Soutenu bicouches planaires pour la formation des synapses immunologiques Etude de et Kinapse

Bonjour, je suis Mike Dustin de l’Institut Geral et de la faculté de médecine de l’Université de New York. Aujourd’hui, je vais vous expliquer la procédure de formation d’un Biolay planaire de soutien pour l’étude de la synapse immunologique. Alors commençons.

Pour fabriquer la bicouche lipidique, nous préparons une solution de 20 % de nickel, de lipide chélateur et de 80 % de phosphatidylcholine dans les quantités appropriées dans un tube de verre avec un à deux millilitres de chloroforme méthanol. La première étape consiste à évaporer le solvant sous un courant d’azote gazeux dans un bain d’eau chaude de 30 à 37 degrés Celsius. Cela prend généralement environ 15 minutes.

Ensuite, retirez tout solvant restant sous vide poussé à l’aide d’un lyophilisateur pendant 90 minutes. Ensuite, dissolvez les lipides dans un détergent glucocide octal à 2 % de glucose octal jusqu’à une concentration finale de 0,4 millimolaire. Cela crée une solution de mycellules phospholipidiques de détergent mixte pour former des liposomes.

Vous dialysez cette solution contre trois changements de tris salin pour éliminer le détergent et former des liposomes. Nous travaillons généralement avec des volumes de l’ordre d’un millilitre avec des tubes de six millimètres de diamètre avec une coupure d’environ 10 kilodaltons et veillons à exclure toute bulle d’air lors du serrage du tube. Nous filtrons stérilement cette solution et effectuons la dialyse dans des conditions propres et la manipulons à l’aide de gants stérilisés à 70 % d’éthanol.

Cette solution doit être limpide et est stockée sous le gaz Argonne pour éviter l’oxydation. Si la solution est trouble, vous avez généré des vésicules à plusieurs parois et devez recommencer. Afin de présenter l’expérience, nous devons d’abord déterminer quelle quantité d’ICAM one et de CMH est déposée sur une surface donnée de bicouche chélatrice de nickel à une concentration donnée de protéine soluble.

Pour ce faire, nous déposons des bicouches sur des vitesses de verre de cinq micromètres de diamètre. Incuber les billes de verre avec des solutions protéiques dans des conditions qui se rapprochent de celles des cellules d’écoulement utilisées pour l’imagerie, puis lire la densité de la protéine liée à l’aide d’un test immunofluorométrique en flux. Des anticorps marqués FSI avec un nombre connu de fluorescéine par molécule sont utilisés pour détecter les protéines liées à la surface et des billes standard de fluorescéine sont utilisées pour calibrer le microfluorimètre à flux.

Nous établirons des conditions qui se rapprochent de celles des cellules présentatrices d’antigène avec 200 molécules par micromètre carré d’ICAM un et 0,2 à 20 molécules par carré. Micromètre de I-E-K-M-C-C 91 1 0 3, des bicouches planes complexes se forment spontanément lorsque les liposomes fusionnent avec le verre, mais seulement s’il est correctement nettoyé pour nettoyer le verre. Nous utilisons une solution d’acide piana, un mélange fraîchement préparé d’acide sulfurique et de peroxyde d’hydrogène à 30 %, qui détruit toutes les matières organiques et laisse également la surface du verre très hydrophile.

Lorsque nous travaillons avec des piranhas, nous portons des vêtements de protection complets, y compris un tablier acide et des gantelets résistants aux acides lourds. Les déchets doivent être soigneusement séparés des déchets organiques et éliminés correctement. Pour préparer la solution acide de piranha, ajoutez 75 millilitres d’acide sulfurique concentré dans un bécher sec, puis ajoutez soigneusement 25 millilitres de peroxyde d’hydrogène à 30 %.

La solution chauffe rapidement jusqu’à plus de 100 degrés Celsius, puis plongez les lamelles sèches dans la solution pendant 15 minutes. Suite à cette incubation chez le piranha, trempez les lamelles de couverture dans de l’eau purifiée puis rincez-les une minute de chaque côté. Séchez ensuite les lamelles à l’aide d’une source d’aspiration pour évacuer l’eau purifiée.

Laissez refroidir la solution de piranha et ajoutez-la dans le récipient à déchets de piranha, qui est laissé avec un capuchon lâche, bien marqué dans la hotte pour former les bicouches. Notre laboratoire utilise deux chambres bi FCS, qui présentent les avantages d’un chauffage intégré. Le système FCS two est sur une base en acier inoxydable qui relie un collecteur microfluidique avec un joint supérieur de 0,5 millimètre, une glissière de micro-aqueduc recouverte d’oxyde d’indium et d’étain pour le chauffage sur une surface et avec une rainure fluidique de l’autre côté.

Un joint d’étanchéité de 0,25 millimètre sans poussière qui définit la hauteur de la chambre d’écoulement et la lamelle ronde de 40 millimètres nettoyée par le piranha sur laquelle la bicouche est formée pour assembler la cellule d’écoulement et former des bicouches planes. Placez le collecteur avec les tubes dirigés vers le haut sur une surface plane. Placez ensuite le joint de 0,5 millimètre avec des trous positionnés sur les tubes fluidiques et assurez-vous qu’il est bien à plat.

Placez doucement la glissière du micro-aqueduc avec les canaux fluidiques vers le haut et assurez-vous qu’elle repose à plat sans appliquer de pression vers le bas jusqu’à ce que vous vérifiiez que les trous de la glissière alignent les tubes microfluidiques. Ensuite, posez le joint sans poussière de 0,25 millimètre avec une découpe rectangulaire sur le dessus de la glissière du micro-aqueduc de sorte que le canal soit aligné avec les canaux fluidiques et qu’il n’y ait pas d’espaces d’air majeurs, placez jusqu’à cinq gouttes d’un microlitre de suspension de liposomes sur la surface de la glissière du micro-aqueduc de manière à ce que la distance centre à centre entre chaque goutte soit de 2,5 millimètres. Les cinq gouttes de liposomes peuvent avoir des compositions différentes, mais dans ce cas, nous ne formerons que deux bicouches, l’une sans lipides chélateurs au nickel et l’autre avec 10 % de lipides chélateurs au nickel.

Une fois ces gouttes en place, placez soigneusement le couvercle sur la surface en un seul mouvement, fixez-le sur la base le plus rapidement possible. Les gouttes de liposomes doivent entrer en contact avec la lamelle. Ce contact ne doit pas être rompu car les bicouches se sont probablement déjà formées et toute perturbation peut entraîner des bicouches défectueuses.

À ce stade, il est important de ne pas oublier de marquer les positions des bicouches avec quelques petites taches d’encre sur la lame pour faciliter le positionnement de la lamelle sur le microscope. Attendez 20 minutes pour vous assurer que le système a équilibré le transfert de toutes les solutions à l’aide d’une seringue de 20 millilitres reliée à environ 20 centimètres de tube flexible et à un robinet d’arrêt à trois voies. Un autre orifice du robinet d’arrêt est ensuite relié à la cellule d’écoulement par une courte longueur de tube afin de minimiser le volume mort entre le robinet d’arrêt et la cellule d’écoulement.

Remplissez la seringue d’une solution saline tamponnée HEIS contenant du chlorure de magnésium, du chlorure de calcium, du glucose et de l’albumine sérique humaine. Amorcez le tube et arrêtez le robinet pour qu’il n’y ait pas de bulles d’air. Ensuite, connectez-le aux cellules d’écoulement et poussez à travers cinq millilitres en un seul mouvement tout en veillant à ce qu’aucune bulle d’air ne passe sur la bicouche.

Vous aurez maintenant vos bicouches pour introduire les protéines marquées par le sifflement dans la bicouche. Il doit d’abord être bouché avec du casen et chargé de nickel. Remplissez une seringue d’un millilitre avec la solution d’ions nickel casen et connectez-la à l’orifice latéral sans piéger les bulles d’air.

Après avoir injecté la solution, attendez 20 minutes pour permettre un blocage complet. Ensuite, lavez la solution de blocage avec H-B-S-H-S-A à partir de la seringue de 20 millilitres. Injectez maintenant 0,5 millilitre de solution H-B-S-H-S-A contenant les polyhis marqués ICAM one et IEK.

Dans cette expérience, l’ICAM one est étiqueté avec SCI cinq. Ainsi, les interactions LFA one ICAM one peuvent être suivies d’une imagerie, le réarrangement ICAM one dans la bicouche permet à la protéine de se lier pendant 30 minutes à la bicouche chargée de nickel pendant que la protéine adhère à la bicouche. Fixez la cellule d’écoulement au microscope inversé à l’aide d’un insert de platine personnalisé.

Connectez ensuite l’électronique de chauffage pour permettre au système de s’équilibrer à 37 degrés Celsius. Utilisez les marques faites précédemment pour positionner la cellule d’écoulement de manière à ce que l’objectif soit aligné avec l’une des bicouches et utilisez la microscopie à réflexion interférentielle pour localiser le plan focal en faisant la mise au point sur l’image de lumière réfléchie du diaphragme de champ. Enfin, lavez l’ICAM non lié des cellules d’écoulement.

Acquérez des images de fluorescence de la bicouche dans l’ICAM à un canal en mode turf M et widefield. Il s’agit de confirmer la liaison ICAM one sur la bicouche recouverte de nickel par rapport à la bicouche sans nickel. La cellule d’écoulement est maintenant prête à recevoir des cellules.

Pour cette démonstration, nous utiliserons des cellules T transgéniques à récepteur de cellules T ND qui ont été transduites avec un revêtement ENC de rétrovirus GFPs P zap 70, laverons les cellules une fois avec H-B-S-H-S-A, puis incuberons les cellules avec un FAB marqué Alexa 5 68 vers le récepteur de cellules T afin que nous puissions suivre les micro-amas TCR. Après 15 minutes, diluez les cellules un à 10. Cela dilue suffisamment l’anticorps H 57 pour qu’il n’interfère pas avec l’imagerie du gazon M, mais maintient la saturation du récepteur des lymphocytes T lorsque le fab initialement lié commence à se dissocier, puis les injecte dans la cellule d’écoulement.

Nous imaginons la synapse immunologique en mode M à trois couleurs. Cela comprend la formation de l’interaction LFA one, ICAM one, la formation des clusters TCR et du C smac et la formation soutenue de micro-clusters TCR, qui recrutent GFP ZAP 70. Certains de ces résultats sont évidents lors de l’acquisition, tandis que d’autres nécessiteront une analyse post-traitement pour être pleinement appréciés.

D’accord, nous venons de vous montrer comment utiliser des bicouches planaires prises en charge pour étudier la synapse immunologique. Il est très important pour que ces expériences fonctionnent que les lymphocytes T soient en très bon état et que la solution saline tamponnée au PPS ne soit pas très adaptée à la culture à long terme des lymphocytes T. Vous voulez donc retirer les cellules de la culture, les mettre dans ce milieu, puis les utiliser très rapidement.

Si vous souhaitez faire des expériences à plus long terme, il existe de très bonnes formulations de milieux sans sérum que vous pouvez remplacer par la solution saline tamponnée en morceaux. Cela maintiendra les cellules en vie beaucoup plus longtemps si vous voulez atteindre un critère d’évaluation plus long, comme la production de cytokines ou la prolifération des cellules T. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.