הדמיה תא חי היא של כלי מסוים כאשר לומדים את הדינמיקה של סחר אברון. כאן אנו מתארים פרוטוקול הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית בנוירונים בתרבית שימוש רחב בתחום מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פרוטוקול זה הוא גמיש ניתן להתאים האברונים תמונה אחרים כגון המיטוכונדריה, endosomes, ואת peroxisomes.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית בתוך ראשי נוירונים בהיפוקמפוס Cultured
במאמר זה
הודעת תיקון
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
סיכום
תקציר
התבוננות ואפיון תהליכים תאיים דינמי יכולה להניב מידע חשוב על פעילות הסלולר שלא ניתן שנרכשו תמונות סטטיות. בדיקות ניאון ויטל, חלבון פלואורסצנטי ירוק במיוחד (GFP) חוללו מהפכה בביולוגיה של התא הנובע היכולת לתייג תאים תאיים מסוימים ומבנים הסלולר. כך, למשל, הדמיה חיה של ה-GFP (וגירסאות ספקטרלי שלה) מפלצות אפשרו לניתוח דינמי של cytoskeleton, תחבורה אברון, ואת הדינמיקה קרום שפע של אורגניזמים סוגי תאים [1-3]. למרות הדמיה חיים הפך להיות שכיח, גישה זו עדיין מציבה אתגרים טכניים רבים, בעיקר נוירונים בתרבית ראשונית. אתגר אחד הוא ביטוי של GFP-tagged חלבונים שלאחר mitotic נוירונים, והשני הוא היכולת ללכוד תמונות פלורסנט תוך מזעור phototoxicity, photobleaching, ושמירה על בריאות התא הכללי. כאן אנו מספקים פרוטוקול מתאר שיטה השומנים מבוסס transfection כי התשואות transfection שיעור נמוך יחסית (~ 0.5%), אולם הוא אידיאלי עבור הדמיה של נוירונים מקוטב במלואו. שיעור נמוך transfection חיונית כל כך אקסונים יחיד דנדריטים ניתן לאפיין את האוריינטציה שלהם אל גוף התא כדי לאשר את הכיווניות של תחבורה, כלומר האנטרוגרד נ מדרדר. הגישה שלנו הדמיה GFP להביע נוירונים מסתמך על מיקרוסקופ רחב בתחום תקן פלורסנט ומצויד במצלמה CCD, לכידת תמונה תוכנה, וחדר הדמיה מחומם. יש לנו הדמיה מגוון רחב של אברונים או מבנים, למשל, צפוף ליבות שלפוחית, המיטוכונדריה, חרוטים צמיחה, אקטין ללא אופטיקה מיוחד או דרישות עירור אחר מאשר מקור אור ניאון. בנוסף, spectrally-ברורים, חלבונים שכותרתו fluorescently, למשל, ה-GFP ו-dsRed מתויג חלבונים, יכול להיות בו זמנית ליד דמיינו לאפיין שיתוף תחבורה או אחר אירועים הסלולר מתואמות. הגישה הדמיה המתואר כאן הוא גמיש עבור מגוון של יישומים הדמיה יכול להיות מאומץ על ידי מעבדה בעלות קטנה יחסית בתנאי מיקרוסקופ זמין.
פרוטוקול
חלק 1: transfection של הנוירונים באמצעות Lipofectamine 2000 (Invitrogen)
ציוד הגדרת:
חולדה או עכבר נוירונים בהיפוקמפוס הם מתורבתים לפי Kaech והבנקאי, 2006 [4]. צפיפות התאים טיפוסי המשמש transfections הוא 250,000 צלחת cells/6-cm. ריאגנטים חובה וציוד כוללים חומצה 50 mM kynurenic, בעל קבוע צינור benchtop, צידנית benchtop (הטובה ביותר לשמור על קור מגיב Lipofectamine),
מגיב Lipofectamine, מזכרות, צינורות microfuge, micropipetters ו מלקחיים סטרילית.
נוהל:
- עבור כל תווית transfection two 1.5 מ"ל צינורות, אחד כדי להכיל את ה-DNA פלסמיד, אחד להכיל את מגיב transfection. Incubations הבאים יכולים להמשיך בטמפרטורת החדר.
- שלב 1.0 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד עם ממ 100 μL בצינור אחד (ללא תוספים מכל סוג, ממ לא צריך להיות בטמפרטורה של pH equilibrated).
- שלב 6.0 Lipofectamine μL עם ממ 100 μL בצינור 1.5 מ"ל אחרים.
- אין התאמות עבור transfections כפול נדרשים אף Lipofectamine: יחס ה-DNA יהיה חצוי במקרים כאלה. יחס Lipofectamine: DNA הוא עדיין בתוך ההצעה של היצרן. מומלץ לבדוק 0.5-1.0 מיקרוגרם לכל פלסמיד ביטוי אופטימלי.
- כדי לשמר את חיי המדף של מגיב Lipofectamine, יש להסיר מהמקרר זמן קצר ככל האפשר והניחו במקרר benchtop כאשר אינו בשימוש.
סה"כ זמן מהמקרר צריך להישמר עד למינימום.
- דגירה צינורות במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- מעבירים את פתרון ה-DNA ב-ממ לתוך הצינור שומנים בדם, לערבב בעדינות עם טפטפת, ואז דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- לאחר 25 דקות, לפני coverslips מרפרף, להוסיף 60 μL של חומצה kynurenic 50 מ"מ עד כדי למזער את הנזק excitoxic המנה של נוירונים בתרבית.
- Coverslips להפוך בזהירות רגל בצד למעלה באמצעות מלקחיים סטריליות, ולסדר כך שהם לא חופפים. היזהר שלא לגרד את פני השטח של נוירון מצופה coverslip או גליה משטח מצופה של המנה.
- קח כ 0.5 מ"ל של מדיום מצלחת 6 ס"מ ו לערבב בעדינות עם ה-DNA במבחנה, להעביר את פתרון ה-DNA חזרה צלחת מטפטפים באופן אחיד על פני השטח של המדיום.
- אל מערבולת, אבל בעדינות להחליק צלחת הלוך ושוב בכיוון אחד, אז להפסיק וחזור בכיוון הניצב שווה להפיץ את ה-DNA Lipofectamine קומפלקסים. דגירה במשך 90 דקות ב בתרבית רקמה אינקובטור (37 ° C CO, 5% 2).
- Coverslips פליפ רגל בצד למטה, ולסדר כך שהם לא חופפים. לאפשר ביטוי להמשיך לזמן הרצוי, לילה בדרך כלל עד 48 שעות.
חלק 2: הדמיה חיה של ה-GFP-tagged צפופה ליבות שלפוחית ב נוירונים בהיפוקמפוס תרבותי
ציוד הגדרת:
- הדמיה של תאים חיים דורשת מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במצלמת CCD, אנו משתמשים DMI לייקה מיקרוסקופ 6000B הפוך מצויד המשתנה לייקה, מנורת הניאון. נדרש גם הוא חדר הדמיה עם בקר טמפרטורה דוד אובייקטיבי. אנו משתמשים מכשירים וורנר RC-21BR שונה עבור coverslip 18 מ"מ בנוסף דוד פלטפורמה (קט # PH2) ו בקר טמפרטורה (קט # TC324B). החדר אינו מכיל יציאות פתוחות, שינוי זה יכול להיכלל בעת הזמנת החדר. דוד המטרה מומלץ מאוד כדי לעזור לשמור על הטמפרטורה של coverslip ולמזער את שינויי המיקוד בשל תנודות הטמפרטורה. תמונות נרכשים עם Hamamatsu אורקה-ER באמצעות Metamorph (התקנים מולקולריים) תוכנה כולל מצב "זרימה" של רכישת הנפתחת ב. שים לב, אנחנו לא משתמשים תא אקלים המקיף את המיקרוסקופ כולו. בנוסף זה יקר ולא הכרחי הדמיה לטווח קצר המתואר כאן.
- ציוד אחרים כוללים חומרים כימיים טרי מוכן בינוני הדמיה חיים (1X הנקס עם Ca 2 + ו - Mg 2 +, גלוקוז 0.6% ו HEPES 10mm), תוספת 18 מ"מ coverslips זכוכית, מלקחיים סטריליות, הלא סטרילית מלקחיים, Kimwipes, גריז ואקום ו מזרק (ללא מחט או עם מחט רחב נשא שונה) שבה כדי למרוח משחה.
נוהל:
- הכן הדמיה טרי בינוני לחיות (1X הנקס עם Ca 2 + ו - Mg 2 +, גלוקוז 0.6% ו HEPES 10mm). אנחנו בדרך כלל להכין 50mls בכל פעם ולאחסן ב 4 מעלות צלסיוס כאשר אינו בשימוש. עדיף להכין מספיק במשך שבוע לא יותר, אחד בכל פעם. כ 5-10 מ"ל משמשים לכל צלחת של נוירונים.
- התחל מיקרוסקופ, מצלמה, מנורת פלורסנט, ורכישת תוכנה התמונה. כמו כן להפעיל את הכוח פלטפורמת קאמרית תנורי אובייקטיבי.
- הכן את לדמייןg קאמרית.
- חדר וורנר כולל טפלון להכניס את הרכבה של coverslips. על מנת להקל על, לצד מניפולציה תווית אחת של "למעלה" להכניס את הסמן קבע.
- החלת טבעת של שומן כדי חריץ המקיף את החור בצד של החדר שכותרתו "מלמעלה". הימנעו משימוש עודף כפי שהוא ייכנס קאמרית לצמצם את השטח הנצפה.
- בעזרת מלקחיים, לצרף נקי, ללא שימוש coverslip 18 ס"מ בצד "למעלה" של החדר, להפעיל לחץ עדין coverslip בשוליה ליצור חותם חזק בתוך החריץ הפסקה של החדר.
- סובבו את החדר מעל ולהחיל טבעת דומה של שומן כדי חריץ בצד (התחתון) מול האולם.
- הנח את הצד מוכן הקאמרית מלמטה למעלה, על מכסה של שפופרת של 50 מ"ל, שהוא בעל תא אידיאלי.
- הוספת 750 μL של המדיום הדמיה לחדר. זוהי כמות מוגזמת, אבל שומן צריך למנוע את המדיום מלגלוש שוב עודף תסייע למנוע בועות מלהיות לכוד כאשר coverslip תא מכוסה מוחל.
- שמירה על חדר שהוכן בתרבית רקמה החממה עד הצורך. Incubations ממושכת, ~ 1 שעה יש להימנע ככל בינוני הדמיה יתאדה ושינוי בהרכב.
- בצע את הרכבה הסופי תא הדמיה תא חי.
- הזז את החדר מוכן צלחת coverslips transfected מן החממה עד למכסה המנוע בתרבית רקמה.
- הרכבה תא הסופי צריך להתבצע במהירות, כדי להבטיח את התאים להישאר שקוע בינוני ב 37 ° C ברציפות.
- בעזרת מלקחיים סטריליות, בזהירות להסיר את אחד coverslip מצלחת transfected, לגעת בקצה coverslip כדי Kimwipe להתרחק בינוני צמיחה.
- מניחים את coverslip נוירון בצד למטה אל החדר מוכן. מגע צד אחד של coverslip כדי גריז הראשונה להפעיל לחץ בקצוות להביא את coverslip שטוח ללא בועות השמנה. אמצעי הדמיה עודף תישפך החוצה כצפוי.
- נגבו את המדיום הדמיה עודף, אבל להיזהר שלא להחליק את coverslips מתוך עמדה.
- הזז את תא אל תנור מחומם מראש את הפלטפורמה ואת להדק את החדר במקום.
- העברה לתא לבמה.
- כדי להפחית photobleaching ו photoxicity, להתאים את המנורה לסכום מינימום של עוצמת צורך למצוא תאים transfected.
- מצא תא עניין עם מטרה הנפט נמוך הגדלה (40X). זה מועיל להיצמד לדפוס החיפוש מתוכננת כדי להבטיח כיסוי coverslip מירבית כדי למנוע רכישות התמונה מיותר, שמאל למשל, החלק העליון של coverslip, סריקה למעלה ולמטה עובד ימינה.
- עבור מטרה הנפט הגבוהים בהגדלה (60 100x) פעם שדה הרצוי אותר.
- השתמש "הרכישה זרם" או פונקציה דומה של תוכנות הדמיה שלך כדי להקליט וידאו של הדינמיקה חלבון fluorescently שכותרתו.
- קחו תמונה שלב וכל התמונות הנלוות אחרים (GFP מסיסים למשל) לצורך ניתוח מאוחר יותר במצגת.
- שמור את כל התמונות לפני לחקור את coverslip נוסף הקלטת וידאו הבא.
- בדרך כלל 3-5 קטעי וידאו מ coverslip אחד הוא נחשב מוצלח. Phototoxicity בריאות כללית תא יש לזכור כמו תחבורה מוקטן התאים הפגועים. בריאות Cell ניתן לנטר באמצעות תצפיות באמצעות מיקרוסקופ פאזות. בדרך כלל מבוצעות הקלטות למשך כ 30 דקות לכל coverslip.
חלק 3: תוצאות נציג:
חיים הדמיה תצפיות התא בדרך כלל מורכבת של קטעי וידאו (המכונה גם "ערימות" של תמונות) המראים תנועת האברונים fluorescently-tagged בתחום של תצוגה (איור 1 א). ליווי כל וידאו לעיתים קרובות תומכים תמונות להמחשת הכיוון של שדה הראייה ביחס לרמת הגוף, התא של ביטוי חלבון ו / או בריאות של התא. סרטי וידאו של התחבורה יכולה להיות נתונה ניתוח כמותי על ידי שינוי כדי kymographs (איור 1B). Kymographs הם תמונות הממחישות תנועת החלקיקים מעמיד זה בצד זה על ידי סריקות קו הזמן שבו כל נקודה מיוצגת על ידי טור רשם גלים. איור 2 מראה כיצד שני חלקיקים נעים בכיוון ההפוך מיוצגים רשם גלים. ניתוח נוסף של kymographs יכול לספק מידע על שטף החלקיקים, מהירות, אורך לרוץ, תהפוכות, וחלקיקים נייח.
באיור 1. חיים נציג תא הדמיה תצפיות. (א) תמונות נבחרות מתוך וידאו של mCherry-tagged רקמות plasminogen Activator (TPA) הובלה. חלקיקים בודדים נעים אנטרוגרדית (חיצים ירוקים) ו מדרדר (חיצים אדומים) כיוונים מצוינים. (ב) Kymographs הממחישות TPA-mCherry התנועההאקסון. קווים אופקיים ב kymographs מייצגים אובייקטים נייחים, ואילו קווים אלכסוניים מייצגים האברונים מתרחק (שיפוע חיובי) או לכיוון (שיפוע שלילי) גוף התא. חיצים ירוקים ואדומים ארוכים המופע רץ המתאים החלקיקים (A). שינויים בתחבורה עקב מגיב microtubule depolymerizing, nocodazole, מתוארת גם עם רשם גלים. הערה צמצום האברונים נע בהעדר קווים אלכסוניים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הדמיה תא חי היא טכניקה מאתגרת, אך רב עוצמה עבור תצפית ישירה של תחבורה אברון בנוירונים בתרבית. הקשיים יכולים לנבוע במעלה הזרם של ההליך עם נוירון בריאות לעניים בשל סיבוכים תרבות. לכן, בריאות תא (לדוגמאות ראו נ"צ. 4) יש לבחון לפני ואחרי transfection ידי התבוננות coverslips בעוד בינוני צמיחה באמצעות תרביות רקמה מיקרוסקופ אור. תהליך העברת נוירון המכילים coverslips לחדר הדמיה יכול להיות מלחיץ את התאים, ולכן חשוב לנקוט בזהירות כאשר מניפולציה של coverslips. זה יכול להיות נפוץ מראה בר...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
אנו מודים הרלד Hutter והלנה דקר קריאה זהירה של כתב היד הזה שלהם. כמו כן, אנו מודים רג Sidhu מ Leica Microsystems עבור המומחיות הטכנית שלו. מחקר זה נתמך על ידי למדעים והנדסה המועצה הלאומית של קנדה, פרס # 327100-06, ואת סיימון פרייזר סגל אוניברסיטת המדע.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות | |
|---|---|---|---|---|
| MEM-Eagle עם מלחים של Earle ו-L-glutamine | ריאגנט | Mediatech, Inc. | 10-010-CV | |
| Lipofectamine 2000 | ריאגנט | Invitrogen | 11668-027 | ריאגנט טרנספקציה |
| 10X Hanks עם Ca2+ ו-Mg2+ | ריאגנט | GIBCO, by Life Technologies | 14185-052 | מצע לדימוי חי |
| 1M HEPES | ריאגנט | GIBCO, by Life Technologies | 15630-130 | מצע לדימוי חי |
מקורות
- Kulic, I. M., et al. The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).
- Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon. Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).
- Barkus, R. V., et al. Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides. Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תיקון
Formal Correction: Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.
Posted by JoVE Editors on 1/20/2010. Citeable Link.
A correction was made to Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons. There was an error in the author's name. The author name was corrected to include a middle initial as follows:
David M. Kwinter, Michael A. Silverman
instead of:
David Kwinter, Michael Silverman.
