נפח קטן (1-3L) סינון של דגימות מי ים החוף

סיכום

זה מסמכים וידאו נפח קטן (~ 1 L) סינון של ביומסה של חיידקים מעמודת המים.

תקציר

עבודה מתחיל עם איסוף המים ימית החוף למען הקהילה חיידקים במורד הזרם, מנתח גז מזין עקבות. לקבלת דוגמיות הפגנה של היום נאספו סיפון ההפעלה ג'ון סטריקלנד HMS ב Inlet Saanich. זה מסמכים וידאו נפח קטן (~ 1 L) סינון של ביומסה של חיידקים מעמודת המים. הפרוטוקול הוא הרחבה של פרוטוקול גדול הדגימה נפח שתוארו קודם לכן, עם הבדל אחד משמעותי: כאן, אין שום צעד סינון מראש, ולכן כל המעמדות גודל של ביומסה נאספים עד 0.22 מיקרומטר לסנן חתוכים. דוגמאות שנאספו בדרך זו הם אידיאליים עבור ניתוח חומצות גרעין. הצעדים הגדרת, סינון, ו לנקות כל אחד לקחת על 20-30 דקות. אם באמצעות שתי משאבות peristaltic בו זמנית, עד 8 דגימות ניתן לסנן באותו זמן. כדי למנוע היווצרות biofilm בין טיולים הדגימה, כל הציוד סינון חייב להיות שטוף עם HCl לדלל במים deionized ו autoclaved מיד לאחר השימוש.

פרוטוקול

1. הגדרת מנגנון סינון
   1. לפני סינון, תחילה למחות כל התעבות של בקבוקים מלאים ולשקול אותם
   2. הצב בן החיטוי בצד אחד של המשאבה, ואת בקבוק פסולת מאידך.
   3. אז במקום בקבוק מלא מדגם לפח החיטוי, אך לא להסיר את מכסה הבקבוק עדיין.
   4. במעבר דרך צינור המשאבה peristaltic כך בסוף luer של צינורות נמצא הבקבוק.
   5. בעזרת פינצטה, להסיר את הכותנה מן פיפטה סטרילית 25 מ"ל, ולצרף את טפטפת לקצה השני של הצינור.
2. סינון של מי ים
   1. כדי להתחיל סינון מי ים, לפתוח את הבקבוק ולהכניס את פיפטה. הפעל את המשאבה ולקבוע את מהירות הזרימה 1. צפה על מנת להבטיח כי המים נשאב בכיוון הנכון.
   2. אפשר ~ 100 מ"ל מים לעבור דרך צינורות כולו.
   3. כבה את המשאבה ואת לצרף לסנן Sterivex ל מתאים luer זכר בסוף חופשית של הצינור.
   4. המשך עד אין סינון מים נשאר הבקבוקים.
3. אחסון של מסננים
   1. כדי לאחסן את המסננים, תחילה לגרש כל המים שנותרו עם מזרק 3-60 מ"ל.
   2. חותם את החלק התחתון של המסנן Sterivex עם Parafilm. בעזרת פיפטה, מוסיפים למאגר תמוגה 1.8ml לסינון, שמירה ~ 200 ul שטח במסנן עבור תוספת מאוחרת של חומרים כימיים.
   3. לאחר מכן, חותם את החלק העליון של המסנן Sterivex עם חתיכה קטנה של Parafilm, ואת התווית מסננים עם התאריך וזיהוי המדגם.
   4. חנות מסננים מראש שכותרתו צינורות 50 מ"ל בז ב -80 ° C
4. ניקוי
   1. הכנס את פיפטה 25 מ"ל לתוך הבקבוק המכיל 0.1% HCl, ולעבור על המשאבה.
   2. לאחר לשטוף את HCl, לשטוף בצינור מים autoclaved.
      
      לבסוף, למדוד ולתעד המוני של בקבוקי 1 ליטר ריק עכשיו, כדי לחשב את נפח המים עברו דרך המסנן.

נציג תוצאות: לכל 1 ליטר מים מדגם התשואות one Sterivix מסנן, אשר מכיל ביומסה גדולה 0.22 מיקרומטר. זה מאוחסן חיץ תמוגה להפקת DNA ניתוח עתידיים. התוצאה הסופית כוללת מסנן Sterivix אחד לכל בקבוק 1 ליטר מאוחסנים חיץ תמוגה ומוכן להפקת DNA. המסנן מכיל ביומסה גדולה 0.22 מיקרומטר. מסננים ניתן לאחסן -80 ° C לפני מיצוי עדנה.

דיון

זה הכרחי כדי לנגב את ספסלי משאבות במגבת לחה לאחר השימוש כדי להסיר כל עקבות המתמשכת של מי מלח שאחרת לשיתוק ציוד. למרות ההליך הוא פשוט, הדרישה זמן יכול להיות נרחב תלוי בריכוז של ביומסה או פסולת במדגם להיות מסונן.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
משאבה פריסטלטית	Masterflex (Cole Palmer)	77913-20, 77200-62, 77200-04
צינור Tygon LFL	Masterflex (Cole Palmer)	06429-24	עבור התקן הסינון
מהבקי צינורות	Cole-Parmer	0683204	עבור התקן הסינון
מתאמי צינורות 1/4” x 3/16”	Cole-Parmer	31702-20	עבור התקן הסינון
בית למסנן קדם מפוליפרופילן	ADVANTEC	501200	עבור התקן הסינון
מחבר luer מתכתי (קצה צינור ל-Male luer lock)	Cole-Parmer	31507-27	עבור התקן הסינון
מגנטים בגודל 2“			עבור התקן הסינון
פקקי carboy בעלי 3 פתחים			עבור התקן הסינון
מסנני GV 0.22 μm STERIVIX	EMD Millipore	SVGV01R5
מסנני GF/D בקושי 2.7 μm וקוטר 47 mm	Whatman, GE Healthcare	1823047
בופר ליזיס			0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl			עבור שטיפה לאחר סינון
מים שעברו אותקלוו			עבור שטיפה לאחר סינון