נפח גדול (20L +) סינון של דגימות מי ים החוף

סיכום

זה מסמכים וידאו בנפח גדול (L ≥ 20) סינון של ביומסה של חיידקים, הנעים בין 0.22μm 2.7μm ו בקוטר של עמודת המים.

תקציר

עבודה מתחיל עם איסוף המים ימית החוף למען הקהילה חיידקים במורד הזרם, מנתח גז מזין עקבות. בשיטה זו, דגימות שנאספו סיפון ההפעלה ג'ון סטריקלנד HMS ב Inlet Saanich. זה מסמכים וידאו בנפח גדול (L ≥ 20) סינון של ביומסה של חיידקים, הנעים בין 0.22μm 2.7μm ו בקוטר של עמודת המים. שתי דוגמאות 20L ניתן לסנן בו זמנית באמצעות יחידת משאבה אחת מצויד עם ארבעה ראשים מסתובבים. הסינון מתבצע בתחום לטיולים המורחבת, או מיד עם שובו של טיולי יום. חשוב לרשום את כמות המים העוברים דרך יחידה sterivex הסינון. כדי למנוע היווצרות biofilm בין טיולים הדגימה, כל הציוד סינון חייב להיות שטוף עם HCl לדלל במים deionized ו autoclaved מיד לאחר השימוש. הליך זה ייקח בערך 5 שעות פלוס שעה נוספת עד נקיים.

פרוטוקול

1. הגדרת מנגנון סינון
   1. כדי להגדיר את מנגנון סינון, להשתמש בפינצטה למקום כיתה GF / D לסנן לתוך יחידת דיור prefilter. Loosely להדק הדיור ביד. ככלל אצבע, לא להדק יתר או יחידת ידלפו פעם מתחיל שאיבה.
   2. החזר את מכסה בקבוק עם כובע autoclaved צינורות מחוברים בקפידה על ידי הכנסת צינור פנימי לתוך בקבוק, בלי לגעת בו. במידת הצורך, להשתמש בפינצטה כדי להנחות את צינורות לתוך בקבוק.
   3. עוברים את צינורות חיצוניים באמצעות המשאבה peristaltic.
   4. צרף יחידות דיור prefilter לסוף שני צינורות חיצוניים (כלומר 2 יחידות לכל בקבוק). להדק את הקשר עם צבת.
2. סינון של מי ים
   1. כדי להתחיל לסנן את מי ים, להפעיל את המשאבה ולקבוע את מהירות הזרימה 1. צפה על מנת להבטיח כי המים נשאב בכיוון הנכון.
   2. אפשר 500 מ"ל של מים לזרום בחופשיות דרך היחידה prefilter אל Beaker 1 L.
   3. כבה את המשאבה, ולצרף מסנן Sterivex ל מתאים luer זכר בסוף ללא התקנה prefilter. הדק את הדיור prefilter בנוחות ביד.
   4. שימו לב על הדיור prefilter ועל הקשר בין הדיור prefilter ואת צינורות שמובילה בקבוק. אם ההדלפות מתרחשות, להפעיל את המשאבה לסירוגין לשחרר ואת retighten הדיור prefilter בהתאם. הפעל את המשאבה בחזרה.
   5. אסוף את תסנין ב 4 צלוחיות L. ברגע שהם מלא, רוקן את צלוחיות לתוך בקבוק נקי. הקפידו לציין את נפח עברו כל מסנן. שנאסף תסנין יכול להיות מעובד יותר, כגון סינון וירוסים.
   6. המשך עד אין סינון מים נשאר carboys. סינון הזמנים הרגיל נע בין 4-5 שעות / 20 בקבוק L, אך זה תלוי באופן משמעותי על הסכום של ביומסה בתוך המים.
   7. לאחר סינון תושלם, לעבור את המשאבה ונתק את המסננים Sterivex.
3. אחסון של מסננים
   1. כדי לאחסן את המסננים, תחילה לגרש כל המים שנותרו עם מזרק 3-60 מ"ל.
   2. בעזרת פיפטה, מוסיפים למאגר תמוגה 1.8ml לסינון, שמירה ~ 200 ul שטח במסנן עבור תוספת מאוחרת של חומרים כימיים.
   3. חותם התחתונה העליון של המסנן Sterivex עם חתיכה קטנה של Parafilm, ואת התווית מסננים עם התאריך וזיהוי המדגם.
   4. חנות מסננים צינור מראש שכותרתו בז 50 מ"ל ב -80 ° C
   5. הסר את המסננים מיחידת דיור למקם אותם לתוך צינורות שכותרתו 50 מ"ל פלקון המכיל 2 מ"ל של חיץ תמוגה. חנות אלה ב -80 ° C.
4. ניקוי
   1. עבור ניקוי סופי, במקום בצינור שהיה בתוך בקבוק לתוך בקבוק המכיל 0.1 M HCl
   2. כוונו את צינורות שיובילו הבקבוק לתוך בקבוק 4L המקורי.
   3. הפעל את המשאבה ולהפעיל ב 3, איסוף לזרום דרך לרוץ בקבוק המקורי.
   4. לבסוף, יש לשטוף בצינור מים autoclaved.

תוצאות נציג: התוצאה הסופית כוללת שני מסננים Sterivix שכל אחת מהן מכילה חיידקים ביומסה מכ 10 ים L בטווח גודל של 0.22μm ו 2.7μm. זה מאוחסן חיץ תמוגה ומוכן להפקת DNA. בנוסף, הליך זה אוסף מתרכז ביומסה יותר מאשר 2.7 מיקרומטר, על prefilters GF / D. זה מאוחסן גם במאגר תמוגה ומוכן להפקת DNA. אם צעדים עיבוד נוסף נלקחים, 0.22 מיקרומטר זרימה דרך יכול להיות מרוכזים למטה כדי לאסוף את חלק ויראלי גם.

דיון

זה הכרחי כדי לנגב את ספסלי משאבות במגבת לחה לאחר השימוש כדי להסיר כל עקבות המתמשכת של מי מלח שאחרת לשיתוק ציוד. למרות ההליך הוא פשוט, הדרישה זמן יכול להיות נרחב תלוי בריכוז של ביומסה או פסולת במדגם להיות מסונן.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
משאבה פריסטלטית		Masterflex (Cole Palmer)	77913-20, 77200-62, 77200-04
צינור Tygon LFL		Masterflex (Cole Palmer)	06429-24	עבור מערכת סינון
מהבקי הלחץ (קוולסות)		Cole-Parmer	0683204	עבור מערכת סינון
1/4” x 3/16” מתאמי צינורות		Cole-Parmer	31702-20	עבור מערך סינון
בית מסנן קדם מפוליפרופילן		ADVANTEC	501200	עבור מכשיר סינון
מחבר לור מתכתי (קצה צינור למחבר לור זכר עם נעילה)		Cole-Parmer	31507-27	עבור מערכת סינון
2“ מגנטים			עבור מערכת סינון
פקקי קרבוי בעלי 3 פתחים				עבור התקן סינון
GV 0.22 μמסנני STERIVIX		EMD Millipore	SVGV01R5
קוטר 47 מ"מ 2.7 μמסנני GF/D		Whatman, GE Healthcare	1823047
בופר ליזיס	ריאגנט			0.75 M סוכרוז, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1% HCl	ריאגנט			לשטיפה לאחר הסינון
מים שעברו עיקור באוטוקלאב	ריאגנט			לשטיפה לאחר הסינון