Mutagenesis האתר בבימויו של פלסמידים כולה היא דרך פשוטה ליצור וריאציות שונות במקצת של הפלסמיד המקורי. כאן אנו מדגימים דרך יעילה קל עלות להציג החלפות בסיס לתוך ריאגנטים באמצעות פלסמיד רגיל.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
Mutagenesis האתר בבימויו של פלסמידים כולה היא דרך פשוטה ליצור וריאציות שונות במקצת של הפלסמיד המקורי. באמצעות שיטה זו הגן היעד משובטים ניתן לשנות על ידי מחיקה החלפה, או החדרה של כמה בסיסים ישירות לתוך פלסמיד. זה עובד פשוט על ידי הגברה פלסמיד שלם, בתגובה PCR מבוססי הלא thermocycling. במהלך התגובה primers מוטגניות, נושאים את המוטציה הרצויה, משולבים פלסמיד מסונתז החדש. זה וידאו של מורה לנו להראות דרך יעילה קל עלות להציג החלפות בסיס לתוך פלסמיד. פרוטוקול עובדת עם חומרים כימיים סטנדרטיים אינה תלויה ערכות מסחריות, אשר לעתים קרובות הן יקרות מאוד. יישום פרוטוקול זה יכול להפחית את העלות הכוללת של כתגובה שמינית ממה שזה עולה באמצעות כמה ערכות מסחריות. בסרטון הזה אנחנו גם להגיב על השלבים הקריטיים בתהליך ולתת הוראות מפורטות כיצד לתכנן את primers מוטגניות.
פרוטוקול
עקרון השיטה:
האתר מכוון mutagenesis של פלסמידים שלם הסביר זה וידאו היא שיטה mutagenesis אשר מאפשר לך לשנות את הגן היעד משובטים על ידי מחיקה החלפה, או החדרה של כמה בסיסים ישירות לתוך פלסמיד. זה עובד על ידי הגברה פלסמיד שלם, בתגובה PCR מבוססי הלא thermocycling. במהלך התגובה primers מוטגניות, נושאים את המוטציה הרצויה בצורה של חוסר התאמה של הפלסמיד המקורי, משולבים פלסמיד מסונתז החדש. לאחר הסרת של הפלסמיד המקורי מן התגובה פלסמיד מוטציה מקבל להפוך E. coli. השלבים הבאים הם לצורך הקרנה בלבד, כי יעילות מוטציה של שיטה זו הוא לא 100%. ההליך כולו לוקח שלושה ימים, א....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Mutagenesis האתר מכוון הוא mutagenesis, שיטה אשר מספק דרך מהירה מוטציות הגן נישא על ידי פלסמיד. תגובה כולו יכול להיעשות ביום אחד בלבד. באמצעות שיטה זו, היא תצטרך רק זוג primers חינם נושאת את המוטציות הרצוי והגהה פולימראז כגון פולימראז-Pfu. הפלסמיד מסונתז החדש ניתן להפריד את הפלסמיד ההורים על ידי לעכל את התגובה עם DpnI האנזים הגבלה. אנזים זה מעכל רק את ה-DNA מפוגל. לכן רק פלסמיד מסונתז החדש ניתן להפוך. במדריך זה אנו הפגינו ביצוע mutagenesis האתר מכוון באמצעות ערכת mutagenesis תוצרת.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Pfu polymerase (רקומביננטי או טבעי) | Fermentas | EP0571 or EP0501 | |
| תערובת dNTP 10 mM | Fermentas | R0191 | |
| DpnI או DpnI Fast digest | Fermentas | ER1701 | |
| פריימרים | Invitrogen | מנוקחים (desalted) |
מקורות
- Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. QuikChange site-directed mutagenesis. Strategies. 9, 3-4 (1996).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
