Soutenu bicouches planaires pour la formation des synapses immunologiques Etude de et Kinapse

Bonjour, je suis Mike Dustin de l'Institut Geral et de la faculté de médecine de l'Université de New York. Aujourd'hui, je vais vous guider à travers la procédure de formation de bicouches planes supportées pour l'étude de la synapse immunologique. Commençons donc.

Pour former la bicouche lipidique, nous préparons une solution contenant 20 % de lipide chélatant au nickel et 80 % de phosphatidylcholine, en quantités appropriées, dans un tube en verre avec un à deux millilitres de chloroforme-méthanol. La première étape consiste à évaporer le solvant sous un courant d'azote dans un bain d'eau tiède à 30-37 degrés Celsius. Cette étape prend généralement environ 15 minutes.

Ensuite, éliminer tout solvant résiduel sous vide poussé à l'aide d'un lyophilisateur pendant 90 minutes. Puis, dissoudre les lipides dans un tampon salin contenant 2 %N de glucoside d'octyle, afin d'obtenir une concentration finale de 0,4 millimolaire. Cela permet d'obtenir une solution de micelles mixtes de détergent et de phospholipides destinée à former des liposomes.

Vous dialysez cette solution contre trois changements de solution saline au tris afin d'éliminer le détergent et former des liposomes. Nous travaillons habituellement avec des volumes de l'ordre d'un millilitre, en utilisant un tube de six millimètres de diamètre et de coupure d'environ 10 kilodaltons, en prenant soin d'écarter toute bulle d'air lors du serrage du tube. Nous filtrons stérilement cette solution et effectuons la dialyse dans des conditions aseptiques, en la manipulant avec des gants stérilisés à l'éthanol à 70 %.

Cette solution doit être parfaitement claire et est conservée sous atmosphère d'argon pour éviter l'oxydation. Si la solution est trouble, vous avez généré des vésicules multicouches et devez recommencer. Afin de préparer l'expérience, nous devons d'abord déterminer la quantité d'ICAM-1 et de CMH déposée sur une surface donnée d'une bicouche chélatant le nickel, pour une concentration donnée de protéine soluble.

Pour ce faire, nous déposons des bicouches sur des billes de verre d'un diamètre de cinq micromètres. Incubez les billes de verre avec des solutions de protéines dans des conditions proches de celles utilisées dans les cellules d'écoulement pour l'imagerie, puis mesurez la densité de protéine liée à l'aide d'un dosage immuno-fluorométrique en flux. Des anticorps marqués par FSI, portant un nombre connu de fluorescéine par molécule, sont utilisés pour détecter les protéines fixées à la surface, et des billes étalons de fluorescéine servent à étalonner le micro-fluorimètre en flux.

Nous allons établir des conditions qui approchent celles des cellules présentatrices d'antigènes avec 200 molécules par micromètre carré d'ICAM-1 et de 0,2 à 20 molécules par micromètre carré de I-E-K-M-C-C 91 1 0 3. Des bicouches planes complexes se forment spontanément lorsque les liposomes fusionnent avec du verre, mais uniquement si celui-ci est correctement nettoyé pour devenir un verre propre. Nous utilisons une solution de piranha, un mélange fraîchement préparé d'acide sulfurique et de peroxyde d'hydrogène à 30 %, qui détruit tous les matériaux organiques et rend en outre la surface du verre très hydrophile.

Lorsque l'on manipule le mélange piranha, nous portons des vêtements de protection complets, y compris un tablier antiacide et de gros gants résistants aux acides. Les déchets doivent être soigneusement séparés des déchets organiques et éliminés correctement. Pour préparer la solution acide piranha, ajoutez 75 millilitres d'acide sulfurique concentré dans un bécher sec, puis ajoutez soigneusement 25 millilitres de peroxyde d'hydrogène à 30 %.

La solution s'échauffe rapidement à plus de 100 degrés Celsius ; plongez alors les lamelles sèches dans la solution pendant 15 minutes. Après cette incubation dans le mélange piranha, immergez les lamelles dans de l'eau purifiée, puis rincez-les pendant une minute de chaque côté. Séchez ensuite les lamelles à l'aide d'une source sous vide pour éliminer l'eau purifiée.

Laisser refroidir la solution de piranha, puis l'ajouter au contenant de déchets de piranha, que l'on laisse avec un bouchon desserré, clairement étiqueté dans la hotte, afin de former les bicouches. Notre laboratoire utilise des chambres bi FCS à deux compartiments, qui présentent l'avantage d'un chauffage intégré. Le système FCS deux repose sur une base en acier inoxydable qui serre un collecteur microfluidique muni d'un joint supérieur de 0,5 millimètre d'épaisseur, ainsi qu'une lame de micro-aqueduc revêtue d'oxyde d'indium-étain pour le chauffage sur une face, et comportant une rainure fluidique sur l'autre face.

Une joint de 0,25 millimètre sans poussière qui définit la hauteur de la chambre d'écoulement et la lame couvre-objet ronde de 40 millimètres nettoyée au piranha sur laquelle le bicouche est formé pour assembler la cellule d'écoulement et former des bicouches planes. Placer le collecteur avec les tubes orientés vers le haut sur une surface plane. Puis placer la joint de 0,5 millimètre avec des trous positionnés au-dessus des tubes fluidiques et s'assurer qu'elle est bien à plat.

Placez délicatement la lame micro-aqueduc avec les canaux fluidiques orientés vers le haut et assurez-vous qu'elle repose à plat, sans exercer aucune pression vers le bas, jusqu'à ce que vous ayez vérifié que les trous de la lame s'alignent correctement avec les tubes microfluidiques. Ensuite, posez le joint sans poussière de 0,25 millimètre d'épaisseur, comportant une ouverture rectangulaire, par-dessus la lame micro-aqueduc de manière à ce que le canal soit aligné avec les canaux fluidiques, en veillant à ce qu'il n'y ait aucun espace d'air important. Déposez jusqu'à cinq gouttes d'une suspension de liposomes d'un microlitre chacune sur la surface de la lame micro-aqueduc, disposées de sorte que la distance entre les centres de chaque goutte soit de 2,5 millimètres. Les cinq gouttes de liposomes peuvent présenter des compositions différentes, mais dans ce cas, nous formerons uniquement deux bicouches : l'une sans lipides chélatants du nickel, et l'autre contenant 10 % de lipides chélatants du nickel.

Une fois ces gouttes en place, posez soigneusement la lame couvre-objet sur la surface d'un seul mouvement et fixez-la rapidement à la base. Les gouttes de liposomes doivent entrer en contact avec la lame couvre-objet. Ce contact ne doit pas être rompu, car les bicouches se sont probablement déjà formées et toute perturbation pourrait entraîner des bicouches défectueuses.

À ce stade, il est important de se rappeler de marquer les positions des bicouches à l’aide de quelques petits points d’encre sur la lame afin de faciliter le positionnement du coverslip sur le microscope. Attendre 20 minutes pour s’assurer que le système a atteint l’équilibre, puis transférer toutes les solutions à l’aide d’une seringue de 20 millilitres reliée à environ 20 centimètres de tubulure souple et à un robinet à trois voies. Un autre orifice du robinet est ensuite connecté à la cellule d’écoulement par un court tronçon de tubulure afin de minimiser le volume mort entre le robinet et la cellule d’écoulement.

Remplissez la seringue avec la solution saline tamponnée hepes contenant du chlorure de magnésium, du chlorure de calcium, du glucose et de l'albumine sérique humaine. Purgez les tubulures et le robinet trois voies afin qu'il n'y ait aucune bulle d'air. Ensuite, reliez ce dispositif aux cellules d'écoulement et faites passer cinq millilitres d'un seul mouvement, tout en surveillant pour vous assurer qu'aucune bulle d'air ne traverse la bicouche.

Vous disposez désormais de vos bicouches pour introduire les protéines marquées par la balise hiss dans la bicouche. Celle-ci doit d'abord être bloquée avec de la caséine et chargée au nickel. Remplissez une seringue d'un millilitre avec la solution d'ions nickel-caséine et connectez-la au port latéral sans emprisonner de bulles d'air.

Après l'injection de la solution, attendez 20 minutes pour permettre un blocage complet. Rincez ensuite la solution de blocage avec du H-B-S-H-S-A à l’aide de la seringue de 20 millilitres. Injectez maintenant 0,5 millilitre de solution H-B-S-H-S-A contenant l’ICAM un et l’IEK marqués polyhis.

Dans cette expérience, l'ICAM-1 est marqué avec le SCI5. Ainsi, les interactions entre LFA-1 et ICAM-1 peuvent être suivies en imagerie par redistribution de l'ICAM-1 dans la bicouche. Laisser 30 minutes pour que la protéine se lie à la bicouche chargée au nickel, pendant que la protéine adhère à la bicouche. Fixer la cellule d'écoulement sur le microscope inversé à l'aide d'un insert personnalisé pour la platine.

Ensuite, connectez l'électronique de chauffage pour permettre au système de s'équilibrer à 37 degrés Celsius. Utilisez les repères faits précédemment pour positionner la cellule d'écoulement de manière à ce que l'objectif soit aligné avec l'une des bicouches, puis utilisez la microscopie par réflexion interférentielle pour localiser le plan focal en mettant au point sur l'image en lumière réfléchie du diaphragme de champ. Enfin, éliminez par lavage l'ICAM-1 non lié présent dans les cellules d'écoulement.

Acquérir des images de fluorescence du bicouche dans le canal ICAM-1 en modes turf M et widefield. Cela permet de confirmer la liaison de l'ICAM-1 sur le bicouche recouvert de nickel par rapport au bicouche sans nickel. La chambre d'écoulement est désormais prête à recevoir les cellules.

Pour cette démonstration, nous utiliserons des cellules T transgéniques pour le récepteur des cellules T de type ND, qui ont été transduites avec un rétrovirus codant pour GFP-ζ-70, lavons les cellules une fois avec du H-B-S-H-S-A, puis incubons les cellules avec un fragment FAB marqué à l’Alexa 568 dirigé contre le récepteur des cellules T afin que nous puissions suivre les micro-amas de TCR. Après 15 minutes, diluez les cellules au 1/10. Cette dilution réduit suffisamment la concentration de l’anticorps H57 pour qu’il n’interfère pas avec l’imagerie de la zone de contact immunologique (turf M), tout en maintenant une saturation du récepteur des cellules T lorsque le fragment FAB initialement lié commence à se dissocier, puis injectez-les dans la chambre d’écoulement.

Nous observons le synapse immunologique en mode turf M à trois couleurs. Cela inclut la formation de l'interaction LFA-1, ICAM-1, la formation d'agrégats de TCR et du C smac, ainsi que la formation durable de micro-amas de TCR, qui recrutent la GFP ZAP-70. Certains de ces résultats sont évidents pendant l'acquisition, tandis que d'autres nécessiteront une analyse post-acquisition pour être pleinement appréciés.

Très bien, nous venons de vous montrer comment utiliser des bicouches planaires supportées pour étudier la synapse immunologique. Il est très important, pour que ces expériences fonctionnent, que les lymphocytes T soient en très bon état et que la solution saline tamponnée PPS ne soit pas utilisée pour une culture prolongée des lymphocytes T. Vous devez donc retirer les cellules de la culture, les placer dans ce milieu et les utiliser très rapidement.

Si vous souhaitez réaliser des expériences à plus long terme, il existe de très bonnes formulations de milieux sans sérum que vous pouvez substituer au tampon salin au he. Cela permettra de maintenir les cellules en vie beaucoup plus longtemps si vous souhaitez effectuer des analyses à des points terminaux prolongés, tels que la production de cytokines ou la prolifération des cellules T. Voilà tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.