Name: Soutenu bicouches planaires pour la formation des synapses immunologiques Etude de et Kinapse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Apprenez à créer des bicouches planaires supportées pour étudier la formation des synapses immunologiques. Cette méthode utilise la microscopie TIRF pour visualiser les interactions moléculaires et les protéines d'adhésion cellulaire.

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1. Préparer les lipides <ol><li> Afin de lier les protéines à la notice supérieure d&#39;un bicouche, nous utilisons Ni 2 + lipides chélateurs, qui ancrent les protéines recombinantes avec des poly-histidine balises. Certains types de cellules peuvent adhérer de manière non spécifique à Ni 2 + revêtement bicouches, mais les cellules T ne sont généralement pas, ce qui rend cette méthode optimale pour l&#39;étude de l&#39;activation des cellules T. </li><li> La solution bicouche lipidique est faite par la préparation d&#39;une solution de 20% Ni 2 + lipides chélateurs et 80% en phosphatidylcholine les montants appropriés dans un tube en verre avec 1-2 ml de chloroforme-méthanol. <ol><li> Evaporer le solvant sous un courant d&#39;azote gazeux dans un cadre chaleureux (30-37 ° C) bain-marie. Cela prend habituellement environ 15 minutes. </li><li> Retirez tout solvant restant sous vide poussé, en utilisant un lyophilisateur pendant 90 minutes. </li></ol></li><li> Dissoudre les lipides dans les 2% de N-octyl-glucoside détergent dans Tris-buffer saline, ce qui crée une solution de détergent mélangé / phospholipides micelles. La concentration de phospholipides final devrait être de 0,4 mM. Pour former des liposomes, dialyser cette solution contre 3 changements de Tris-solution saline pour éliminer les liposomes de détergent et de forme. Nous travaillons habituellement avec des volumes de l&#39;ordre de 1 ml avec 6 mm de diamètre Spectra / Por # 2 avec un tube coupé environ 10 kDa. Nous prenons soin d&#39;exclure toute bulle d&#39;air s lors du serrage de la tuyauterie. Nous généralement stériles filtre cette solution et ne la dialyse dans des conditions propres, sa manipulation avec des gants stérilisés 70% d&#39;éthanol. </li><li> Cette solution doit être limpide. Il est stocké sous gaz argon pour éviter l&#39;oxydation. Si la solution est trouble, puis multi-parois des vésicules ont été générés, et vous devrez recommencer. </li></ol> 2. Déterminer combien d&#39;ICAM-1 et CMH sont déposés sur la bicouche planaire <ol><li> Afin de mettre en place l&#39;expérience, il faut d&#39;abord déterminer combien de ICAM-1 et CMH sont déposés sur une surface donnée de Ni 2 + chélateur bicouche à une concentration donnée de protéines solubles. Pour ce faire, bicouches dépôt le 5 micromètres de diamètre des perles de verre, incuber les perles de verre avec des solutions de protéines dans des conditions qui se rapprochent de celles dans les cellules de flux utilisés pour l&#39;imagerie, et lire la densité de protéine liée par un dosage de débit immunofluorometric. </li><li> Anticorps marqués au FITC avec un nombre connu de fluorescéine par molécule sont utilisés pour détecter les protéines de surface lié. Fluorescéine perles standard sont utilisées pour calibrer les microfluorimeter débit. </li><li> Nous allons créer les conditions qui se rapprochent de ceux de cellules présentatrices d&#39;antigène avec 200 molecules/μm2 d&#39;ICAM-1 et 0,2 à 20 molecules/μm2 de I-Ek-MCC91-103 complexes. </li></ol> 3. Nettoyage de la lamelles de verre pour former bicouches planaires <ol><li> Bicouches planaires se forment spontanément lorsque les liposomes fusionnent pour le verre, mais seulement si le verre est correctement nettoyé. </li><li> Lorsque vous travaillez avec Piranha, nous portons des vêtements protecteurs complets, y compris un tablier acide et lourds, l&#39;acide gantelets résistants. Soigneusement à trier les déchets à partir des déchets organiques et éliminer correctement. </li><li> Pour préparer la solution Piranha acide, ajoutez 75 ml d&#39;acide sulfurique concentré dans un bécher sec et ajouter prudemment 25 ml de peroxyde d&#39;hydrogène à 30%. La solution se réchauffe rapidement jusqu&#39;à plus de 100 ° C. </li><li> Plonger les lamelles sec dans la solution pendant 15 minutes. Retirer de la solution et rincer à l&#39;eau purifiée pour une minute de chaque côté. Sécher les lamelles à l&#39;aide d&#39;une source de vide pour évacuer l&#39;eau purifiée. Laisser la solution Piranha refroidir et ajouter au conteneur de déchets Piranha, qui se retrouve avec le bouchon lâche, bien marqué dans la hotte. Lorsque toutes les liposomes, des lamelles, et les protéines sont préparés, la synapse immunologique est prêt à être formé. </li></ol> 4. Former les bicouches <ol><li> Pour former les bicouches, notre laboratoire utilise Bioptechs FCSII chambres, qui ont les avantages de chauffage intégré. Le système FCSII est sur une base en acier inoxydable qui serre ainsi un collecteur microfluidique avec un joint de 0,5 mm en haut, une diapositive microaqueduct recouvert d&#39;oxyde d&#39;indium-étain pour le chauffage sur une surface, avec rainure fluidiques de l&#39;autre côté, un abri de la poussière de 0,25 mm joint qui définit la hauteur de la chambre d&#39;écoulement et le Piranha nettoyé 40 mm rond lamelle sur laquelle la bicouche est formée. </li><li> Alors que la lamelle, sur laquelle la bicouche est formée, a besoin d&#39;être fortement hydrophile et propre, la diapositive microacqueduct fonctionne mieux si elle est plus hydrophobe. Faire le plus hydrophobe microaqueduct est réalisée par traitement avec HSA 1% pendant 60 minutes à température ambiante, puis lavage à l&#39;eau pure et sécher complètement après ce processus de conditionnement, ainsi que entre les utilisations. Le revêtement de protéines dénaturées laissés par cette procédure permet à 1 pl de suspension de liposomes pour former un rond, hemisphericachute de L qui est&gt; 0,25 mm de haut. </li><li> Pour assembler la cellule de flux et de la forme bicouches planaires, placez le collecteur, avec les tubes dirigés vers le haut, sur une surface plane. Ensuite, placer le 0. 5 mm avec joint trous positionnés sur les tubes fluidique, en s&#39;assurant qu&#39;il est assis à plat. Placez délicatement le côté microaqueduct sur le joint avec les canaux fluidiques vers le haut et assurez-vous qu&#39;il sièges plats sans appliquer aucune pression à la baisse, jusqu&#39;à vérifier que les trous dans la lame d&#39;aligner les tubes microfluidique. Poser la poussière 0,25 mm avec un joint de taille rectangulaire en tête de la glissière microaqueduct sorte que le canal est aligné avec les canaux fluidiques et il n&#39;ya pas des espaces d&#39;air important. </li><li> Placez jusqu&#39;à 5 gouttes x 1 pi de suspension de liposomes à la surface de la lame microaqueduct dans un modèle tel que la distance de centre à centre entre chaque goutte est de 2,5 mm. Le 5 gouttes liposomes peuvent avoir des compositions différentes, mais dans ce cas nous ne pourrons former deux bicouches, l&#39;un sans Ni 2 + + lipides chélateur et un avec 10% de Ni 2 + + lipides chélateurs. </li><li> Une fois ces gouttes sont en place, placer soigneusement la lamelle sur la surface en un seul mouvement. Pince sur la base aussi vite que possible. Les gouttes de liposome devrait prendre contact avec la lamelle. Ce contact ne doit pas être rompu, puisque les bicouches ont probablement déjà formé, toute perturbation peut entraîner des bicouches défectueuses. </li><li> Il est important de se souvenir pour marquer les positions des bicouches avec quelques taches d&#39;encre sur les petites diapositives microacqueduct d&#39;aide au positionnement de la lamelle sur le microscope. Attendre 20 minutes pour s&#39;assurer que le système a équilibré. Transférer toutes les solutions en utilisant une seringue de 20 ml connecté à environ 20 cm de tube flexible et un robinet à 3 voies. Branchez un autre port du robinet à la cellule de flux par une courte longueur de tuyau pour minimiser le volume mort entre le robinet et la cellule de flux. Remplir la seringue avec une solution saline tamponnée HEPES contenant 2 mM de MgCl2, 1 mM CaCl 2, 5 mM de glucose et 1% albumine sérique humaine. </li><li> Premier de la tuyauterie et le robinet donc il n&#39;ya pas de bulles d&#39;air. Connectez-le à des cellules d&#39;écoulement et de pousser à travers 5 ml dans un mouvement tout en regardant pour s&#39;assurer qu&#39;aucune bulle d&#39;air passer au-dessus de la bicouche. Maintenant, vous aurez votre bicouches. </li></ol> Cet article soutient la vidéo &quot;Hunter Gatherer et Retour: Synapses immunologiques et Kinapses comme des variations sur le thème de la locomotion Bouldeur» par <a href="http://arjournals.annualreviews.org/action/doSearch?action=runSearch&amp;type=advanced&amp;result=true&amp;prevSearch=%2Bauthorsfield%3A%28Dustin%2C+Michael+L.%29" target="_blank">Michael L. Dustin</a> , <a href="http://arjournals.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.cellbio.24.110707.175226">Revue annuelle de biologie cellulaire et développementale</a> , tome 24, 2008.

soutenu bicouches planaires pour la formation des synapses immunologiques etude de et kinapse

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

Soutenu bicouches planaires sont des outils puissants qui peuvent être utilisés pour modéliser les interactions moléculaires dans une synapse immunologique. Pour imiter les interactions entre les lymphocytes et les cellules présentatrices d&#39;antigène, nous utilisons Ni2 +-chélateur lipides pour ancrer l&#39;adhésion cellulaire recombinante et de protéines du CMH à la notice supérieure d&#39;un bicouche avec le poly-histidine balises. Bicouches planaires sont générés par la préparation de lipides, de traiter les surfaces de verre où la bicouche vont se former, puis en formant la bicouche dans une chambre spécialisée contenant un flux de cellules où les lymphocytes sera ajouté. Ensuite, les bicouches sont facturés avec Ni et son étiquetées protéines recombinantes sont ajoutés. Enfin, les lymphocytes sont injectés dans la cellule de flux et microscopie TIRF peut être utilisé pour la formation des synapses image et les mécanismes de contrôle que la locomotion des cellules T, les sites de tri des récepteurs, et des sites de dégradation du récepteur.

Soutenu bicouches planaires sont des outils puissants qui peuvent être utilisés pour modéliser les interactions moléculaires dans une synapse immunologique. Ici, nous montrons des méthodes pour l&#39;ancrage des protéines d&#39;adhésion cellulaire connue pour moduler la formation des synapses au feuillet supérieur de la bilyer lipides et de visualiser la formation des synapses en microscopie TIRF.

Soutenu bicouches planaires pour la formation des synapses immunologiques Etude de et Kinapse

Les bicouches planaires supportées sont des outils puissants qui peuvent être utilisés pour modéliser les interactions moléculaires au sein d'une synapse immunologique. Pour imiter les interactions...

Bonjour, je suis Mike Dustin de l'Institut Geral et de la faculté de médecine de l'Université de New York. Aujourd'hui, je vais vous guider à travers la procédure de formation de bicouches planes supportées pour l'étude de la synapse immunologique. Commençons donc.Pour former la bicouche lipidique, nous préparons une solution contenant 20 % de lipide chélatant au nickel et 80 % de phosphatidylcholine, en quantités appropriées, dans un tube en verre avec un à deux millilitres de chloroforme-méthanol. La première étape consiste à évaporer le solvant sous un courant d'azote dans un bain d'eau tiède à 30-37 degrés Celsius. Cette étape prend généralement environ 15 minutes.Ensuite, éliminer tout solvant résiduel sous vide poussé à l'aide d'un lyophilisateur pendant 90 minutes. Puis, dissoudre les lipides dans un tampon salin contenant 2 %N de glucoside d'octyle, afin d'obtenir une concentration finale de 0,4 millimolaire. Cela permet d'obtenir une solution de micelles mixtes de détergent et de phospholipides destinée à former des liposomes.Vous dialysez cette solution contre trois changements de solution saline au tris afin d'éliminer le détergent et former des liposomes. Nous travaillons habituellement avec des volumes de l'ordre d'un millilitre, en utilisant un tube de six millimètres de diamètre et de coupure d'environ 10 kilodaltons, en prenant soin d'écarter toute bulle d'air lors du serrage du tube. Nous filtrons stérilement cette solution et effectuons la dialyse dans des conditions aseptiques, en la manipulant avec des gants stérilisés à l'éthanol à 70 %.Cette solution doit être parfaitement claire et est conservée sous atmosphère d'argon pour éviter l'oxydation. Si la solution est trouble, vous avez généré des vésicules multicouches et devez recommencer. Afin de préparer l'expérience, nous devons d'abord déterminer la quantité d'ICAM-1 et de CMH déposée sur une surface donnée d'une bicouche chélatant le nickel, pour une concentration donnée de protéine soluble.Pour ce faire, nous déposons des bicouches sur des billes de verre d'un diamètre de cinq micromètres. Incubez les billes de verre avec des solutions de protéines dans des conditions proches de celles utilisées dans les cellules d'écoulement pour l'imagerie, puis mesurez la densité de protéine liée à l'aide d'un dosage immuno-fluorométrique en flux. Des anticorps marqués par FSI, portant un nombre connu de fluorescéine par molécule, sont utilisés pour détecter les protéines fixées à la surface, et des billes étalons de fluorescéine servent à étalonner le micro-fluorimètre en flux.Nous allons établir des conditions qui approchent celles des cellules présentatrices d'antigènes avec 200 molécules par micromètre carré d'ICAM-1 et de 0,2 à 20 molécules par micromètre carré de I-E-K-M-C-C 91 1 0 3. Des bicouches planes complexes se forment spontanément lorsque les liposomes fusionnent avec du verre, mais uniquement si celui-ci est correctement nettoyé pour devenir un verre propre. Nous utilisons une solution de piranha, un mélange fraîchement préparé d'acide sulfurique et de peroxyde d'hydrogène à 30 %, qui détruit tous les matériaux organiques et rend en outre la surface du verre très hydrophile.Lorsque l'on manipule le mélange piranha, nous portons des vêtements de protection complets, y compris un tablier antiacide et de gros gants résistants aux acides. Les déchets doivent être soigneusement séparés des déchets organiques et éliminés correctement. Pour préparer la solution acide piranha, ajoutez 75 millilitres d'acide sulfurique concentré dans un bécher sec, puis ajoutez soigneusement 25 millilitres de peroxyde d'hydrogène à 30 %.La solution s'échauffe rapidement à plus de 100 degrés Celsius ; plongez alors les lamelles sèches dans la solution pendant 15 minutes. Après cette incubation dans le mélange piranha, immergez les lamelles dans de l'eau purifiée, puis rincez-les pendant une minute de chaque côté. Séchez ensuite les lamelles à l'aide d'une source sous vide pour éliminer l'eau purifiée.Laisser refroidir la solution de piranha, puis l'ajouter au contenant de déchets de piranha, que l'on laisse avec un bouchon desserré, clairement étiqueté dans la hotte, afin de former les bicouches. Notre laboratoire utilise des chambres bi FCS à deux compartiments, qui présentent l'avantage d'un chauffage intégré. Le système FCS deux repose sur une base en acier inoxydable qui serre un collecteur microfluidique muni d'un joint supérieur de 0,5 millimètre d'épaisseur, ainsi qu'une lame de micro-aqueduc revêtue d'oxyde d'indium-étain pour le chauffage sur une face, et comportant une rainure fluidique sur l'autre face.Une joint de 0,25 millimètre sans poussière qui définit la hauteur de la chambre d'écoulement et la lame couvre-objet ronde de 40 millimètres nettoyée au piranha sur laquelle le bicouche est formé pour assembler la cellule d'écoulement et former des bicouches planes. Placer le collecteur avec les tubes orientés vers le haut sur une surface plane. Puis placer la joint de 0,5 millimètre avec des trous positionnés au-dessus des tubes fluidiques et s'assurer qu'elle est bien à plat.Placez délicatement la lame micro-aqueduc avec les canaux fluidiques orientés vers le haut et assurez-vous qu'elle repose à plat, sans exercer aucune pression vers le bas, jusqu'à ce que vous ayez vérifié que les trous de la lame s'alignent correctement avec les tubes microfluidiques. Ensuite, posez le joint sans poussière de 0,25 millimètre d'épaisseur, comportant une ouverture rectangulaire, par-dessus la lame micro-aqueduc de manière à ce que le canal soit aligné avec les canaux fluidiques, en veillant à ce qu'il n'y ait aucun espace d'air important. Déposez jusqu'à cinq gouttes d'une suspension de liposomes d'un microlitre chacune sur la surface de la lame micro-aqueduc, disposées de sorte que la distance entre les centres de chaque goutte soit de 2,5 millimètres. Les cinq gouttes de liposomes peuvent présenter des compositions différentes, mais dans ce cas, nous formerons uniquement deux bicouches : l'une sans lipides chélatants du nickel, et l'autre contenant 10 % de lipides chélatants du nickel.Une fois ces gouttes en place, posez soigneusement la lame couvre-objet sur la surface d'un seul mouvement et fixez-la rapidement à la base. Les gouttes de liposomes doivent entrer en contact avec la lame couvre-objet. Ce contact ne doit pas être rompu, car les bicouches se sont probablement déjà formées et toute perturbation pourrait entraîner des bicouches défectueuses.À ce stade, il est important de se rappeler de marquer les positions des bicouches à l’aide de quelques petits points d’encre sur la lame afin de faciliter le positionnement du coverslip sur le microscope. Attendre 20 minutes pour s’assurer que le système a atteint l’équilibre, puis transférer toutes les solutions à l’aide d’une seringue de 20 millilitres reliée à environ 20 centimètres de tubulure souple et à un robinet à trois voies. Un autre orifice du robinet est ensuite connecté à la cellule d’écoulement par un court tronçon de tubulure afin de minimiser le volume mort entre le robinet et la cellule d’écoulement.Remplissez la seringue avec la solution saline tamponnée hepes contenant du chlorure de magnésium, du chlorure de calcium, du glucose et de l'albumine sérique humaine. Purgez les tubulures et le robinet trois voies afin qu'il n'y ait aucune bulle d'air. Ensuite, reliez ce dispositif aux cellules d'écoulement et faites passer cinq millilitres d'un seul mouvement, tout en surveillant pour vous assurer qu'aucune bulle d'air ne traverse la bicouche.Vous disposez désormais de vos bicouches pour introduire les protéines marquées par la balise hiss dans la bicouche. Celle-ci doit d'abord être bloquée avec de la caséine et chargée au nickel. Remplissez une seringue d'un millilitre avec la solution d'ions nickel-caséine et connectez-la au port latéral sans emprisonner de bulles d'air.Après l'injection de la solution, attendez 20 minutes pour permettre un blocage complet. Rincez ensuite la solution de blocage avec du H-B-S-H-S-A à l’aide de la seringue de 20 millilitres. Injectez maintenant 0,5 millilitre de solution H-B-S-H-S-A contenant l’ICAM un et l’IEK marqués polyhis.Dans cette expérience, l'ICAM-1 est marqué avec le SCI5. Ainsi, les interactions entre LFA-1 et ICAM-1 peuvent être suivies en imagerie par redistribution de l'ICAM-1 dans la bicouche. Laisser 30 minutes pour que la protéine se lie à la bicouche chargée au nickel, pendant que la protéine adhère à la bicouche. Fixer la cellule d'écoulement sur le microscope inversé à l'aide d'un insert personnalisé pour la platine.Ensuite, connectez l'électronique de chauffage pour permettre au système de s'équilibrer à 37 degrés Celsius. Utilisez les repères faits précédemment pour positionner la cellule d'écoulement de manière à ce que l'objectif soit aligné avec l'une des bicouches, puis utilisez la microscopie par réflexion interférentielle pour localiser le plan focal en mettant au point sur l'image en lumière réfléchie du diaphragme de champ. Enfin, éliminez par lavage l'ICAM-1 non lié présent dans les cellules d'écoulement.Acquérir des images de fluorescence du bicouche dans le canal ICAM-1 en modes turf M et widefield. Cela permet de confirmer la liaison de l'ICAM-1 sur le bicouche recouvert de nickel par rapport au bicouche sans nickel. La chambre d'écoulement est désormais prête à recevoir les cellules.Pour cette démonstration, nous utiliserons des cellules T transgéniques pour le récepteur des cellules T de type ND, qui ont été transduites avec un rétrovirus codant pour GFP-ζ-70, lavons les cellules une fois avec du H-B-S-H-S-A, puis incubons les cellules avec un fragment FAB marqué à l’Alexa 568 dirigé contre le récepteur des cellules T afin que nous puissions suivre les micro-amas de TCR. Après 15 minutes, diluez les cellules au 1/10. Cette dilution réduit suffisamment la concentration de l’anticorps H57 pour qu’il n’interfère pas avec l’imagerie de la zone de contact immunologique (turf M), tout en maintenant une saturation du récepteur des cellules T lorsque le fragment FAB initialement lié commence à se dissocier, puis injectez-les dans la chambre d’écoulement.Nous observons le synapse immunologique en mode turf M à trois couleurs. Cela inclut la formation de l'interaction LFA-1, ICAM-1, la formation d'agrégats de TCR et du C smac, ainsi que la formation durable de micro-amas de TCR, qui recrutent la GFP ZAP-70. Certains de ces résultats sont évidents pendant l'acquisition, tandis que d'autres nécessiteront une analyse post-acquisition pour être pleinement appréciés.Très bien, nous venons de vous montrer comment utiliser des bicouches planaires supportées pour étudier la synapse immunologique. Il est très important, pour que ces expériences fonctionnent, que les lymphocytes T soient en très bon état et que la solution saline tamponnée PPS ne soit pas utilisée pour une culture prolongée des lymphocytes T. Vous devez donc retirer les cellules de la culture, les placer dans ce milieu et les utiliser très rapidement.Si vous souhaitez réaliser des expériences à plus long terme, il existe de très bonnes formulations de milieux sans sérum que vous pouvez substituer au tampon salin au he. Cela permettra de maintenir les cellules en vie beaucoup plus longtemps si vous souhaitez effectuer des analyses à des points terminaux prolongés, tels que la production de cytokines ou la prolifération des cellules T. Voilà tout.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Cet article décrit une méthode pour visualiser la formation d'une synapse enveloppe du VIH-1 induite par le verre virologique soutenu bicouches planaires par fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) microscopie. La méthode peut également être combiné avec immunofluorescence pour détecter l'activation et la redistribution des molécules de signalisation qui se produisent pendant le VIH-1 induite par l'enveloppe formation de la synapse virologique.

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Apprenez à créer des bicouches planaires supportées pour étudier la formation des synapses immunologiques. Cette méthode utilise la microscopie TIRF pour visualiser les interactions moléculaires et les protéines d'adhésion cellulaire.

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