32.8: עקרונות כרומטוגרפיית עמודות

טכניקת הכרומטוגרפיה הומצאה לראשונה בשנת 1901 על ידי מייקל ס. צווט, בוטנאי רוסי, כדי להפריד פיגמנטים צמחיים באמצעות ממיסים אורגניים. יתר על כן, בשנת 1941, ארצ'ר ג'ון פורטר מרטין ו-R.L.M. Synge שינו את הטכניקה על ידי אריזת סיליקה ג'ל לתוך עמודה. לאחר מכן הופרדה תערובת של חומצות אמינו על העמודה הדחוסה תוך שימוש בתערובת כלורופורם ומים כשלב הנייד. זה היה הדיווח הראשון על כרומטוגרפיית עמודות. כיום, כרומטוגרפיית עמודות היא טכניקה בשימוש נרחב להפרדת סוגים שונים של תרכובות מתערובת דגימה.

גורמים המשפיעים על הפרדה יעילה של חלבונים

פרמטרים שונים כמו חומר העמודה, אריזה ותנאים תפעוליים כגון קצב זרימה וטמפרטורה קובעים את יעילות ההפרדה על ידי כרומטוגרפיית עמודות.

הבחירה בחומר העמודה או המטריקס קובעת את מידת האינטראקציה עם המדגם. חומר המטריקס חייב להיות ארוז בצורה הדוקה ואחידה בעמודה. בועות אוויר, פסולת, חלקיקים גדולים ומשקעים מפריעים לזרימה האחידה של הממס דרך העמודה, ומשפיעים על יעילות ההפרדה שלה. העמודה צריכה להיות גם נקיה מחלקיקים.

הדגימה המוזרקת לעמוד צריכה להיות שקופה וללא אגרגטים שעלולים לסתום את העמוד, להפריע לזרימת הממס. קצב הזרימה של הממס משפיע גם על ההפרדה. קצב זרימה גבוה מאוד או נמוך מאוד של ממסים מביא להפרדה לא יעילה של תרכובות ותכשירים לא טהורים. שיעורים גבוהים מאוד עשויים גם להפריע לאריזת העמודה, ולהשפיע על יעילות התהליך. בנוסף, הרכב חיץ האלוציה הוא גם גורם חשוב. הוא צריך להיות לא קורוזיבי ותואם לדגימה וגם לחומר העמודה כדי למנוע משקעים או פירוק באתרו.

פרמטר תפעולי נוסף, טמפרטורה, ממלא גם הוא תפקיד חשוב בתהליך. הוא קובע את היציבות של המדגם, חומר העמודה ומאגר הממס. כמו כן, טמפרטורה קבועה לאורך העמודה מפרידה ביעילות תרכובות. לאחר השלמת תהליך ההפרדה, יש לשטוף את העמודות ביסודיות על ידי העברת ממס מתאים שוב ושוב כדי למנוע זיהום דגימה בהרצות נוספות. מדי פעם, הממס מועבר בעמודה בכיוון ההפוך כדי להסיר כל חומר סתום.

מגבלות

למרות טכניקה בשימוש נרחב, לשיטה עדיין יש כמה מגבלות. זוהי שיטה שלוקחת זמן רב שכן קצבי הזרימה צריכים להיות איטיים יותר לרזולוציה טובה יותר של התרכובות. כמו כן, כמויות גדולות של ממיסים טהורים במיוחד הנדרשים בשלב הנייד מייקרים את התהליך. זה גם מעלה את עלות ההרחבה כאשר יש צורך בתפוקות גבוהות יותר של תרכובות טהורות.