Étiquetage sélective des protéines de surface cellulaire utilisant CyDye DIGE Fluor Colorants Minimal

Je m’appelle Maria et je travaille chez Y Healthcare à NOS en Suède. Les protéines de surface cellulaire sont souvent impliquées dans la communication entre les cellules et leur environnement et suscitent donc un intérêt particulier dans la recherche, visant à mieux comprendre les maladies ainsi que d’autres variations biologiques induites par les changements dans l’environnement cellulaire. Dans cette vidéo, je vais vous montrer un protocole simple de marquage de la surface cellulaire de l’œil latéral et vous serez en mesure d’enrichir visuellement ces protéines peu abondantes sans amélioration physique et d’étudier les différences de ces protéines de surface cellulaire avec la technologie.

Si vous trouvez cette technologie intéressante, vous pouvez trouver plus d’informations dans le manuel 2D. De plus, nous avons une note d’application sur ce sujet particulier que vous pouvez télécharger à partir du job Dans le protocole d’étiquetage de la surface des cellules vu en haut, vous étiquetez les cellules alors qu’elles sont encore intactes. Pendant le processus de marquage, le colorant n’aura accès qu’aux protéines de surface des cellules.

Après l’étape de marquage, les cellules sont analysées pour vérifier le marquage spécifique à la surface des cellules. L’échantillon de marquage a été fractionné en protéines membranaires et cytosoliques. Un échantillon non fractionné a été préparé en parallèle.

À titre de comparaison, cette analyse de fractionnement n’est pas nécessaire, mais a été faite ici juste pour montrer que le protocole de surface cellulaire est spécifique aux conseils de Cell Surface Pro. Nous avons également effectué le protocole standard de marquage non diététique de l’ETH vu ci-dessous les cellules sont des mensonges avant le marquage, et de cette façon, toutes les protéines cellulaires sont accessibles pour le marquage. Après l’étape de marquage, les échantillons sont soumis à une électrophorèse 2D.

Les cellules adhérentes sont détachées à l’aide d’une procédure non enzymatique pour éviter la digestion des protéines de surface cellulaire ciblées. Dans ce protocole, nous utilisons le policier en caoutchouc, mais l’utilisation de milieux de dissociation enzymatique à trois cellules est également une option de comptage et de division des suspensions cellulaires en quas de cinq à 10 millions de cellules par tube. Les cellules sont ensuite granulées et lavées dans H-P-S-S-P-H 7.4 pour éliminer les traces de culture cellulaire.

La contamination des milieux par les protéines sériques et les composants fluorescents peut interférer avec le marquage et la détection. Les cellules en suspension sont directement granulées et lavées avant l’étape d’étiquetage après le lavage. La palette cellulaire est remise en suspension dans un tampon d’étiquetage à froid glacé de 200 microlitres contenant un HPSS pH 8,5 et une molurie.

Pour des conditions de marquage optimales des protéines de surface cellulaire, vérifiez toujours le pH. Avant l’étiquetage, nous utilisions 600 pic de moule side-eye pour 10 millions de cellules CHO. Le rapport optimal entre l’œil latéral et le nombre de cellules varie en fonction du type de cellule.

Puisque nous ne connaissons pas les concentrations exactes de protéines à la surface de la cellule. Comment déterminer les conditions optimales pour le marquage des protéines dans l’œil latéral est décrit dans le manuel des principes et méthodes de l’électrophorèse 2D. Les cellules sont incubées avec l’œil latéral D, un minimum de dés pendant 20 minutes sur de la glace dans l’obscurité.

Après la réaction de marquage, le colorant non réactif est trempé en ajoutant 20 microlitres de lysine de 10 millimolaires. Les cellules de marquage sont maintenant lavées deux fois dans un tampon HPSS pH 7,4 à froid pour éliminer l’œil latéral en excès. Il n’y aura donc plus de colorant libre pour le marquage intracellulaire indésirable ou les protéines lors de l’étape suivante, qui est la lyse cellulaire.

Les protéines à la surface des cellules sont maintenant marquées et les cellules sont lavées et prêtes à être liquées. La pastille de l’étape de lavage perdue est remise en suspension dans un tampon de lyse à froid de 150 microlitres contenant sept molaires d’urie, deux molaires de thiurie, 4 % de chaps 30 millimolaires d’arbres cinq millimolaires d’acétate de magnésium pH 8,5 et laissée sur la glace pendant au moins une heure avec une pression occasionnelle de vortex. Les échantillons sont maintenant prêts pour la séparation 2D.

La première étape de l’électrolyse consiste à préparer des bandelettes IPD pour la réhydratation. Préparez la solution de réhydratation de district en ajoutant un tampon IPG correspondant à l’intervalle de pH des bandelettes utilisées, et ajoutez la solution dans la lentille du plateau de réhydratation. Retirez le film protecteur de la bande IPG et placez soigneusement les bandelettes avec un gel séché vers le bas dans le bac de réhydratation contenant la solution de réhydratation.

Fermez le couvercle de la boîte IPG et réhydratez les bandelettes pendant la nuit. Dans la première dimension, la focalisation isoélectrique, les protéines sont séparées en fonction de leur pi. Ceci est effectué à l’aide de l’IPG quatre trois.

Les bandelettes réhydratées sont placées dans le collecteur et l’électrode est montée sur le dessus. 50 microgrammes de chaque échantillon ont été appliqués à l’aide de capuchons d’application d’échantillon. Nous avons soit appliqué directement des échantillons non fractionnés sans fractionnement préalable, soit fractionné les échantillons en fractions membranaires et cytosoliques avant qu’ils ne soient appliqués.

Le plomb est fermé pour protéger les échantillons fluorescents de la lumière. L’instrument a été programmé selon les recommandations et a fonctionné pendant la nuit. Les gros gels lamby à 12 % ont coûté en utilisant du gel 12 pour adultes.

Une solution de déplacement de Coster a été ajoutée pour éviter la présence de gels d’acry polymérisés dans les tubes. Les gels ont été laissés polymériser pendant la nuit à température ambiante avant d’être utilisés. Après la focalisation isoélectrique, les bandes sont retirées et équilibrées dans le SDS contenant le tampon en deux étapes à l’aide de DTT pour réduire les liaisons disulfure des résidus de cystéine suivie d’une alkylation avec votre acétamide pour éviter la modification par l’acrylamide.

Les bandes IPG sont trempées dans un tampon de coulée et soigneusement placées sur les deux grands gels d’excavation. Évitez de piéger l’air entre les bandes et le gel scellé en ajoutant une solution agricole fondue à 2 % avec du bleu bromo anol sur le dessus. Les gels sont maintenant prêts pour la séparation de la page SDS de la deuxième dimension Dans la page SDS de la deuxième dimension.

Les protéines seront séparées en fonction du poids moléculaire et cela est effectué avec le système tonal six. Remplissez la chambre d’électrophorèse avec un tampon anodique, insérez les gels et remplissez le compartiment supérieur avec un programme de tampon cathodique. L’alimentation électrique selon les recommandations et faire fonctionner la deuxième dimension à l’abri de la lumière pendant environ quatre à cinq heures ou jusqu’à ce que le front du colorant atteigne le fond du gel.

Après l’électrophorèse de deuxième dimension, les cassettes de gel sont placées à l’aide des pinces dans l’imageur fluorescent Typhoon. Deux gels et trois canaux peuvent être scannés simultanément. Le résultat de ces deux DL montre une haute résolution des protéines membranaires dans l’échantillon, même s’il existe certaines restrictions connues pour que les protéines hydrophobes soient détectées dans A deux DL.

Ces résultats montrent que le protocole de marquage de la surface cellulaire est très spécifique pour le marquage des protéines de surface cellulaire. Comme les protéines de surface cellulaire sont exclusivement marquées, elles sont plus facilement visualisées et l’atténuation par des protéines cytosoliques abondantes est évitée. L’image fluorescente de gels avec fraction membranaire non fractionnée ou fraction cytosolique est montrée en haut.

Ci-dessous, une image de la même tache de gel avec de l’argent. Les résultats ne montrent pas de marquage fluorescent des protéines cytosoliques, mais la coloration à l’argent montre qu’il y a des protéines dans les gels. Les résultats montrent également des modèles de carte de points similaires à partir de fractions non fractionnées et de fractions membranaires, démontrant qu’il n’est pas nécessaire de fractionner avant l’électrophorèse 2D, ce qui rend ce protocole à la fois simple et pratique.

SI deux, SI trois et SCI cinq présentent des modèles de marquage similaires et sont tous compatibles avec le protocole de surface des cellules. Une expérience de régime a été réalisée en utilisant les trois yeux latéraux DI plancher minimal dy pour étudier l’expression différentielle des protéines de surface cellulaire dans les cellules CHO de la famine sérique pendant différentes durées. CY deux échantillons de surface cellulaire de tous les échantillons de l’expérience ont été regroupés et utilisés comme étalon interne.

Les changements différentiels de plusieurs protéines de surface cellulaire ont pu être suivis pendant la période de famine. Plus de 18 nouvelles protéines membranaires ont été détectées à l’aide du protocole de surface cellulaire qui n’ont pas été détectées avec le protocole standard pour trouver l’identité des protéines dans le gel préparatif. Il a été nécessaire d’atteindre un pic avec l’échantillon de surface cellulaire pour faciliter l’appariement aux points de l’ensemble de données analytiques.

Il y a des résultats. Les résultats montrent une haute résolution d’un grand nombre de protéines de surface cellulaire. Ce protocole est très spécifique pour les protéines de surface cellulaire et aucun marquage des protéines intracellulaires n’a été observé.

Avec cette méthode, vous êtes en mesure de détecter plus de protéines de surface cellulaire par rapport à un protocole standard, et comme vous l’avez déjà vu, c’est un protocole très simple à exécuter. Il vous suffit de marquer les protéines de surface de vos cellules pendant qu’elles sont encore intactes et de les exécuter directement sur l’électrophorèse 2D sans fractionnement membranaire. Il s’agit donc d’un très bon protocole pour étudier les protéines de surface cellulaire et les différences entre celles avec la technologie D.