הדמיה תא חי היא של כלי מסוים כאשר לומדים את הדינמיקה של סחר אברון. כאן אנו מתארים פרוטוקול הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית בנוירונים בתרבית שימוש רחב בתחום מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פרוטוקול זה הוא גמיש ניתן להתאים האברונים תמונה אחרים כגון המיטוכונדריה, endosomes, ואת peroxisomes.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית בתוך ראשי נוירונים בהיפוקמפוס Cultured
במאמר זה
הודעת תיקון
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
סיכום
תקציר
התבוננות ואפיון תהליכים תאיים דינמי יכולה להניב מידע חשוב על פעילות הסלולר שלא ניתן שנרכשו תמונות סטטיות. בדיקות ניאון ויטל, חלבון פלואורסצנטי ירוק במיוחד (GFP) חוללו מהפכה בביולוגיה של התא הנובע היכולת לתייג תאים תאיים מסוימים ומבנים הסלולר. כך, למשל, הדמיה חיה של ה-GFP (וגירסאות ספקטרלי שלה) מפלצות אפשרו לניתוח דינמי של cytoskeleton, תחבורה אברון, ואת הדינמיקה קרום שפע של אורגניזמים סוגי תאים [1-3]. למרות הדמיה חיים הפך להיות שכיח, גישה זו עדיין מציבה אתגרים טכניים רבים, בעיקר נוירונים בתרבית ראשונית. אתגר אחד הוא ביטוי של GFP-tagged חלבונים שלאחר mitotic נוירונים, והשני הוא היכולת ללכוד תמונות פלורסנט תוך מזעור phototoxicity, photobleaching, ושמירה על בריאות התא הכללי. כאן אנו מספקים פרוטוקול מתאר שיטה השומנים מבוסס transfection כי התשואות transfection שיעור נמוך יחסית (~ 0.5%), אולם הוא אידיאלי עבור הדמיה של נוירונים מקוטב במלואו. שיעור נמוך transfection חיונית כל כך אקסונים יחיד דנדריטים ניתן לאפיין את האוריינטציה שלהם אל גוף התא כדי לאשר את הכיווניות של תחבורה, כלומר האנטרוגרד נ מדרדר. הגישה שלנו הדמיה GFP להביע נוירונים מסתמך על מיקרוסקופ רחב בתחום תקן פלורסנט ומצויד במצלמה CCD, לכידת תמונה תוכנה, וחדר הדמיה מחומם. יש לנו הדמיה מגוון רחב של אברונים או מבנים, למשל, צפוף ליבות שלפוחית, המיטוכונדריה, חרוטים צמיחה, אקטין ללא אופטיקה מיוחד או דרישות עירור אחר מאשר מקור אור ניאון. בנוסף, spectrally-ברורים, חלבונים שכותרתו fluorescently, למשל, ה-GFP ו-dsRed מתויג חלבונים, יכול להיות בו זמנית ליד דמיינו לאפיין שיתוף תחבורה או אחר אירועים הסלולר מתואמות. הגישה הדמיה המתואר כאן הוא גמיש עבור מגוון של יישומים הדמיה יכול להיות מאומץ על ידי מעבדה בעלות קטנה יחסית בתנאי מיקרוסקופ זמין.
פרוטוקול
חלק 1: transfection של הנוירונים באמצעות Lipofectamine 2000 (Invitrogen)
ציוד הגדרת:
חולדה או עכבר נוירונים בהיפוקמפוס הם מתורבתים לפי Kaech והבנקאי, 2006 [4]. צפיפות התאים טיפוסי המשמש transfections הוא 250,000 צלחת cells/6-cm. ריאגנטים חובה וציוד כוללים חומצה 50 mM kynurenic, בעל קבוע צינור benchtop, צידנית benchtop (הטובה ביותר לשמור על קור מגיב Lipofectamine),
מגיב Lipofectamine, מזכרות, צינורות microfuge, micropipetters ו מלקחיים סטרילית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הדמיה תא חי היא טכניקה מאתגרת, אך רב עוצמה עבור תצפית ישירה של תחבורה אברון בנוירונים בתרבית. הקשיים יכולים לנבוע במעלה הזרם של ההליך עם נוירון בריאות לעניים בשל סיבוכים תרבות. לכן, בריאות תא (לדוגמאות ראו נ"צ. 4) יש לבחון לפני ואחרי transfection ידי התבוננות coverslips בעוד בינוני צמיחה באמצעות תרביות רקמה מיקרוסקופ אור. תהליך העברת נוירון המכילים coverslips לחדר הדמיה יכול להיות מלחיץ את התאים, ולכן חשוב לנקוט בזהירות כאשר מניפולציה של coverslips. זה יכול להיות נפוץ מראה בר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
אנו מודים הרלד Hutter והלנה דקר קריאה זהירה של כתב היד הזה שלהם. כמו כן, אנו מודים רג Sidhu מ Leica Microsystems עבור המומחיות הטכנית שלו. מחקר זה נתמך על ידי למדעים והנדסה המועצה הלאומית של קנדה, פרס # 327100-06, ואת סיימון פרייזר סגל אוניברסיטת המדע.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות | |
|---|---|---|---|---|
| MEM-Eagle עם מלחים של Earle ו-L-glutamine | ריאגנט | Mediatech, Inc. | 10-010-CV | |
| Lipofectamine 2000 | ריאגנט | Invitrogen | 11668-027 | ריאגנט טרנספקציה |
| 10X Hanks עם Ca2+ ו-Mg2+ | ריאגנט | GIBCO, by Life Technologies | 14185-052 | מצע לדימוי חי |
| 1M HEPES | ריאגנט | GIBCO, by Life Technologies | 15630-130 | מצע לדימוי חי |
מקורות
- Kulic, I. M., et al. The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).
- Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. A change in the selective trans....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תיקון
Formal Correction: Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.
Posted by JoVE Editors on 1/20/2010. Citeable Link.
A correction was made to Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons. There was an error in the author's name. The author name was corrected to include a middle initial as follows:
David M. Kwinter, Michael A. Silverman
instead of:
David Kwinter, Michael Silverman.
