 ul de phénol pH 7 et mélanger délicatement mais soigneusement en renversant. </li><li> Centrifuger à 13 000 g pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Retirer aqueuse (en haut) fraction dans un nouveau tube. </li><li> Répétez les étapes 3 à 5 fois. </li><li> Ajouter 500 ul 01h01 pH phénol / chloroforme 7 et mélanger délicatement mais soigneusement en renversant. </li><li> Centrifuger à 13 000 g pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Retirer aqueuse (en haut) fraction dans un nouveau tube. </li><li> Ajouter 40 ug de RNase A et incuber 1 h à 37 ° C. </li><li> Ajouter 500 ul de phénol pH 7 et mélanger délicatement mais soigneusement en renversant. </li><li> Centrifuger à 13 000 g pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Retirer aqueuse (en haut) fraction dans un nouveau tube. </li><li> Répétez les étapes 11 à 13 fois. </li><li> Ajouter 500 ul 01h01 pH phénol / chloroforme 7 et mélanger délicatement mais soigneusement en renversant. </li><li> Centrifuger à 13 000 g pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Retirer aqueuse (en haut) fraction dans un nouveau tube. </li><li> Ajouter le volume 1/10ème acétate de sodium 3 M (40 pi) et bien mélanger. </li><li> Ajouter 2 volumes (900 pi) d&#39;éthanol à 100%, bien mélanger, et placer à -20 ° C pendant 20 min. </li><li> Centrifuger à 13 000 g pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Enlever l&#39;éthanol, le spin d&#39;impulsion, et éliminer l&#39;éthanol résiduel. </li><li> Ajouter 500 ul d&#39;éthanol froid à 70% pour se laver. Centrifuger à 13 000 g pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Enlever l&#39;éthanol à 70%, le spin d&#39;impulsion, et éliminer l&#39;éthanol résiduel par pipetage. </li><li> Sécher à l&#39;air le culot avec le bouchon ouvert pour 10 min à température ambiante pour enlever toute trace d&#39;éthanol résiduelle. </li><li> Resuspendre l&#39;ADN dans 50 ul de dH2O stérilisés nuit à 4 ° C. </li><li> Quantifier l&#39;ADN à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre NanoDrop. Un A 260: Un ratio de 1,8 280 est idéal. </li><li> Déterminer la qualité de l&#39;ADN et gamme de taille sur un gel d&#39;agarose avec 100 pb échelle. Aussi peu que 10 ng d&#39;ADN génomique peut être exécuté sur un gel d&#39;agarose 1,7% suivie d&#39;une coloration à l&#39;aide d&#39;un colorant qui est très sensible à de petites quantités d&#39;ADN tels que SYBR Gold. </li><li> Dans un tube siliconé par échantillon, préparer 1 pg d&#39;ADN dans un volume total de 50 pi avec le reste du volume faite avec stérilisés dH 2 O. </li></ol> L&#39;ADN SONICATION Sonication de l&#39;ADN et le protocole MeDIP doit être effectuée dans des tubes siliconzied pour empêcher la liaison non spécifique des protéines à parois du tube. Fois sonication optimale pour les échantillons d&#39;ADN sont basées sur le degré de fragmentation échantillon d&#39;ADN tel que déterminé par électrophorèse sur gel (étape 27). Par exemple, l&#39;ADN extrait de cellules cultivées devraient être de très haut poids moléculaire, et sera par la suite besoin de plus de sonication que l&#39;ADN extrait d&#39;échantillons d&#39;archives qui sont souvent partiellement dégradés. Si les échantillons sont de poids moléculaire élevé et uniforme, il est raisonnable à ce stade de procéder à la sonication comme décrit dans le présent Protocole sans vérifier chaque échantillon individuellement. Si les échantillons sont fragmentés avec des échantillons d&#39;archives, il sera nécessaire d&#39;adapter la procédure sonication vraisemblablement en diminuant les temps sonication pour obtenir 300 100 points de base de fragments. Si vous envisagez de traiter des échantillons qui sont partiellement dégradés, l&#39;optimisation des paramètres de sonication peut être effectuée sur un échantillon représentatif de ceux qui vous intéressent. Basé sur le degré de fragmentation de l&#39;ADN observée de l&#39;électrophorèse sur gel (étape 27), l&#39;expérimentateur peut prédéterminer le temps de sonication optimale pour l&#39;échantillon. Nous décrivons ici une méthode pour obtenir des fragments d&#39;ADN 300-1000 pb par sonication avec un dispositif automatisé sonication (Bioruptor partir Diagenode, UCD-200 TM) en utilisant l&#39;ADN de haute masse moléculaire. <ol><li> L&#39;eau dans Biorupter doit être à 4 ° C. </li><li> Soniquer pour 7 minutes sur les réglages automatiques (30 sec 30 sec sur le descendre à puissance maximale). </li><li> Retirer 800 ng (40 pi) de produit et le placer dans soniqué siliconé 1,7 ml tube de centrifugeuse pour l&#39;immunoprécipitation (IP) de réaction. </li><li> Mettez de côté restante de 200 ng (10 pi) pour servir d&#39;entrée (IN) d&#39;ADN de référence (conserver à 4 ° C). </li&gt; </ol> IMMUNOPRECIPITATON D&#39;ADN méthylé <ol><li> Dénaturer l&#39;ADN qui sera utilisé pour la réaction de propriété intellectuelle (800 ng) à 95 ° C pendant 10 min dans un bain d&#39;eau. </li><li> Refroidir immédiatement sur la glace. Laissez refroidir complètement l&#39;ADN (environ 5 minutes sur la glace) avant de procéder à l&#39;étape suivante. </li><li> Ajouter 5 g d&#39;anticorps monoclonaux. </li><li> Ajouter tampon IP (utilisé à la température ambiante au long de ce protocole) pour un volume final de 500 pl. </li><li> Incuber pendant 2 heures à 4 ° C en rotation porte-tube. </li><li> Juste avant l&#39;étape 5 est terminée, préparer Dynabeads par lavage (étapes 6-11). Tout d&#39;abord, remettre en suspension les perles à fond dans le flacon au vortex. </li><li> Transfert 30 pl (~ 2 x 10 7) du Dynabeads resuspendu par réaction plus 1, dans un nouveau tube siliconé (par exemple, si, ce faisant 8 réactions, enlever assez de billes pour le 9, soit 270 pl). </li><li> Placer le tube sur le support magnétique pour 2 minutes à température ambiante. </li><li> Pipeter le surnageant. Lors du retrait de surnageant, évitez de toucher les billes de l&#39;intérieur contre le mur (où les perles attirent l&#39;aimant) avec la pointe de la pipette. </li><li> Enlevez le tube de l&#39;aimant, et remettre en suspension les perles dans un volume de plus de mémoire tampon IP (750 ul ul-1000). Placer le tube de retour sur la grille magnétique pour 2 minutes à température ambiante. </li><li> Répétez le laver une fois de plus, puis remettre en suspension les billes lavées dans un tampon de propriété intellectuelle dans le premier volume retiré à l&#39;étape 7. </li><li> Ajouter 30 ul de Dynabeads lavés à chaque réaction IP </li><li> Incuber dans un porte-tube en rotation pendant 2 heures à 4 ° C. </li><li> Après incubation est terminée, placer le tube sur le support magnétique pour 2 minutes à température ambiante. </li><li> Pipeter le surnageant. Evitez de toucher le mur à l&#39;intérieur du tube (où les perles attirent l&#39;aimant) avec la pointe de la pipette. Ajouter 500 pi de tampon de propriété intellectuelle. Mélanger le contenu du tube et de le remettre sur la grille magnétique pour 2 mn. Répétez laver avec tampon de 500 ul IP en même temps. </li><li> Après avoir retiré le surnageant du dernier lavage, remettre en suspension les perles dans 400 ul de tampon de digestion. </li><li> Traiter la réaction avec 100 ug de protéinase K et incuber une nuit à 50 ° C. </li></ol> Purification de l&#39;ADN immunoprécipité <ol><li> Ajouter 500 ul 01h01 pH phénol / chloroforme et vortex 7 à fond. </li><li> Centrifuger à 13 000 g pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Retirer aqueuse (en haut) fraction dans un nouveau tube. </li><li> Répétez les étapes 1 à 3 si l&#39;interphase entre les phases aqueuse et organique semble brouillée. </li><li> Ajouter 1 / 10 ème de volume d&#39;acétate de sodium 3 M (40 pi) et de vortex. </li><li> Ajouter 1 l de glycogène (20 pg / pl) et vortex. </li><li> Ajouter 2 volumes (1000 pi) de l&#39;éthanol à 100%, vortex, et au lieu de -20 ° C pendant 20 min. </li><li> Centrifuger à 13 000 g pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Enlever l&#39;éthanol, le spin d&#39;impulsion, et éliminer l&#39;éthanol résiduel. </li><li> Ajouter 500 ul d&#39;éthanol froid à 70% pour se laver. Brièvement au vortex et spin à 13 000 g pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Enlever l&#39;éthanol à 70%, le spin d&#39;impulsion, et éliminer l&#39;éthanol résiduel par pipetage. </li><li> Sécher à l&#39;air le culot avec le bouchon ouvert pour 10 min à température ambiante pour enlever toute trace d&#39;éthanol résiduelle. </li><li> Resuspendre culot d&#39;ADN dans 10 ul stérilisés dH 2 0. </li></ol> VALIDATION PAR PCR <ol><li> Vous pouvez tester afin de s&#39;assurer que votre procédure MeDIP travaille en effectuant le protocole MeDIP aide normale de l&#39;ADN humain (homme ou femme), et ensuite doser une région connue pour être enrichi pour la méthylation. </li><li> Retirer 30% du produit MeDIP au tube de PCR, et un autre 30% du produit MeDIP à un autre tube de PCR. </li><li> Mettez 10 ng de l&#39;ADN EN dans un tube PCR, et 10 ng de l&#39;ADN EN dans un autre tube de PCR. Vous devriez maintenant avoir quatre réactions PCR séparées de mettre en place. </li><li> Effectuer PCR en utilisant H19 et CTRL amorces comme indiqué dans le tableau 1. </li><li> Préparer deux mastermixes (un pour chaque ensemble d&#39;amorces) pour les réactions PCR avec 12,5 ul volume total comme indiqué dans le tableau 2. </li><li> Thermocycle la PCR en utilisant les conditions décrites dans le Tableau 3. </li><li> Exécuter 5 pl de produits de PCR sur un gel agarose à 2% pour la visualisation. </li><li> Les résultats attendus pour MeDIP succès sont présentés dans le Tableau 4. </li></ol> Tableaux Tableau 1: H19 et CTRL amorces pour la validation de la PCR. <table border="1"><tbody><tr><td> Ensemble d&#39;amorces </td><td> Amorce sens </td><td> Amorce antisens </td><td> Taille du produit anticipé </td></tr><tr><td> H19 </td><td> H19_F 5&#39;-cgagtgtgcgtgagtgtgag </td><td> H19_R 5&#39;-ggcgtaatggaatgcttgaa </td><td> 174 pb </td></tr><tr><td> CTRL (contrôle) </td><td> CTRL_F5&#39;-gagagcattagggcagacaaa </td><td> CTRL_R 5&#39;-gttcctcagacagccacattt </td><td> 139 pb </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Mastermixes pour les réactions PCR. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> H19 Mix (par Rxn) </td><td> CTRL Mix (par Rxn) </td></tr><tr><td&gt; ddH 2 O </td><td> 6,875 </td><td> 6,875 </td></tr><tr><td> Tampon 10X </td><td> 1,25 </td><td> 1,25 </td></tr><tr><td> mélange de dNTP (10 mM chacun) </td><td> 0,25 </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> MgCl2 (50 mM) </td><td> 0,25 </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> Amorces (H19_F / R ou CTRL_F / R) (10 uM de chaque F / R) </td><td> 0,625 </td><td> 0,625 </td></tr><tr><td> Taq Platinum </td><td> 0,25 </td><td> 0,25 </td></tr></tbody></table> Tableau 3. PCR conditions thermocyling. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 95 ° C </td><td> 05:00 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 40X </td><td> 95 ° C </td><td> 00:30 </td></tr><tr><td> 56 ° C </td><td> 00:30 </td></tr><tr><td> 72 ° C </td><td> 00:15 </td></tr></tbody></table> Tableau 4. Résultats attendus PCR pour MeDIP succès. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2" align="center"> Matrice d&#39;ADN </td></tr><tr><td> Amorce utilisée </td><td> EN </td><td> IP </td></tr><tr><td> H19 </td><td> Positive </td><td> Positive </td></tr><tr><td> CTRL </td><td> Positive </td><td> Négative </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Beck, S., Rakyan, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methylome%3A+approaches+for+global+DNA+methylation+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The methylome: approaches for global DNA methylation profiling.</a> Trends Genet. 24, 231-237 (2008).</li>
<li>Lu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%2C+disease%2C+and+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+research+reviews%22%5BJournal%5D)">Epigenetics, disease, and therapeutic interventions.</a> Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).</li>
<li>Zilberman, D., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+DNA+methylation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of DNA methylation patterns.</a> Development. 134, 3959-3965 (2007).</li>
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<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution%2C+silencing+potential+and+evolutionary+impact+of+promoter+DNA+methylation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome.</a> Nat Genet. 39, 457-466 (2007).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome-wide+and+promoter-specific+analyses+identify+sites+of+differential+DNA+methylation+in+normal+and+transformed+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells.</a> Nat Genet. 37, 853-862 (2005).</li>
<li>Wilson, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomics%3A+mapping+the+methylome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Epigenomics: mapping the methylome.</a> Cell Cycle. 5, 155-158 (2006).</li>
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<li>Karpinski, P., Sasiadek, M. M., Blin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+epigenetic+patterns+in+the+etiology+of+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied%22%5BJournal%5D)">Aberrant epigenetic patterns in the etiology of gastrointestinal cancers.</a> Journal of applied. 49, 1-10 (2008).</li>
<li>Maekawa, M., Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+relations+to+disease+and+laboratory+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Current+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: relations to disease and laboratory findings.</a> Current medicinal chemistry. 14, 2642-2653 (2007).</li>
<li>Vucic, E. A., Brown, C. J., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of cancer progression.</a> Pharmacogenomics. 9, 215-234 (2008).</li>
<li>Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+in+human+disease+and+prospects+for+epigenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.</a> Nature. 429, 457-463 (2004).</li>
<li>Jones, P. A., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+role+of+epigenetic+events+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The fundamental role of epigenetic events in cancer.</a> Nat Rev Genet. 3, 415-428 (2002).</li>
<li>Fraga, M. F., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation%3A+a+profile+of+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">DNA methylation: a profile of methods and applications.</a> Biotechniques. 33, 632-649 (2002).</li>
</ol>

Il ya une conscience croissante de la joue rôle important dans la maladie de méthylation de l&#39;ADN, donc le développement de tests pour mesurer cette modification sont de plus en plus important 3, 12, 13. La technique est un outil MeDIP prête pour le dépistage à la fois l&#39;ensemble du génome et spécifiques de locus niveau 6, 7. Cette technique offre une vue rapide des niveaux de méthylation de l&#39;ADN en utilisant des quantités limitées de démarrage de l&#39;ADN et permet des comparaisons f...

<table><tbody><tr><td>Sonicateur Biorupter</td><td>Outil</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200 TM</td><td></td></tr><tr><td>Tubes microcentrifuge SafeSeal de 1,7 ml</td><td>Autre</td><td>Sorenson BioScience</td><td>11510</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre ND 3300</td><td>Outil</td><td>NanoDrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorps primaire : anticorps monoclonal de souris anti-5&amp;rsquo;-méthylcytosine</td><td>Réactif</td><td>Calbiochem</td><td>162 33 D3</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire : billes magnétiques Dynabeads M-280 anti-IgG de mouton</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>112-01D</td><td></td></tr><tr><td>Support magnétique pour tubes</td><td>Outil</td><td>Invitrogen</td><td>CS15000</td><td></td></tr><tr><td>Mini LabRoller</td><td>Outil</td><td>Labnet International</td><td>H5500</td><td></td></tr><tr><td>Buffer d'immunoprécipitation (IP Buffer)</td><td></td><td></td><td></td><td>10 mM NaPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; pH 7,0, 140 mM NaCl, 0,05 % de Triton X-100. À conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>Buffer de digestion</td><td></td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH 8,0, 100 mM EDTA, 0,5 % de SDS, 50 mM NaCl</td></tr></tbody></table>

immunoprécipitation adn méthylé

Methylated DNA Immunoprecipitation

L&#39;identification de modèles de méthylation d&#39;ADN est une procédure commune à l&#39;étude de l&#39;épigénétique, la méthylation est connu pour avoir des effets significatifs sur l&#39;expression des gènes, et est impliqué dans le développement normal ainsi que les maladies<sup&gt; 1-4</sup&gt;. Ainsi, la capacité à discriminer entre l&#39;ADN méthylé et non méthylés d&#39;ADN est essentielle pour générer des profils de méthylation pour de telles études. Méthylés d&#39;ADN immunoprécipitation (MeDIP) est une technique efficace pour l&#39;extraction de l&#39;ADN méthylé à partir d&#39;un échantillon d&#39;intérêt<sup&gt; 5-7</sup&gt;. Un échantillon d&#39;aussi peu que 200 ng d&#39;ADN est suffisante pour l&#39;anticorps, ou immunoprécipitation (IP), la réaction. L&#39;ADN est traité par ultrasons en fragments d&#39;une taille allant 300-1000 pb, et est divisé en immunoprécipité (IP) et d&#39;entrée (IN) portions. L&#39;ADN IP est ensuite dénaturé à la chaleur et ensuite incubées avec des anti-5&#39;mC, permettant à l&#39;anticorps monoclonal de lier l&#39;ADN méthylé. Après cela, les billes magnétiques contenant un anticorps secondaire ayant une affinité pour l&#39;anticorps primaire sont ajoutés et incubés. Ces anticorps perles liés liera l&#39;anticorps monoclonal utilisé dans la première étape. ADN lié au complexe anticorps (ADN méthylé) est séparé du reste de l&#39;ADN en utilisant un aimant pour tirer les complexes de la solution. Plusieurs lavages à l&#39;aide du tampon IP sont ensuite effectuées pour enlever le non consolidées, non méthylés d&#39;ADN. L&#39;ADN méthylé / anticorps sont ensuite digérés par la protéinase K pour digérer les anticorps ne laissant que l&#39;ADN méthylé intacte. L&#39;ADN est purifié enrichi par le phénol: l&#39;extraction du chloroforme pour éliminer la matière protéique et ensuite précipité et resuspendu dans de l&#39;eau pour une utilisation ultérieure. Les techniques de PCR peut être utilisée pour valider l&#39;efficacité de la procédure MeDIP par l&#39;analyse des produits d&#39;amplification de l&#39;ADN IP et IN pour les régions connues pour manque et connu pour contenir des séquences méthylées. L&#39;ADN purifié méthylées peuvent alors être utilisées pour les locus spécifiques (PCR) ou l&#39;ensemble du génome (biopuces et séquençage) des études de méthylation, et est particulièrement utile lorsqu&#39;il est appliqué en conjonction avec d&#39;autres outils de recherche tels que le profilage d&#39;expression génique et d&#39;hybridation génomique comparative sur microréseau ( CGH)<sup&gt; 8</sup&gt;. Une enquête plus approfondie méthylation de l&#39;ADN va conduire à la découverte de nouvelles cibles épigénétiques, qui à leur tour, peuvent être utiles au développement de nouveaux outils de recherche thérapeutique ou pronostique pour les maladies comme le cancer qui sont caractérisées par l&#39;ADN méthylé aberrante<sup&gt; 2, 4, 9-11</sup&gt;.

Cette vidéo montre le protocole pour immunoprécipitation ADN méthylé (MeDIP). MeDIP est une procédure de deux jours qui extrait sélectivement des fragments d&#39;ADN méthylé à partir d&#39;un échantillon d&#39;ADN génomique en utilisant des anticorps avec une spécificité pour la 5-méthylcytosine (anti-5 MC).

Immunoprécipitation ADN méthylé

L'identification des profils de méthylation de l'ADN est une procédure courante dans l'étude de l'épigénétique, car il est établi que la méthylation a des effets significatifs sur...

Ce vidéo montre un protocole d'immunoprécipitation de l'ADN méthylé, ou MeDIP, une méthode utilisée pour isoler spécifiquement l'ADN méthylé de manière impartiale. La méthylation de l'ADN chez les mammifères est caractérisée par l'ajout d'un groupe méthyle en position C5 de la cytosine.Lorsqu'elle est présente dans un dinucléotide CPG, il s'agit d'une marque épigénétique réversible qui joue un rôle important dans le développement normal, ainsi que dans plusieurs processus pathologiques. Les fonctions normales de la méthylation de l'ADN incluent l'inactivation du chromosome X chez les femmes, le silence des éléments répétitifs, l'empreinte génomique et le maintien de la stabilité génomique. La méthylation de l'ADN a également été mise en évidence dans de nombreuses maladies telles que le cancer, le syndrome de Prader-Willi, le syndrome de ICF (immunodéficience, instabilité centromérique et anomalies faciales) et d'autres syndromes.Dans les cancers, par exemple, une hyperméthylation anormale des promoteurs peut entraîner la suppression de gènes essentiels de suppression tumorale. Tandis qu'une hypométhylation inappropriée provoque une instabilité chromosomique et l'activation des oncogènes, la réunion est réalisée en fragmentant d'abord l'ADN par sonication, en des morceaux dont la taille varie entre 300 et 1000 paires de bases. L'ADN soniqué est ensuite dénaturé à 95 degrés Celsius.Des anticorps primaires, qui reconnaissent la méthazine en position cinq prime, sont ajoutés et laissés pour se lier aux fragments d'ADN méthylés. Des anticorps secondaires, conjugués à des billes magnétiques Dyna, sont utilisés pour isoler les fragments d'ADN qui ont été liés par l'anticorps primaire. Les fragments non méthylés sont éliminés et les anticorps sont digérés par la protéinase.Le nettoyage au chloroforme phénylé de KA élimine les protéines digérées et la précipitation purifie l'ADN, qui est désormais enrichi en fragments méthylés. L'ADN peut ensuite être utilisé pour des applications telles que la PCR, les puces à ADN et le séquençage. Ce protocole est généralement réalisé en deux jours.Le jour un comprend la préparation de l'ADN, la sonication, l'immunoprécipitation et la digestion des protéines. Le jour deux comprend l'extraction par phénol-chloroforme et la précipitation à l'éthanol afin de purifier et d'isoler l'ADN enrichi en méthylations. Plusieurs matériaux spéciaux sont nécessaires pour cette expérience, notamment des tubes centrifugeuses silanisés, un appareil de sonication de l'ADN, un anticorps primaire, un anticorps monoclonal anti-5-méthylcytosine de souris, un anticorps secondaire, des billes Dyna conjuguées à l'anticorps anti-IgG de mouton, et un support magnétique pour tubes.La première étape du protocole Meetup consiste en la préparation de l'ADN. Il est impératif d'évaluer la nature de l'ADN au préalable. Connaître l'état de l'ADN échantillon, qu'il soit principalement bicaténaire ou monocaténaire, est nécessaire, car une quantification précise de l'échantillon est d'une importance capitale, et diverses méthodes de détermination de la quantité d'ADN peuvent être négativement affectées par la présence d'espèces d'ADN indésirables.La quantité d'ADN double brin peut être évaluée facilement par photométrie spectrale à l'aide d'un NanoDrop 3. Chargez 1,5 microlitre et réglez le type de mesure sur acide nucléique, sélectionnez ADN 50 comme paramètre de calcul, puis initialisez l'appareil avec 1,5 microlitre d'eau. Nettoyez les plateaux et effectuez le blanc avec 1,5 microlitre du liquide. L'échantillon est dissous dans le solvant : nettoyez les plateaux, chargez 1,5 microlitre de l'échantillon, puis appuyez sur mesurer.La concentration sera indiquée et peut être utilisée. Pour calculer le nombre de microlitres nécessaire pour moi, plongez un A deux 60 à deux 80 avec un ratio de 1,8, ce qui est idéal ici. Un échantillon d'un microgramme est préparé.Cependant, un échantillon aussi faible que 200 nanogrammes suffit pour obtenir des résultats concluants. Pour la réunion, chargez l'échantillon d'ADN dans un tube propre silanisé. Ajoutez suffisamment d'eau stérile pour ajuster le volume final à 50 microlitres.La sonication de l'ADN et l'immunoprécipitation doivent être effectuées dans des tubes silanisés afin d'éviter la liaison non spécifique de l'ADN et des protéines aux parois des tubes. Une fois l'ADN préparé, l'échantillon doit être soumis à une sonication, qui est nécessaire pour fragmenter l'ADN, car l'immunoprécipitation est plus efficace avec des fragments d'ADN plus petits. Chargez l'échantillon dans le sonicateur, assurez-vous que le réglage de puissance est positionné sur « élevé » et que l'appareil est réglé sur 30 secondes. Après 30 secondes d'arrêt, remplissez le bac jusqu'au trait de remplissage avec de l'eau à quatre degrés Celsius.Soniquez l'échantillon pendant sept minutes. Une fois la sonication terminée, retirez le tube et placez-le sur de la glace. Il est important d'optimiser les conditions de sonication en fonction de l'échantillon et de la taille de l'ADN prévus au préalable.Par exemple, un échantillon d'ADN partiellement dégradé nécessitera un temps de sonication plus court. Les produits de sonication peuvent être visualisés par des techniques électrophorétiques classiques. À ce stade, on recherche des fragments d'ADN dont la taille varie entre 300 et 1000 paires de bases, destinés à une utilisation ultérieure.Dans les tests par puces à ADN et par PCR, vous devez réserver un cinquième de votre ADN pour servir d'ADN témoin ou de référence ; dans ce cas, 800 nanogrammes d'ADN soniqué seront utilisés pour l'immunoprécipitation et le reste sera mis de côté comme ADN de référence. L'étape suivante du protocole consiste en la réaction d'immunoprécipitation (IP). Avant l'ajout de l'anticorps primaire, l'ADN doit être dénaturé. La dénaturation est nécessaire car l'anticorps primaire est sensible à l'ADN simple brin.Placer l'échantillon dans un bain-marie à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Une fois l'étape de dénaturation terminée, transférer immédiatement le tube sur de la glace pendant au moins cinq minutes. Cela empêchera l'ADN dénaturé de se replier et permettra une liaison optimale des anticorps lorsque l'échantillon aura refroidi.Faites tourner brièvement le tube afin de rassembler le contenu au fond. Ensuite, ajoutez l'anticorps primaire. La quantité d'anticorps utilisée doit être titrée pour chaque lot et pour chaque fabricant.Dans ce cas, nous ajoutons cinq microgrammes d'anticorps primaire, puis du tampon d'immunoprécipitation ou tampon IP jusqu'à un volume final de 500 microlitres. Ensuite, l'ADN d'immunoprécipitation est placé dans un rotateur et incubé à quatre degrés Celsius pendant deux heures. Une rotation est nécessaire pour éviter la conglobération des anticorps dans le tube pendant l'incubation.Environ 15 minutes avant la fin de l'incubation avec l'anticorps primaire, nettoyez et préparez les billes magnétiques Dyna. Tout d'abord, remettez bien en suspension les billes dans le flacon par vortexage. Ensuite, transférez 30 microlitres de billes dans un tube neuf siliconé et placez ce tube sur un support magnétique pour plusieurs réactions.Transférez 30 microlitres de billes par réaction, plus suffisamment pour une réaction supplémentaire afin de tenir compte d'une erreur de pipetage ou d'une perte accidentelle de certaines billes. Par exemple, pour huit réactions, prélèvez suffisamment de billes pour neuf réactions, soit 270 microlitres.Les billes magnétiques seront attirées vers la paroi du support magnétique. Laisser deux minutes pour que les billes migrent et se déposent en une bande bien définie sur la paroi du tube. Ensuite, retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette en veillant soigneusement à ne pas déranger les billes situées sur la paroi arrière avec la pointe de la pipette.Remplacez le surnageant par un volume excédentaire de tampon IP, vortexez et replacez-le sur le support magnétique pendant deux minutes. Répétez ce lavage une fois supplémentaire et remettez en suspension les billes de lavage dans leur volume initial de tampon IP. Récupérez le tube d'échantillon du rotateur lorsque l'incubation est terminée.Pour terminer l'immunoprécipitation, ajouter 30 microlitres de billes propres à la réaction et replacer le tube dans un rotateur pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Pendant cette incubation, l'anticorps secondaire, qui est un anti-IgG de souris, se liera à l'anticorps primaire de souris. Les anticorps anti-souris sont conjugués à des billes magnétiques Dyna, permettant une récupération facile des produits liés et la purification qui suit.Une fois l'incubation avec les deux anticorps terminée, placez le tube d'IP sur le support magnétique pendant deux minutes. À ce stade, l'ADN méthylé sera lié par l'anticorps primaire, qui lui-même sera lié à l'anticorps secondaire conjugué aux billes Dyna. Retirez et jetez le surnageant, puis remplacez-le par 500 microlitres de tampon d'IP.Mélangez le contenu du tube et replacez-le sur le porte-échantillons pendant deux minutes. Répétez ce lavage une fois supplémentaire avec le tampon IP. Après avoir éliminé le surnageant du dernier lavage Resus, resuspendez les billes pour la dernière fois.Dans 400 microlitres de tampon de digestion, traitez la réaction avec 100 microgrammes de protéinase K et incubez toute la nuit à 50 degrés Celsius. Le traitement par la protéinase K est nécessaire pour digérer les protéines d'anticorps et toute protéine résiduelle associée à l'ADN, permettant ainsi la libération de l'ADN méthylé en solution. La purification de l'ADN est réalisée le deuxième jour de la procédure de rencontre ; retirez le tube de digestion de l'incubateur.Dans une hotte, ajoutez 500 microlitres de phénol-chloroforme un-à-un à pH sept dans le tube et mélangez soigneusement par vortex. Faites centrifuger le tube pendant 10 minutes à 13 000 ×g. Retirez délicatement la phase aqueuse supérieure du tube sans perturber l'interface ni prélever une partie de la phase organique. Transférez la phase aqueuse dans un nouveau tube.Une seconde extraction peut être effectuée si l'interface apparaît trouble. Ensuite, ajoutez un dixième du volume d'acétate de sodium trois molaire, dans ce cas, 40 microlitres. Un microlitre de glycogène peut être utilisé comme agent porteur pour faciliter le nettoyage du culot.Vortexez le tube pour mélanger le contenu. Ajoutez ensuite deux volumes d'éthanol à 100 %, vortexez et placez au congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant 20 minutes après congélation. L'ADN précipité est centrifugé à 13 000 ×g et à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.Un culot d'ADN se formera au fond du tube. Retirer le tube de la centrifugeuse et éliminer l'éthanol. Veiller à ne pas perturber le culot au fond du tube.Une courte centrifugation peut être nécessaire pour éliminer tout éthanol résiduel. Pour laver le culot, ajoutez 500 microlitres d'éthanol froid à 70 %, vortexez, puis centrifugez à nouveau pendant 20 minutes à 13 000 g et à quatre degrés Celsius. Lorsque la deuxième centrifugation est terminée, retirez l'éthanol à 70 % par une courte centrifugation et éliminez l'éthanol résiduel à l’aide d’une pipette.Laissez le tube sur un support, avec le bouchon ouvert, pour sécher le culot et permettre l'évaporation de l'éthanol résiduel. Enfin, reprendre le culot contenant uniquement l'ADN enrichi en méthylation avec 10 microlitres d'eau stérile, en laissant suffisamment de temps pour que le culot d'ADN se dissolve avant utilisation. Il est recommandé de valider l'efficacité de l'enrichissement par PCR.Cela peut être réalisé en effectuant des réactions de PCR conçues pour amplifier de manière différentielle des produits illustrant des fragments d'ADN méthylés et non méthylés à l'aide de primers spécifiques de l'ADN humain normal. La région contrôle d'empreinte H19 peut être utilisée conjointement avec des primers conçus pour amplifier une région du génome qui n'est pas méthylée. Des exemples de séquences de primers et de conditions de cyclage en PCR sont indiqués dans le protocole associé.À ce stade, il est nécessaire de récupérer l'ADN témoin ou de référence mis de côté au début du protocole de meetup. Un premier jeu de réactions de PCR sera mis en place en utilisant l'ADN témoin, et un second jeu utilisera l'ADN IP enrichi en méthylations. Si le meetup a réussi, la PCR IP produira un produit avec les amorces de méthylation et aucun produit avec les amorces de contrôle.En revanche, la PCR d'entrée devrait produire des produits en utilisant les deux amorces, car elle contient à la fois des fragments d'ADN méthylés et non méthylés. L'ADN enrichi en fragments méthylés peut être utilisé pour diverses applications en aval, telles que le séquençage par PCR et l'analyse par puces à ADN.Lorsqu'elle est associée à d'autres techniques de biologie moléculaire, elle peut être utilisée pour étudier l'état de méthylation de l'ADN de manière spécifique à un locus ou à l'échelle du génome entier, afin d'effectuer un profilage de la méthylation ou d'étudier l'épigénomique.

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