Antigen CD4 + הדמיה ספציפיות תאים T באמצעות MHC Class II Tetramers

סיכום

הליך זה מדגים את טיהור בהרחבת במבחנה של אנטיגן ספציפי CD4 + T תאים מדם היקפי שלם להדמיה שלהם באמצעות MHC בכיתה tetramers השנייה. Tetramers לאפשר הדמיה ישירה של תאים T עם סגוליות לאנטיגן יחיד ומוגדר הגבלה MHC Class II.

תקציר

סרן מורכב histocompatibility (MHC) בכיתה tetramers השנייה לאפשר להדמיה ישירה של אנטיגן ספציפי CD4 + T תאים על ידי cytometry הזרימה. שיטה זו מסתמכת על האינטראקציה בין פפטיד ספציפי מאוד טעון MHC לבין הקולטן המתאים T-cell. למרות הזיקה של מולקולת MHC / פפטיד בודד הוא נמוך, cross-linking קומפלקסים MHC / פפטיד עם streptavidin מגביר את הלהיטות של האינטראקציה, המאפשרת את השימוש בהם כמו מכתים ריאגנטים. בגלל בתדרים נמוכים יחסית של תאים מסוג CD4 + T (~ 1 ב 300.000 עבור סגוליות אחת) assay זה מנצל בשלב הגברה חוץ גופית כדי להגדיל את סף של גילוי. תאים mononuclear הם מטוהרים מן הדם ההיקפיים על ידי ביסוד Ficoll. CD4 + תאים מופרדים ולאחר מכן על ידי סלקציה שלילית באמצעות קוקטייל נוגדנים biotinylated ואנטי ביוטין חרוזים מגנטיים שכותרתו. שימוש בתאי חסיד מן חלק CD4 תאים כמו תאים הצגת אנטיגן, ותאי T מסוג CD4 + מורחבות בתקשורת ידי הוספת הפפטיד antigenic ו IL-2. התאים מורחבת מגואלות בכיתה המקבילה II tetramer ידי דוגרים ב-C 37 למשך שעה אחת ומוכתמת לאחר מכן באמצעות נוגדנים משטח כגון אנטי CD4, אנטי CD3, אנטי CD25. לאחר תיוג, התאים ניתן לנתח באופן ישיר על ידי cytometry הזרימה. התאים tetramer חיובי בדרך כלל בצורה ברורה בקרב האוכלוסייה CD4 + תאים מורחבת. תאים Tetramer חיובי בדרך כלל CD25 + CD4 גבוה ולעיתים קרובות. בגלל רמת מכתים tetramer הרקע יכול להשתנות, מכתים תוצאות חיוביות תמיד צריך להיות לעומת צביעה של התאים אותו דבר עם tetramer רלוונטי. וריאציות מרובות של assay בסיסי זה אפשרי. תאים Tetramer חיובי עשוי להיות מיון לניתוח פנוטיפי נוספת, הכללה ELISPOT או מבחני שגשוג, או מבחני משנה נוספים. מספר קבוצות הראו גם שיתוף מכתים באמצעות tetramers ואו אנטי ציטוקינים או אנטי FoxP3 נוגדנים.

פרוטוקול

1. דם היקפיים mononuclear תאים (PBMC) בידוד

1. להשיג דגימת דם - הדם צריך להיות שנאספו מזרקים או מבחנות דם קרוש אנטי עם הפרין (01:50 יחס) כדי למנוע קרישה. מצפים לתשואה של כ - 1 × 10 ⁶ PBMC לכל מ"ל של דם - כ -40% אשר יהיה חיובי CD4 (CD4 +) ותאי T.
2. Aliquot הדם לתוך צינורות חרוטי 50 מ"ל, 25 מ"ל לכל צינור. אם יש דם מופרדים, מערבבים בעדינות לפני aliquoting להפיץ את הפלזמה
3. הוסף PBS, מביא את סך נפח 40 מ"ל ו ביסוד ידי ציור של עד 11 מ"ל Ficoll, החדרת צינור לתוך הדם, בזהירות הסרת סיוע pipet מן פיפטה. Ficoll יהיה לאט לנקז לתוך החלק התחתון של הצינור. לאחר הרמה יש להשוות, לאט להסיר את פיפטה מהצינור דם וזורקים.
4. שווי צינורות הדם לעבור את המכלים Aerosolve. לסגור היטב את המכלים ו צנטריפוגות ב × 900 גרם במשך 20 דקות - לא בלם. זה קריטי, כי לא בלם מוחל בסוף הסיבוב הזה כמו כוח הבלימה יפריע את שכבת התאים.
5. אחרי ספין, PBMCs צריך ליצור שכבה לבנה ברורים בין פלזמה הצהוב (לעיל) ficoll שקוף (להלן). בעדינות יגרוף כדוריות דם לבנות שכבה באמצעות פיפטה העברה להעביר צינור חדש. חלק פלזמה ו Ficoll ניתן משוכות עם PBMCs, אבל למנוע עריכת כל שכבת תאים אדומים. בדרך כלל שני צינורות דם יכול להיות משולב לתוך צינור תא אחד בשלב זה להגדיל את גודל גלולה.
6. הוסף PBS, מביא את סך נפח 50 מ"ל ו - 500 צנטריפוגות ב × גרם במשך 15 דקות - בלם נמוך בלוני aerosolve.
7. לשאוב נוזלים באמצעות פיפטה פסטר, נזהרת שלא להפריע גלולה
8. פנקו עם חיץ המוליטית ידי הוספת 5-6 מ"ל לצינור כל ערבוב בעדינות כדי להסיר גושים. דגירה של לא יותר מ 5 דקות.
9. הוסף PBS, מביא את סך נפח 50 מ"ל ו - 230 צנטריפוגות ב × גרם במשך 10 דקות - בלם נמוכה. בלוני Aerosolve אין עוד צורך אלה ספינים איטי יותר.
10. לשטוף פעמיים: נוזל לשאוב בעזרת פיפטה פסטר, למלא צינור עם PBS ו צנטריפוגות ב × 230 גרם במשך 10 דקות.
11. לפני השלב הסופי לשטוף, להסיר aliquot מחדש מושעה תאים, לדלל עם trypan כחול, לספור באמצעות hemocytometer. זה לספור תא יכתיבו את הכרכים מגיב המשמשים את הצעד ההפרדה תא T.

2. הפרדה מסוג CD4 + T ^* תא

1. לשאוב נוזלים להוסיף למאגר רץ להביא את הנפח הכולל של עד 40 UL לכל 10 מיליון תאים. בדרך כלל זה דורש 30 UL של חיץ בתוספת נפח שיורית גלולה.
2. העברה זו נפח צינור חרוטי 15 מ"ל.
3. הוסף קוקטייל נוגדנים מתיק CD4 הבידוד - 10 UL לכל 10 מיליון תאים, צינור כובע, ומניחים על קרח במשך 10 דקות
4. הסרת הצינור מן הקרח, להסיר את המכסה, ולהוסיף 30 UL של הפעלת המאגר לכל 10 מיליון תאים
5. הוסף חרוזים מגנטיים מתיק CD4 הבידוד - 20 UL לכל 10 מיליון תאים, צינור כובע, ומניחים על קרח במשך 15 דקות
6. הוספת עשרה כרכים של הפעלת המאגר לכבס צנטריפוגות ב × 230 גרם במשך 10 דקות.
7. במהלך הסיבוב, להגדיר את מגנט צינור פוליפרופילן 5 מ"ל העבודה שלך
8. לשאוב נוזל מתוך התא גלולה, להוסיף 2 מ"ל חיץ ריצה להסיר גושים בעזרת פיפטה להעביר
9. בעזרת פיפטה להעביר אותו, להעביר תאים לתוך הצינור 5 מ"ל ו - דגירה של המגנט במשך 15 דקות
10. בזהירות למזוג CD4 + חלק התא לתוך שפופרת 15 מ"ל מסומן על ידי המגנט היפוך וריקון כל אבל הטיפה האחרונה
11. הוסף עוד 2 מ"ל של ריצה חיץ צינור 5 מ"ל ולהסיר מגנט
12. בעדינות ולשטוף את CD4 תאים את הצדדים של הצינור להעביר צינור 15 מ"ל מסומנים
13. הוסף 2 מ"ל בינוני T לתא צינור אחד, להסיר aliquots עבור ספירת התאים צנטריפוגות ב × 230 גרם במשך 10 דקות.
14. מדולל aliquots תא עם trypan כחול לספור באמצעות hemocytometer. ספירת תאים אלה יכתיבו את מספר בארות המשמשים צעד התרבות הרחבה.

* לחילופין, MACS עמודות וחרוזים (Miltenyi BIOTEC), מפריד תא AutoMACS (Miltenyi BIOTEC), או מפריד Robosep תאים (Cell Technologies גזע) ניתן להשתמש בו על פי הוראות מייצרת במקום צעדים 2.2-2.11.

3. בתרבות הרחבה חוץ גופית

1. לשאוב נוזל מסוג CD4 + ו-CD4 ו - תא כדורי, המבוססת על ספירת התאים, להוסיף מדיה ותרבות (בדרך כלל 3,000,000 תאים מסוג CD4 + לכל מ"ל ו - 10,000,000 CD4 תאים מ"ל לכל עובד היטב עבור הגדרת התרבות). התרבות דורשת הרחבה 3-5000000 CD4 תאים לכל היטב 2-3000000 CD4 + תאים לכל היטב בהיקף כולל של 1 מ"ל תרבות התקשורת בצלחת 48 תרבות היטב. בדרך כלל, תאים מסוג CD4 + הם מגבילים את האוכלוסייה
2. אם תרצה, מקרינים CD4 תאים (5000 ראד ים). Aliquot CD4 תאים למספר המתאים של בארות בצלחת 48 היטב על ידי הוספת 300-500 μL זה. מניחים את צלחת 37 ° C בחממה במשך שעה 1. חסיד CD4 תאים ישמש התאים המציגים אנטיגנים בתרבות הרחבה.
3. הסר את צלחת מן החממה.
4. לשטוף את הבארות על ידי הוספת 500 UL התקשורת טריים pipetting בעדינות מעלה ומטה 12-20 פעמים באמצעות pipet העברה והסרה של כל הנוזל. לשטוף את זה ישאיר שכבת התאים המציגים אנטיגנים חסיד.
5. כאשר הכביסה תושלם, להוסיף מדיה מספיק רק כדי להרטיב את החלק התחתון של כל טוב (בערך 100 UL) - אחרת התאים חסיד יתייבש
6. הוסף 2-3000000 CD4 + התאים היטב כל אחד. במידת הצורך, להוסיף מדיה נוסף כדי להביא את הנפח הכולל של כל מ"ל עד 1 היטב.
7. מוסיפים את הפפטיד הרצוי היטב כל אחד. ריכוז אופייני לגירוי הוא 10 UG / mL הסופי.
8. מניחים צלחת בתוך 37 ° C החממה למשך 7 ימים.
9. לאחר 7 ימים, להוסיף 50 UL Hemogen של IL-2 (או שווה ערך, כגון רקומביננטי IL-2, 10 IU / mL) זה טוב.
10. ביום אחד לאחר מכן, לפקח גדילת התאים באמצעות מיקרוסקופ. פיד בארות שעדיין אינן ומחוברות על ידי הסרת מחצית התקשורת, והוסיף התקשורת טריים 50 UL של IL-2. פיצול בארות ומחוברות על ידי resuspending התאים, העברת מחצית התאים היטב ריק, הוספת מדיה טריים 50 UL של IL-2. חזור התאים חממה.
11. התאים הרחבת יהיה מוכן tetramer לאחר 13-15 ימים של תרבות.

4. לדמיין שתאי T על ידי מכתים tetramer

1. רכישה או להרכיב tetramers כדי להתאים את הפפטיד / MHC השילובים המתאימים מגורה CD4 + T תאים (ראה דיון על מקורות tetramer ריאגנטים). Tetramers יש ~ 0.5 מ"ג / מ"ל ​​פתרון.
2. הסר את צלחת של חממה
3. בזהירות לצייר את חצי התקשורת מכל טוב
4. העברת aliquot של תאים מכל טוב - בדרך כלל 75 μL או כ -50,000 תאים - לתוך צינור קלקר 5 מ"ל FACS
5. הוסף tetramer - בדרך כלל 1 μL לפי נפח 50 סך μL - ו - מקום 37 ° C חממה 1-2 שעות. כמו כן, מומלץ להכתים aliquot השני של התאים היטב עם כל tetramer תואמים כביקורת שלילית.
6. תאים עם תווית אנטי CD3, אנטי CD4, אנטי CD25 נוגדנים על ידי הוספת 3-10 μL של נוגדן זה. סמנים נוספים נוגדן או אלטרנטיבה ניתן להשתמש. עם זאת, אין להשתמש נוגדנים PE שכותרתו מאז הערוץ הזה צריך להיות שמור tetramers. בשלב זה, אף אחד צבע התווית או אלוטיפ שולטת באמצעות תאים עודפים.
7. דגירה תאים נוגדן הנקרא עבור 15-30 דקות על הקרח או 4 ° C.
8. לשטוף כל צינור עם 0.5-2 מ"ל ריצה חיץ צנטריפוגות ב × 230 גרם במשך 10 דקות.
9. בזהירות למזוג נוזל מתוך צינורות FACS. אחסן את כל צינורות במיכל מכוסה (רצוי על קרח) לניתוח FACS הבאים.

5. Cytometer תזרים רכישת וניתוח

1. כייל את Cytometer זרימה באמצעות חרוזים התייחסות.
2. בדיקת הגדרות המכשיר:
   1. שימוש בתאי לשלוט בלא כתם או פקדים אלוטיפ, להתאים את המיקום של השער הלימפוציטים קיימא (FSC מול SSC). הסרה אוטומטית של הקרינה מן כל הערוצים על ידי מרכוז של האוכלוסייה (על ידי שינוי הגדרות רווח) להלן בעשור הראשון על כל ציר.
   2. שימוש יחיד מלאה שפופרות צבע, מרכז אירועים בתוך הרביעים הנכון עבור כל צבע בודד (על ידי שינוי הגדרות פיצוי).
   3. האם הסתגלות קנס של הגדרות המכשיר באמצעות צינור מוכתם tetramer רלוונטי. בהגדרות במיוחד עבור ערוץ PE ייתכן שיהיה צורך הסתגלות כי tetramers לעתים קרובות כתם בהיר יותר לשלוט נוגדן. Tetramer רלוונטי צריך כתם <0.5% CD4 + תאים.
3. רוכשת את הנתונים עבור כל שפופרת
   1. איסוף אירועים עבור כל שפופרת מדגם צינור בקרה שלילית
   2. רוכשת ולשמור לפחות 20,000 אירועים Analysys
4. ניתוח נתונים
   1. נתוני ייבוא ​​קבצים לתוך תוכנת ניתוח FACS (למשל תוכנה CellQuest, WinMDI, או FlowJo). התחל את הניתוח שלך באמצעות צינור מוכתם באמצעות tetramer רלוונטי.
   2. מגרש FSC מול SSC וצייר השער סביב לימפוציטים חיים (איור 1, פאנל למעלה משמאל).
   3. מגרש מול CD3 CD4 (מגודרת להראות לימפוציטים לחיות בלבד) ולהסיק השערים סביב + CD3 ו CD4 + אוכלוסיות (1 איור הפאנל הימנית העליונה).
   4. CD4 מגרש מול Tetramer (מגודרת להראות CD3 לימפוציטים + בלבד) ולהגדיר את גבולות ברבע כך CD4 + + Tetramer האוכלוסייה הוא פחות מ 0.5% (1 איור הפאנל התחתון משמאל).
   5. מגרש CD25 לעומת Tetramer (מגודרת להראות לימפוציטים מסוג CD4 + בלבד) ולהגדיר את גבולות ברבע כך + CD25 האוכלוסייה Tetramer + הוא פחות מ -0.5% (1 איור הפאנל התחתון מימין).
   6. ניתוח של כל דוגמיות מבלי לשנות את השערים.

% 1167/JOVE 20FIGURE% 201.png "alt =" איור 1 "רוחב =" 600 "גובה =" 342 "/>

באיור 1. הנציג שלילי tetramer לשלוט בתוצאות מכתים. הפאנל השמאלי העליון מראה קדימה פסוקים פיזור בצד פיזור השער גודל הלימפוציטים (R1). הפאנל הימנית העליונה היא מגודרת עבור R1 ומראה נמלים CD4 לעומת אנטי CD3 ואת CD3 + (R2) ו CD4 + (R3) שערים. לוח השמאלית התחתונה היא מגודרת עבור R2 ומראה אנטי CD4 לעומת tetramer. הפאנל הימנית התחתונה היא מגודרת עבור R3 ומראה אנטי CD25 לעומת tetramer. הרביעים עבור שתי חלקות tetramer נקבעו על 0.5%.

6. נציג תוצאות

1. התאים tetramer חיובית צריכה להיות ברורה בקרב האוכלוסייה CD4 + מורחבת התאים (איור 2).
2. תאים Tetramer חיובי בדרך כלל CD25 + CD4 גבוה ולעיתים קרובות.
3. במקרים מסוימים, שילוב MHC / פפטיד יכול לתת רקע מכתים (לעיתים קרובות נגרמת על ידי הפפטיד עם מסיסות עניים). מכתים רקע כאלה ניתן להבדיל בין חיובי נכון כי "חיובית כוזבת" התאים אינם אוכלוסיה שונים אחד על אחד מול Tetramer CD4 או CD25 לעומת חלקות Tetramer (איור 3).

איור 2. הנציג חיובי מכתים תוצאות tetramer. פריסת פאנל אסטרטגיה gating זהים באיור 1. התאים tetramer חיובי להופיע אוכלוסייה שונות CD4 גבוה על אנטי CD4 מול פאנל tetramer ואוכלוסייה ברורים + CD25 על אנטי CD25 מול פאנל tetramer.

איור 3. נציג "חיובית כוזבת" מכתים תוצאות tetramer. פריסת פאנל אסטרטגיה gating זהים באיור 1. אנטי CD4 מול פאנל tetramer מראה ברור מכתים "תלוליות". אנטי CD25 לעומת tetramer גם מראה מכתים "תלוליות", ללא מגמה ברורה כלפי להיות CD25 +.

דיון

הבנת התפקיד של תאים מסוג CD4 + T בחסינות חשוב ביסודו. עם זאת, אנטיגן ספציפי CD4 + T תאים יכול להיות קשה לזהות ולבודד בשיטות מסורתיות. לעומת זאת, בכיתה tetramers MHC II לאפשר הדמיה ישירה של תאים מסוג CD4 + T עם סגוליות את האנטיגן הרצוי. וידאו זה מדגים את הבידוד, טיהור, וכן הגברה במבחנה של תאים מסוג CD4 + T ו להדמיה הבאים שלהם באמצעות tetramers. מחלקה Tetramers השנייה הם חלבון פלואורסצנטי conjugates המורכב מסיסים biotinylated בכיתה השנייה α / β הדימרים מצומדות סביב ליבה פלורסנט stre...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מCב בטיחות ביולוגית עם זרימה למינרית Class 2	ציוד	Thermo Fisher Scientific, Inc.	1200	או שווה ערך
מבחנה קונית 50 mL	ציוד	VWR international	47747-182	או שווה ערך
1X PBS (ללא Ca/Mg)	ריאגנט	Hyclone	SH30028.02	או שווה ערך
Ficoll-paque PLUS	ריאגנט	GE Healthcare	17-1440-03	עטוף בנייר אלומיניום להגנה מאור
Pipet Aid XP	ציוד	Drummond Scientific	4-000-101	או שווה ערך
פיפט 10 mL	ציוד	Corning	CLS4492	או שווה ערך
מכלי Aerosolve	ציוד	Beckman Coulter Inc.	359481	עם מבטי 50 mL
צנטריפוגה	ציוד	Beckman Coulter Inc.	GS-6R	או שווה ערך
פיפטות העברה	ציוד	Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific	202-20S	או שווה ערך
פיפטות פסטור	ציוד	VWR international	14672-200	או שווה ערך
בופר המוליטי	ריאגנט	N/A	N/A	8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA
טריפאן בלו (Trypan blue)	ריאגנט	Sigma-Aldrich	T6146	0.2% ב-PBS
המ ציטומטר	ציוד	VWR international	15170-208
מבחנה קונית 15 mL	ציוד	VWR international	05-527-90	או שווה ערך
בופר ריצה	ריאגנט	N/A	N/A	PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA
ערכה לבידוד תאי MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II	ריאגנט	Miltenyi Biotec	130-091-155	או שווה ערך
מגנט EasySep®	ציוד	Stem Cell Technologies	18000
מבחנת פוליפרופילן 5 mL	ציוד	Falcon BD	352063
RPMI 1640	ריאגנט	Invitrogen	22400-089	עם 25 mM HEPES
סרום אנושי מאוחד	ריאגנט	N/A	N/A	נשאב מתורמים בריאים, עבר אינאקטיבציה בחום וסינון
פנסט repression (Pen Strep)	ריאגנט	Invitrogen	1570-063	או שווה ערך
מסנן מכס בקבוק 500mL, 0.22 מיקרון	ציוד	Nalge Nunc international	595-3320	או שווה ערך
פלטה בעלת 48 בארות	ציוד	Costar	3548	או שווה ערך
אינקובטור 37°C CO2	ציוד	Sanyo	MCO-18AIC	או שווה ערך
פפטיד סינתטי 20 mg/mL	ריאגנט	N/A	N/A	סינתזה בהזמנה מכל ספק פפטידים
מבחנת FACS 5 mL	ציוד	Falcon BD	352008	פוליסטירן
טטראמר Class II טעון פפטיד (כמתואר)	ריאגנט	N/A	N/A	הוכן על ידי ה-BRI tetramer core
Anti-CD3	ריאגנט	BD Biosciences	347344	או שווה ערך
Anti-CD4	ריאגנט	eBioscience	17-0049-73	או שווה ערך
Anti-CD25	ריאגנט	eBioscience	11-0259-73	או שווה ערך
ציטומטר זרימה Facs Calibur	ציוד	BD Biosciences	342975	או שווה ערך