32.8: עקרונות כרומטוגרפיית טורים

טכניקת הכרומטוגרפיה הומצאה לראשונה בשנת 1901 על ידי מיכאל ס. צווט, בוטנאי רוסי, כדי להפריד פיגמנטים צמחיים באמצעות ממיסים אורגניים. יתר על כן, בשנת 1941, ארצ'ר ג'ון פורטר מרטין ו R. L. M. Synge שינו את הטכניקה על ידי אריזת ג'ל סיליקה לתוך עמוד. לאחר מכן הופרדו תערובת של חומצות אמינו על העמוד הארוז באמצעות כלורופורם ותערובת מים כשלב הנייד. היה זה הדו"ח הראשון על כרומטוגרפיית טורים. כיום, כרומטוגרפיית עמודות היא טכניקה נפוצה להפרדת סוגים שונים של תרכובות מתערובת דגימה.

גורמים המשפיעים על הפרדה יעילה של חלבונים

פרמטרים שונים כמו חומר עמודה, אריזה ותנאי תפעול כגון קצבי זרימה וטמפרטורה קובעים את יעילות ההפרדה לפי כרומטוגרפיית עמודות.

בחירת חומר עמודה או מטריצה קובעת את מידת האינטראקציה עם המדגם. חומר המטריצה חייב להיות ארוז בצורה הדוקה ואחידה בעמודה. בועות אוויר, פסולת, חלקיקים גדולים ומשקעים מפריעים לזרימה אחידה של הממס דרך העמודה, ומשפיעים על יעילות ההפרדה שלו. הטור צריך להיות גם נקי מחומר חלקיקי.

הדגימה המוזרקת לעמודה צריכה להיות ברורה ונטולת אגרגטים שעלולים לסתום את העמודה, ולהפריע לזרימת הממס. קצב הזרימה של הממס משפיע גם על ההפרדה. ספיקות גבוהות מאוד או נמוכות מאוד של ממסים גורמות להפרדה לא יעילה של תרכובות ותכשירים לא טהורים. תעריפים גבוהים מאוד עלולים גם להפריע לאריזת העמודות, ולהשפיע על יעילות התהליך. בנוסף, הרכב חיץ elution הוא גם גורם חשוב. זה צריך להיות לא קורוזיבי ותואם את המדגם וגם את חומר העמודה כדי למנוע משקעים באתרו או המסה.

פרמטר תפעולי נוסף, טמפרטורה, גם משחק תפקיד חשוב בתהליך. הוא מחליט על יציבות הדגימה, חומר העמודה ומאגר הממס. כמו כן, טמפרטורה קבועה לאורך כל העמודה פותרת ביעילות תרכובות. לאחר השלמת תהליך ההפרדה, יש לשטוף היטב את העמודים על ידי העברת ממס מתאים שוב ושוב כדי למנוע זיהום דגימה בריצות נוספות. מדי פעם, הממס מועבר בטור בכיוון ההפוך כדי להסיר כל חומר סתום.

מגבלות

למרות טכניקה נפוצה מאוד, השיטה עדיין יש כמה מגבלות. זוהי שיטה גוזלת זמן רב מכיוון שקצבי הזרימה צריכים להיות איטיים יותר לרזולוציה טובה יותר של התרכובות. כמו כן, כמויות גדולות של ממסים טהורים מאוד הנדרשים בשלב הנייד הופכים את התהליך ליקר. זה גם מעלה את עלות ההרחבה כאשר יש צורך בתפוקות גבוהות יותר של תרכובות טהורות.

כרומטוגרפיית עמודים היא טכניקה ביוכימית המשמשת להפרדת תרכובות בהתבסס על תכונותיהן הפיזיקליות והכימיות.

יש לו שני מרכיבים עיקריים - הפאזה המוצקה הנייחת או המטריצה והפאזה הניידת הנוזלית או הממס.

עמודת המטריצה עמוסה בדגימה, כגון תערובת חלבונים. לאחר מכן משתמשים בממס כדי להעביר את הדגימה דרך העמודה.

בתוך העמודה, המטריצה פועלת כרשת מולקולרית המסננת את החלבונים על פי גודלם או האינטראקציה שלהם עם המטריצה. החלבונים הגדולים נוטים לנוע מהר יותר מהחלבונים הקטנים יותר, וכתוצאה מכך נוצרת הפרדה מבוססת גודל.

בנוסף, חלבונים בדגימה עשויים לקיים אינטראקציה עם המטריצה. אינטראקציות חלשות מאפשרות לחלבונים לעבור במהירות, בעוד אינטראקציות חזקות שומרות על חלבונים בתוך העמודה.

שינוי הדרגתי ב-pH או בחוזק היוני של הממס משנה את יחסי הגומלין של החלבונים עם המטריצה ומסייע לפלוט חלבונים לשברים נפרדים.